Phoenix Dactylifera L. Zaadextract vertoont antioxiderende effecten en verzwakt melanogenese

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 en Tsong-Min Chang2,*

Abstract:Achtergrond: Het werkingsmechanisme van Phoenix dactylifera-zaadextract in huidverzorging is nog nooit onderzocht. Methoden: P. dactylifera L. zaden werden geëxtraheerd door ultrasone extractie. De antioxiderende eigenschappen van het extract werden bepaald door 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) en 2,2′-azino-di-(3-ethylbenzthiazolinesulfonzuur) (ABTS plus ) analyses en opruimingsmethoden. Het totale fenolgehalte, reducerend vermogen, ijzer (II) ion-chelatie en intracellulaire reactieve zuurstofspecies (ROS)-wegvangende capaciteiten werden ook onderzocht. De effecten van P. dactylifera L.-zaadextract op melanogenese werden spectrofotometrisch geëvalueerd door een paddestoeltyrosinase-activiteitstest, bepaling van intracellulaire tyrosinase-activiteit en melaninegehalte. De expressieniveaus van melanogenese-gerelateerde eiwitten werden geanalyseerd door Western-blotting. Resultaten: Uit de resultaten bleek dat de P.dactylifera L.zaadextract oefende een duidelijke antioxidantcapaciteit uit en verminderde het intracellulaire ROS-gehalte significant bij concentraties van {{0}}.245 en 0.49 (mg/ml). Bovendien verminderde het extract de expressie van melanocortine 1-receptor (MC1R), microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (MITF), tyrosinase, tyrosinase-gerelateerd eiwit-1 (TRP1) en tyrosinase-gerelateerd eiwit-2 ( TRP2) en remde melanogenese in B16F10-cellen. Conclusies: Onze resultaten onthulden dat P. dactylifera L.-zaadextract de melanogenese in B16F10-cellen verzwakte door de signaalroutes van proteïnekinase A (PKA) neerwaarts te reguleren. Daarom zou het extract kunnen worden gebruikt als een soort huidbleekmiddel in huidverzorgingsproducten.

Sleutelwoorden: Phoenix dactylifera;tyrosinase; melanine; ROS; PKA

cistanche pharma specialis een soort huidbleekmiddel.

1. Inleiding

Antioxidanten zijn op grote schaal toegepast om oxidatieve stress-gerelateerde aandoeningen op cosmetisch en dermatologisch gebied te voorkomen of te behandelen. De laatste decennia worden antioxidanten ook gebruikt in de cosmetische industrie om huidveroudering te voorkomen of te vertragen. Er is gemeld dat vrije radicalen en reactieve zuurstofsoorten (ROS) geassocieerd zijn met verschillende ziekten, zoals veroudering en leeftijdsgerelateerde ziekten [1]. Interessant is dat schade door vrije radicalen op de huid veroorzaakt door UV-stralingsstress en ROS een belangrijke rol spelen in het proces van huidveroudering [2,3]. Van antioxidanten is gemeld dat ze het oxidatieproces verstoren door vrije radicalen en ROS op te vangen of door oxidatie-katalytische metalen te chelateren [4]. Daarom is er een dramatische toename van het aantal toepassingen van antioxidanten of antioxidante voedingssupplementen om oxidatieve stress of door oxidatieve stress veroorzaakte schade in het lichaam te verminderen [5,6]. Er is echter aangetoond dat sommige chemische antioxidanten, waaronder natriumascorbaat, tert-butylhydroxyanisol (BHA), natriumerythorbaat en tert-butylhydroxytolueen (BHT), kankerverwekkende effecten op de menselijke gezondheid bevorderen [7]. Daarom heeft de afgelopen decennia een snelle groei plaatsgevonden van onderzoeken naar van planten afgeleide natuurlijke antioxidanten. Belangrijk is dat werd gevonden dat een toename van het ROS-niveau de huidpigmentatie kan versnellen. Van de ROS die zijn afgeleid van melanocyten en keratinocyten, stimuleert stikstofmonoxide, NO, de melaninesynthese door de eiwitexpressieniveaus van tyrosinase en tyrosinase-gerelateerd eiwit 1 (TRP1) [8,9]. Het effect van ROS op de melanineproductie is onderzocht met behulp van verschillende antioxidanten, zoals N-acetylcysteïne, om de werking van door UVB geïnduceerd melanocytstimulerend hormoon (-MSH) [10] teniet te doen.

