Fenylethanoïde glycosiden induceren apoptose in Eca-109-cellen via de mitochondriën-afhankelijke route

Invoering

Slokdarmkanker is een van de meest voorkomende soorten kanker met het 11e hoogste morbiditeitscijfer en het 6e hoogste sterftecijfer wereldwijd, en veroorzaakte in 2015 ~439.000 sterfgevallen. De incidentie van slokdarmkanker varieert aanzienlijk tussen de verschillende regio's, waarbij oosterse Azië en Oost- en Zuid-Afrika vertoonden de hoogste incidentiecijfers en West-Afrika vertoonde de laagste cijfers in 2012. In China bedroegen de geschatte gevallen en sterfgevallen van slokdarmkanker respectievelijk 477,000 en 375,000. , in 2015. Hoewel het morbiditeitspercentage van slokdarmkanker tussen 2005 en 2015 is afgenomen in landen met een midden- en hoog-midden sociodemografische index, blijft het sterftecijfer hoog vanwege de slechte prognose. De combinatie van chirurgische resectie met chemotherapie of radiotherapie is gebruikt om slokdarmkanker te behandelen, maar er is gemeld dat tussen 2003 en 2014 het 5-jaaroverlevingspercentage bleef bestaan<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyheeft dat aangetoondCistanche tubulosa fenylethanoïde glycosiden(CTPG) zou de groei van melanoom B16-F10-cellen in vitro en in vivo kunnen onderdrukken (24). De slechte wateroplosbaarheid van eerder gebruikte CTPG beperkt echter de ontwikkeling van geneesmiddelen. Daarom werd wateroplosbaar CTPG (CTPG-W) gebruikt en werd het antitumoreffect op slokdarmkankercellen (Eca-109) onderzocht. Er werd vastgesteld dat CTPG-W dosisafhankelijk de levensvatbaarheid van Eca-109-cellen zou kunnen remmen door de inductie van apoptose via een mitochondriaal-afhankelijke route.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialen en methoden

Dieren.

Vrouwelijke C57BL/6-muizen (6-8 weken, ~25 g) werden gekocht bij het Beijing Laboratory Animal Research Center (Beijing, China) en gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde (25˚C), lichtcyclische (12/5 12) Dierenfaciliteit van de Xinjiang Universiteit (Urumqi, China). Alle dieren kregen pathogeenvrij water en voer.

Cellijn en cultuur.

De menselijke slokdarmcarcinoomcellijn (Eca-109) werd bewaard door het Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, China) en gekweekt in RPMI{{1} } medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, VS) aangevuld met 10% door hitte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -glutamine (100 mM), 100 U/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine bij 37˚C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 bevat.

Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC).

CTPG-W (cat.nr. SGJG20170410) is gekocht bij Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China). De belangrijkste verbindingen van CTPG werden gekwalificeerd en gekwantificeerd door middel van HPLC volgens onze vorige studie (24). In het kort werd HPLC uitgevoerd op een ZORBAX SB-C18-kolom (250 x 4,6 mm; 5 µm) bij 30 °C en geëlueerd met 0,2% mierenzuuroplossing en een methanolgradiënt beginnend bij 23%, waarbij elke minuut 1 ml werd toegevoegd. gedurende 45 minuten tot 31% wordt bereikt. Er werd in totaal 10 µl monster geïnjecteerd en gedetecteerd bij 330 nm. De echinacosidestandaard werd gekocht bij Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) en de acteosidestandaard werd gekocht bij Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). De standaarden werden gebruikt om de componenten van CTPG-W te analyseren.

MTT-test.

Celproliferatie werd gemeten met een MTT-test. Eca{{0}} cellen werden geïnoculeerd in 96-putjesplaten met een dichtheid van 5x103 cellen in 100 µl RPMI{{5 }} medium/putje en 24 uur gekweekt bij 37˚C, vervolgens behandeld met verschillende concentraties (0, 200, 400, 600 en 800 µg/ml) CTPG-W of 0,4% dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 24 uur 48 en 72 uur. DMSO werd gebruikt als oplosmiddelcontrole (800 µg/ml CTPG-W dat 0,4% DMSO bevatte). Cisplatine (20 µg/ml) werd als positieve controle gebruikt. Vervolgens werd het supernatant weggegooid na 5 minuten centrifugeren bij 225 xg bij kamertemperatuur en werd 100 µl MTT-oplossing (0,5 mg/ml in RPMI-1640 medium zonder FBS) aan elk putje toegevoegd en gedurende 3 minuten bij 37 °C geïncubeerd. H. De gevormde formazankristallen werden opgelost in 200 µl DMSO. De waarden voor de optische dichtheid (OD) werden gemeten bij een golflengte van 490 nm door een microplaatlezer met 96-putjes (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, VS). De relatieve levensvatbaarheid van de cellen werd berekend volgens de formule: Levensvatbaarheid van de cellen (%)=(ODbehandeld/ODonbehandeld)x100%. De morfologie van Eca-109-cellen werd waargenomen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (vergroting, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