Melanine wordt geproduceerd en uitgescheiden door melanocyten die zijn verdeeld in de basale laag van de huidepidermis [11]. De eerste twee stappen van de melanogenese-route bij mensen zijn de hydroxylering van L-tyrosine tot 3-4-dihydroxyfenylalanine (L-DOPA) en de oxidatie van L-DOPA tot o-dopaquinon. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) is een snelheidsbeperkend enzym dat beide eerste twee reacties katalyseert tijdens melanogenese [12]. Melanine speelt een essentiële rol bij de bescherming van de huid tegen schade door ultraviolet (UV) zonlicht en is ook verantwoordelijk voor het kleuren van haar, huid en ogen. Er is gemeld dat verschillende dermatologische aandoeningen, zoals ouderdomsvlekken, melasma, post-inflammatoire melanoderma, sproeten en plaatsen van actinische schade, het gevolg zijn van de accumulatie van een overmatig niveau van epidermale melanine [13]. Remmers van melaninesynthese worden in toenemende mate toegepast in huidverzorgingsproducten voor de behandeling of preventie van hyperpigmenteerde huidaandoeningen [14,15]. Bovendien zijn antioxidanten, zoals arbutine of kojiczuur [16], gebruikt bij de behandeling van hyperpigmentatie [17]. Onlangs hebben cosmetica voor het bleken van de huid een groot deel van de cosmetische producten voor hun rekening genomen. Niet alleen vrouwen met een donkere huid, maar ook degenen die proberen om te gaan met donkere vlekken op hun huid als gevolg van UV-licht, zwangerschap of verhoogde leeftijd, maken op grote schaal gebruik van deze huidblekende producten.

Melanogenese wordt gereguleerd door meerdere factoren. Van tyrosinase-gerelateerd eiwit-1 (TRP1), microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) en tyrosinase-gerelateerd eiwit-2 (TRP2) werd bijvoorbeeld gerapporteerd dat ze de productie van melanine reguleren [18-20 ]. De melanocortine 1-receptor (MC1R) komt ook prominent voor in -MSH-geïnduceerde melaninesynthese [21]. Er zijn verschillende signaalroutes betrokken bij de productie van melanine. Van de verschillende signaalroutes die de melanineproductie reguleren, speelt cyclische AMP (cAMP)-gemedieerde proteïnekinase A (PKA)-activering een cruciale rol bij de regulatie van melanogenese [22]. In de cAM-PKA-signaleringsroute induceert cAMP de activering van PKA [23], gevolgd door fosforylering van cAMP-responselement-bindend eiwit (CREB). CREB is een intracellulaire transcriptiefactor die de expressie van het microphthalmia factor (MITF) gen stimuleert, wat belangrijk is bij melanogenese. MITF is een transcriptiefactor die bindt aan de promotorregio's van de melanogene genen tyrosinase, TRP1 en TRP2, waardoor hun expressie wordt gereguleerd [24,25]. Daarna neemt het intracellulaire melaninegehalte toe [26]. Er is gemeld dat -MSH de cAMP-niveaus verhoogt en gewoonlijk wordt toegepast om de fosforylering van CREB te activeren en vervolgens de MITF-eiwitniveaus te verhogen [27].

MITF-expressie wordt gereguleerd door verschillende signaalroutes. c-Jun N-terminaal kinase (JNK) en p38 mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MAPK) zijn betrokken bij de activering van MITF-expressie en de daaruit voortvloeiende verhoogde tyrosinase-expressie. Extracellulaire responsieve kinase (ERK) activeringssignalen verhogen ook de CREB-fosforylering en de daaropvolgende MITF-expressie, die de melaninesynthese moduleert [28,29]. Daarom werd gemeld dat verschillende huidbleekmiddelen de MITF-transcriptieactiviteit remmen door de eiwitexpressieniveaus van tyrosinase, TRP1 en TRP2 te verlagen door downregulatie van p38MAPK-gemedieerde MITF-fosforylering. Bovendien is beschreven dat de ERK-route betrokken is bij MITF-regulatie tijdens melanogenese [30,31]. Activering van ERK fosforyleert MITF, wat leidt tot afbraak van MITF, wat resulteert in een verlaging van het melaninegehalte [32,33].