Voor de proliferatie van splenocyten werden C57BL/6-muizen geëuthanaseerd door cervicale dislocatie, en de milten werden geïsoleerd. De eencellige suspensie werd gemaakt en de splenocyten werden in 96-putjesplaten gezaaid met een dichtheid van 1x105 cellen/putje in 100 µl RPMI-1640 medium, en vervolgens behandeld met verschillende concentraties (0, 200, 400, 600 en 800 µg/ml) CTPG-W gedurende 24, 48 en 72 uur bij 37˚C met 5% CO2. De proliferatie van splenocyten werd gemeten met behulp van een MTT-test, volgens het bovengenoemde protocol. Stimulerende index=ODbehandeld/ODonbehandeld.

Meting van apoptose en de celcyclus. Eca{0}}-cellen werden gedurende 24 uur gekweekt in schalen van 60 mm met een dichtheid van 2,5x105 cellen/schaaltje en behandeld met verschillende concentraties ({{31} }, 200, 400, 600 en 800 µg/ml) CTPG-W of 0,4% DMSO gedurende 24 uur bij 37˚C met 5% CO2. Cellen werden verzameld en gekleurd met een Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) / Propidiumjodide (PI) Apoptosedetectiekit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), volgens de protocollen van de fabrikant. Monsters werden verzameld door flowcytometrie (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS) en geanalyseerd door FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, VS). Om het effect van CTPG-W op de celcyclus te analyseren, werden 2,5x105 Eca-109-cellen gezaaid in kweekschalen van 60 mm en behandeld met CTPG-W (0, 100, 200 en 400 µg/ml) of 0,4 % DMSO gedurende 24 uur bij 37˚C met 5% CO2. Alle cellen werden geoogst en tweemaal gewassen met ijskoude PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), vervolgens 30 minuten bij 4 °C gefixeerd in 70% ijskoude ethanol. Na tweemaal wassen met ijskoude PBS werden de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geresuspendeerd in 300 µl PI/RNase-kleuringsbuffer (BD Biosciences, San Jose, CA, VS). De celcyclusverdeling werd geanalyseerd met de ModFit LT 3.0-software door middel van flowcytometrie (BD FACSCalibur).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSAAnti-vermoeidheidBescherm lever PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analyse van het mitochondriale membraanpotentieel (Δψm) en reactieve zuurstofsoorten (ROS).Om de Δψm te analyseren, werden Eca{0}}-cellen behandeld met CTPG-W (0, 400, 600 en 800 µg/ml) of 0,4% DMSO voor 24 uur bij 37˚C met 5% CO2, en gekleurd met de Mitochondriale membraanpotentiaaltestkit met JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), volgens het protocol van de fabrikant, gedurende 20 minuten bij 37˚ C. Na tweemaal wassen met JC-1 wasbuffer (Beyotime Institute of Biotechnology), werden de monsters opnieuw gesuspendeerd met 300 µl JC-1 wasbuffer en geanalyseerd met flowcytometrie (BD FACSCalibur). De fluorescentie van JC-1-kleurstof in Eca-109-cellen werd ook waargenomen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (vergroting, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Voor analyse van ROS werden Eca-109-cellen behandeld met CTPG-W (0, 400, 600 en 800 µg/ml) gedurende 2, 4, 6, 12 en 24 uur, en gekleurd met Reactive Oxygen Species Assay kit (Beyotime Institute of Biotechnology), volgens het protocol van de fabrikant, gedurende 20 minuten bij 37˚C. Na drie keer wassen met ijskoude PBS werden monsters verzameld met behulp van flowcytometrie (BD FACSCalibur) en geanalyseerd met FlowJo 7.6-software.

Figuur 1. De gekwalificeerde controle van CTPG-W. De componenten van CTPG-W werden kwalitatief en kwantitatief geanalyseerd door middel van krachtige vloeistofchromatografie en vergeleken met de normen van echinacoside en acteoside. CTPG-W, in water oplosbare fenylethanoïdeglycosiden vanC. Tubulous.

2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicalenvangende activiteit. De vrije radicalen wegvangende activiteit van CTPG-W werd bepaald met een DPPH-vrije radicalentest volgens het gepubliceerde protocol met een kleine wijziging, aangezien methanol werd vervangen door ethanol om DPPH op te lossen (25,26). Voor steady-state-metingen werd 150 µl DPPH (100 mmol/l) in ethanol gemengd met verschillende concentraties CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 en 600 µg/ml) in 50 µl PBS, en 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. De absorptie bij 517 nm werd gedetecteerd in de aanwezigheid en afwezigheid van CTPG-W. Er werd in totaal 50 µl vitamine C als positieve controle gebruikt. De radicale wegvangende activiteit van DPPH werd berekend met behulp van de formule: Opvangen (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, waarbij Ablank de absorptie van de controle is (zonder DPPH), Asample is de absorptie van het monster en A0 is de absorptie van PBS met DPPH.

Western blot-analyse. Eca{0}} cellen werden behandeld met CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) of 0,4% DMSO gedurende 24 uur bij 37˚C met 5% CO2. De volgende twee keer wassen met PBS, cellen 

Figuur 2. Het effect van CTPG-W op de groei van Eca-109-cellen en splenocyten. (A) Eca-109-cellen werden gedurende 24, 48 en 72 uur behandeld met verschillende concentraties CTPG-W, en vervolgens werd de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd met een MTT-test. (B) De morfologische veranderingen van Eca-109-cellen na CTPG-W-behandeling na 24 uur. (C) Splenocyten van C57BL/6-muizen werden gedurende 24, 48 en 72 uur behandeld met verschillende concentraties CTPG-W, en vervolgens werd de proliferatie geanalyseerd met een MTT-test.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulous.

werden gedurende 20 minuten op ijs gelyseerd in Radioimmunoprecipitatie Assay Lysisbuffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China). Na centrifugatie bij 10,000 xg gedurende 10 minuten bij 4˚C werden de supernatanten verzameld en werden eiwitconcentraties gedetecteerd met een bicinchoninezuurkit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) volgens de protocollen van de fabrikant. Western blot-analyse werd uitgevoerd volgens onze eerdere beschrijving (24). De antilichamen tegen caspase-7 (cat.nr. D120077), caspase-8 (cat.nr. D155240), caspase-9 (cat.nr. D220078), B-cellymfoom{ {13}} (Bcl-2)-geassocieerde X (Bax) (cat.nr. D220073) en Bcl-2 (cat.nr. D260117), en anti-muis IgG-mierikswortelperoxidase (HRP ) (cat. nr. D111050) en anti-konijn IgG-HRP (cat. nr. D110058) werden gekocht bij BBI Life Sciences (Shanghai, China). De antilichamen tegen caspase-3 (cat.nr. E-AB-10050) en actieve caspase-3 (cat.nr. E-AB-22115) zijn gekocht bij Elabscience ( Wuhan, China). Andere antilichamen tegen caspase-7 (cat. nr. 9492), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (cat. nr. 9542), cytochroom c (cat. nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminale kinase (JNK) (cat. nr. 9252S) en -actine (cat. nr. 58169) werden verkregen van Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, VS). Alle primaire en secundaire antilichamen werden verdund in een verhouding van 1:1,000. De primaire antilichamen werden een nacht bij 4°C geïncubeerd en de secundaire antilichamen werden gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd.

Figuur 3. De apoptose van Eca-109-cellen geïnduceerd door CTPG-W. Cellen werden 24 uur behandeld met verschillende concentraties CTPG-W. (A) De apoptotische en necrotische Eca-109-cellen werden geanalyseerd met flowcytometrie. Het bovenste paneel toont de individuele puntplots en het onderste paneel toont de samenvattende gegevens. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulous.

De doeleiwitten werden gedetecteerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentietestkit (Beyotime Institute of Biotechnology), volgens het protocol van de fabrikant.

Statistische analyse. De statistische significantie werd berekend door middel van eenzijdige variantieanalyse met de post-hoc-test van Tukey en de resultaten werden geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism 5.0-software (GraphPad Software, La Jolla, CA, VS) onder de behandelings- en controlegroepen. Alle gegevens werden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANCHE TUBULOSA-EXTRACT VOOR HET VERBETEREN VAN DE NIERFUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Resultaten

CTPG-W onderdrukt de groei van Eca-109-cellen.

De componenten van CTPG-W werden gekwalificeerd en gekwantificeerd door middel van HPLC (Fig. 1), die werden vergeleken met de standaarden van echinacoside en acteoside. Volgens de piekretentietijden en de piekoppervlakken bevatte CTPG-W 39,16% echinacoside en 2,44% acteoside. Ten eerste werd het effect van CTPG-W op de levensvatbaarheid van Eca-109-cellen bepaald met een MTT-test. CTPG-W werd opgelost in DMSO bij 200 mg/ml en verdund met RPMI-1640 medium dat 10% door hitte geïnactiveerde FBS bevatte tot de aangegeven concentraties. Eca-109-cellen werden behandeld met CTPG-W en de levensvatbaarheid van de cellen werd op de aangegeven tijdstippen geanalyseerd met een MTT-test. CTPG-W-behandeling verminderde de levensvatbaarheid van Eca-109-cellen aanzienlijk op een dosis- en tijdsafhankelijke manier (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figuur 4. Het effect van CTPG-W op de celcyclusverdeling in Eca-109-cellen. Verschillende concentraties CTPG-W werden gebruikt om Eca-109-cellen gedurende 24 uur te behandelen en de verdeling van de celcyclus werd geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulous.

CTPG-W induceert apoptose in Eca-109-cellen. Om te onderzoeken of CTPG-W de groei van Eca-109-cellen onderdrukte door de inductie van apoptose of necrose, werden cellen behandeld met verschillende concentraties CTPG-W. Na 24 uur werden de apoptose en necrose van Eca-109-cellen gedetecteerd met Annexine V/PI-kleuring. Zoals weergegeven in Fig. 3A werden Annexine V-/PI+-cellen gepoort als necrotische cellen, en werden Annexine V+/PI+- en Annexine V+/PI--cellen gepoort als apoptotische cellen. CTPG-W induceerde voornamelijk de apoptose van Eca-109-cellen op een dosisafhankelijke manier, hoewel de necrotische Eca-109-cellen ook significant toenamen onder de behandeling van 600 en 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W induceert celcyclusstilstand in de S-fase in Eca-109-cellen. Verstoring van de kankercelcyclus zal de celgroei onderdrukken en apoptose bevorderen (27). De verdeling van de celcyclus in Eca-109-cellen werd gedetecteerd met PI-kleuring na CTPG-W-behandeling gedurende 24 uur. Er werd waargenomen dat cellen in de S-fase toenamen en cellen in de G0/G1-fasen een algehele significante afname vertoonden na CTPG-W-behandeling (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W verlaagt Δψm en induceert de afgifte van cytochroom c. Apoptose kan worden geïnduceerd door een mitochondriaal-afhankelijke route (28,29). De pro- en anti-apoptotische leden van de BCL-2-eiwitfamilie vervullen een belangrijke rol bij de regulatie van de integriteit van het mitochondriale membraan (30,31). Na CTPG-W-behandeling gedurende 24 uur werd de Δψm beoordeeld met behulp van JC-1-kleuring. JC‑1-aggregaat (rode fluorescentie gedetecteerd in FL‑2) zal uiteenvallen in monomeer (groene fluorescentie gedetecteerd in FL-1) wanneer Δψm afneemt (32). Zoals weergegeven in figuur 5A namen de frequenties van FL-1+ FL-2-/+ cellen significant toe op een dosisafhankelijke manier, wat aangeeft dat de Δψm van Eca-109 cellen afnam. De fluorescentieveranderingen in Eca-109-cellen werden ook waargenomen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Fig. 5B). Met de toenemende concentraties CTPG-W nam de rode fluorescentie af en de groene fluorescentie toe, wat consistent is met de gegevens van flowcytometrie. Er werd ook waargenomen dat het niveau van cytochroom c in het cytosol aanzienlijk was verhoogd (Fig. 5C), wat een resultaat is van een reductie van Δψm. Dit versterkt de conclusie getrokken uit het verhoogde aantal FL-1+ FL-2-/+ cellen waarvan Δψm afnam als resultaat van CTPG-W-behandeling. Er is gerapporteerd dat JNK de activering van de BCL-2-eiwitfamilie kan reguleren, wat de afgifte van cytochroom c (33-35) veroorzaakt. Er werd ook vastgesteld dat het niveau van JNK aanzienlijk werd opgereguleerd na CTPG-W-behandeling (Fig. 5C). De resultaten gaven aan dat CTPG-W de apoptose van Eca-109-cellen kan induceren via een mitochondriaal-afhankelijke route.

Figuur 5. De reductie van Δψm en opregulatie van cytochroom c en JNK. Eca-109-cellen werden 24 uur behandeld met verschillende concentraties CTPG-W. (A) Δψm werd gedetecteerd door JC-1-kleuring en monsters werden geanalyseerd met flowcytometrie. De individuele puntdiagrammen geven de veranderingen in JC-1-fluorescentie weer. De frequenties van FL-1+ FL-2-/+ cellen worden weergegeven in het onderste paneel. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figuur 6. De niveaus van ROS in Eca-109-cellen na CTPG-W-behandeling en de antioxiderende activiteit van CTPG-W. (A) Eca-109-cellen werden behandeld met verschillende concentraties CTPG-W en de niveaus van ROS werden op aangegeven tijdstippen geanalyseerd met flowcytometrie. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Het effect van CTPG-W op de intracellulaire ROS-generatie.ROS zou Δψm kunnen verminderen om apoptose te induceren (36). Om te onderzoeken of CTPG-W de ROS-productie kan verhogen, werden Eca-109-cellen behandeld met verschillende concentraties CTPG-W. Cellen werden op de aangegeven tijdstippen verzameld en gekleurd met DCFH-DA. De productie van intracellulaire ROS in Eca-109-cellen werd bepaald door flowcytometrie. Zoals weergegeven in figuur 6A verhoogde 800 µg/ml CTPG-W de ROS-productie significant vanaf 2-6 uur, en daalde deze vanaf 12-24 uur. Bovendien verhoogde 400 µg/ml CTPG‑W de ROS-productie aanzienlijk vanaf 12-24 uur. Bovendien veranderde 200 µg/ml CTPG-W de ROS-productie niet noemenswaardig. De dynamische veranderingen in de ROS-productie kunnen in verband worden gebracht met apoptose van Eca-109-cellen. Er werd ook vastgesteld dat CTPG-W vrije radicalen wegvangende activiteit had (Fig. 6B), wat geassocieerd kan zijn met de verminderde ROS-productie in Eca-109-cellen die na 12 uur met 800 µg/ml CTPG-W werden behandeld.

Figuur 7. De niveaus van gesplitste caspasen en gesplitste PARP na CTPG-W-behandeling. Eiwitten werden geïsoleerd uit Eca-109-cellen die 24 uur met CTPG-W waren behandeld en de niveaus van gesplitste caspasen en gesplitste PARP werden gedetecteerd met Western-blot-analyse. DMSO, dimethylsulfoxide; CTPG-W, in water oplosbare fenylethanoïdeglycosiden vanC. Tubulous; PARP, poly(ADP-ribose)polymerase.

CTPG-W reguleert de activiteit van caspase-3, caspase-7, caspase-9 en PARP. De afgifte van cytochroom c als gevolg van Δψm-reductie zou de caspase-proteasen kunnen activeren om apoptose te induceren (29,30,37). Na CTPG-W-behandeling gedurende 24 uur werd de activering van caspase-3, 7, 8, 9 en PARP gedetecteerd door Western-blot-analyse. Vergeleken met de controle zijn de niveaus van gesplitst-caspase-9, gesplitst-caspase-7, gesplitst-caspase-3 en gesplitst-PARP, maar niet de niveaus van gesplitst-caspase{{20 }}, werden op dosisafhankelijke wijze opgereguleerd door CTPG-behandeling (Fig. 7). Deze resultaten gaven aan dat CTPG-W Δψm verlaagde en de afgifte van cytochroom c bevorderde om caspasen te activeren die de apoptose van Eca-109-cellen induceren.

Discussie

Traditionele CHM zou apoptose van slokdarmkankercellen kunnen induceren via verschillende routes, waaronder de extrinsieke doodsreceptor en intrinsieke mitochondriale en endoplasmatische reticulum-stressroutes (29). Onze eerdere studie heeft aangetoond dat CTPG, als de belangrijkste component van C. tubulosa, de groei van melanoom B16-F10-cellen remde door de inductie van apoptose via een mitochondriaal-afhankelijke route (24). In de huidige studie werd het antitumoreffect van CTPG-W op Eca-109-cellen onderzocht en werd vastgesteld dat CTPG-W de groei van Eca-109-cellen onderdrukte, apoptose induceerde en de celcyclus stopte, verminderde Δψm, verhoogde de afgifte van cytochroom c en geactiveerde caspasen. CTPG en CTPG-W zouden apoptose en celcyclusstilstand in kankercellen kunnen veroorzaken. De nauwkeurige mechanismen zijn echter verschillend vanwege de verschillende componenten van CTPG (26,64% echinacoside, 10,19% acteoside en 1,71% isoacteoside) en CTPG-W (39,16% echinacoside en 2,44% acteoside). CTPG arresteerde B16-F10-cellen in de G0/G1-fasen, maar CTPG-W arresteerde Eca-109-cellen in de S-fase (24). De ROS-productie werd dosisafhankelijk verhoogd door CTPG, maar het duidde op een tijdsafhankelijke verandering door een hoge dosis CTPG-W, die aanzienlijk toenam aan het begin van de CTPG-W-behandeling (2-6 uur) en nam significant af na 12 uur, vergeleken met de controle. Een mogelijke reden is dat het belangrijkste bestanddeel van CTPG-W echinacoside is. Verschillende onderzoeken meldden dat echinacoside de ROS-productie en door ROS geïnduceerde apoptose zou kunnen remmen om zijn neuroprotectieve en anti-verouderingseffecten uit te oefenen (38-40). Op dezelfde manier werd in het huidige onderzoek de vrije radicalen wegvangende activiteit waargenomen. Daarom werd gespeculeerd dat sommige componenten, waaronder verbascoside, iso-verbascoside en salidroside in een hoge dosis CTPG-W, onmiddellijk de vorming van ROS zouden kunnen induceren om apoptose van Eca-109-cellen te veroorzaken (41,42), en vervolgens ROS werd weggevangen door EchiNacoside. Een andere mogelijke reden voor de verschillen in ROS-productie door CTPG en CTPG-W is dat er in dit onderzoek en in het vorige onderzoek verschillende cellijnen werden gebruikt (24). Dong et al (43) rapporteerden dat echinacoside de apoptose van menselijke SW480 colorectale kankercellen zou kunnen induceren door het genereren van oxidatieve DNA-schade zonder verhoogde ROS-niveaus.

CTPG-W-behandeling verminderde Δψm en veroorzaakte de afgifte van cytochroom c, dat de splitsing van caspase bevordert-9 (28). Consequent werden de niveaus van gesplitste caspase-9 opgereguleerd door CTPG-W-behandeling. Vervolgens kan de actieve caspase-9 caspase-3 activeren om apoptose te induceren (44). De niveaus van gesplitste caspase-3 werden ook opgereguleerd door CTPG-W-behandeling. Caspase-8 werd echter niet geactiveerd door CTPG-W, wat aangeeft dat de extrinsieke doodsreceptorroute niet betrokken was bij de apoptose geïnduceerd door CTPG-W. Deze waarnemingen geven aan dat CTPG-W apoptose van Eca-109-cellen induceert door de activering van een mitochondriaal-afhankelijke route.

PARP speelt een belangrijke rol bij de genomische stabiliteit en kan worden gesplitst door de actieve caspasen, met name caspase-3 en -7 (45). Er werd vastgesteld dat CTPG-W-behandeling caspase -3 en -7 activeerde, die PARP kunnen splitsen om DNA-reparatie te remmen en apoptose te veroorzaken.

CTPG-W onderdrukt ook dosis- en tijdsafhankelijk de groei van menselijke hepatocellulaire carcinoom BEL-7404-cellen (niet-gepubliceerde gegevens). Hoewel CTPG-W de groei van Eca-109- en BEL-7404-cellen remt, bevordert het de proliferatie van splenocyten, wat te wijten kan zijn aan het gehalte aan polysachariden (~50%) in CTPG-W (46 ). Op dezelfde manier hebben verschillende onderzoeken gemeld dat polysachariden de proliferatie van splenocyten kunnen bevorderen (46-49). In het muismodel werd vastgesteld dat CTPG-W de miltindex significant verhoogde, vergeleken met de controlegroep, maar geen invloed had op het lichaamsgewicht en de andere orgaanindexen, waaronder het hart, de lever, de nieren en de longen (niet-gepubliceerde gegevens). wat aangeeft dat CTPG-W geen cytotoxisch effect heeft op normale cellen.

Gezamenlijk gaven de gegevens aan dat CTPG-W de groei van Eca-109-cellen remt door inductie van apoptose via een mitochondriaal-afhankelijke route.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%