Oxidatieve stress kan het gevolg zijn van ofwel overproductie van ROS of een verminderde antioxidantafweer [1]. De zoektocht naar en toepassingen van natuurlijke antioxidanten blijven in de focus van talrijke onderzoeksteams over de hele wereld. Onlangs is er een groeiende belangstelling voor onderzoek en ontwikkeling van fytochemicaliën, zoals natuurlijke antioxidanten en fenolverbindingen uit verschillende natuurlijke bronnen, die kunnen worden gebruikt als nutraceuticals, anti-aging cosmetica en geneesmiddelen [34]. Phoenix dactylifera L. is een van de belangrijkste fruitgewassen die in het Midden-Oosten en Noord-Afrika worden geproduceerd [35,36]. Eerdere studies hebben gemeld dat P. dactylifera L.-vruchten antioxiderende, vrije radicalen opruimende, antimicrobiële en ontstekingsremmende activiteiten vertonen [37,38]. De functionele effecten van P. dactylifera L. zijn niet alleen beperkt tot de vruchten zelf, maar ook tot hun zaden, die een soort bijproduct van de vruchten zijn [39,40]. Vanwege de antioxiderende eigenschappen kunnen P. dactylifera L.-zaadextracten dienen als een bron van antioxiderende stoffen die oxidatieve stress tegengaan [41–43]. Er zijn echter weinig studies uitgevoerd naar de toepassingen van P. dactylifera L.-zaden voor de ontwikkeling van cosmeceutische producten. Deze zaden worden meestal als afval weggegooid, maar hun betekenis als functioneel cosmetisch ingrediënt wordt hierin benadrukt. Tot op heden zijn er geen rapporten over het werkingsmechanisme van P. dactylifera L.-zaadextract op het gebied van huidverzorgingscosmetica of de effecten van het zaadextract op de melanineproductie. De focus van de huidige studie was om het potentieel van P. dactylifera L.-zaadextract als melanogeneseremmer voor de cosmetische industrie te bepalen.

De mechanismen die ten grondslag liggen aan de remmende effecten van P. dactylifera L.-zaadextract op melanogenese zijn nog niet onderzocht. Het doel van de huidige studie was om de antioxidantkenmerken en mogelijke werkingsmechanismen van P. dactylifera L.-zaadextract op melanogenese te onderzoeken door de MITF-transcriptieregulatoren en fosforylering van regulatoren van de MAPK- en PKA-signaleringsroutes te onderzoeken.

verse cistanche

2. materialen en methoden

2.1. Chemicaliën en reagentia

De chemische reagentia die in het onderzoek werden gebruikt, werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, VS). De antilichamen waren van Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, VS) en het ECL-reagens was van Millipore (Billerica, MA, VS).

2.2. Bereiding en extractie van P. dactylifera-zaadextract

Gedroogde P. dactylifera L.-vruchten werden geoogst in 2019 van traditionele winkels in Medina City, Saoedi-Arabië. De P. dactylifera L.-zaden werden volledig gewassen, blootgesteld aan zonlicht, een dag aan de lucht gedroogd en vervolgens 2 uur gedroogd bij 80 ◦C in een oven. De gedehydrateerde zaden werden verpulverd tot een fijn poeder (#50 mesh) met een toegewijde molen (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, Type ZM1, Haan, Duitsland). Het poeder werd opgevangen in een afgesloten glazen fles en tot gebruik bewaard bij 25°C. Verpulverd gedroogd P. dactylifera L.-zaadpoeder (2 g) werd in een extractiebeker geplaatst die 10 ml gedestilleerd water bevatte. Vervolgens werd ultrasone extractie uitgevoerd met het ULTRAsonikTM 57H-model (250 W, C en A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, VS). De werkfrequentie was gedurende 30 minuten 45 kHz. Na extractie werden de monsters gecentrifugeerd bij 4500 rpm gedurende 50 minuten bij 25°C met een Eppendorf Centrifuge 5810 R (Hamburg, Duitsland). De supernatanten werden verzameld en gefiltreerd met een nylonfilter (poriegrootte: 0,45 m) en het filtraat werd geconcentreerd tot 9,8 mg/ml.

2.3. Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC) Analyse van P. dactylifera-zaadextract en ferulinezuur

Het P. dactylifera-zaadextract werd geanalyseerd met behulp van een ACQUITY UPLC H-klasse met een fotodiode-arraydetector (Waters, Milford, MA, VS). De kolom was een ACQUITY UPLC BEH C18-kolom, 130 A, 1,7 m, 2,1 mm x 100 mm. Mobiele fase A was 0,5 procent azijnzuur en mobiele fase B was acetonitril. Voor tijdstippen 0 en 5 min was de procentuele verhouding van A/B 95/5; gedurende 20 min was de procentuele verhouding van A/B 5/95; voor tijdstippen 21 en 25 min was de procentuele verhouding van A/B 95/5. Als positieve standaard werd ferulinezuur (1 ppm) gebruikt.

2.4. DPPH-opruimingsactiviteitsassay

In deze test werden vitamine C ({{0}},5 mg/ml) en BHA (0,1 mg/ml) gebruikt als antioxidantstandaarden. Het P. dactylifera L.-zaadextract in verschillende concentraties (0.0049, 0,0245 en 0,049 mg/ml) werd toegevoegd aan 2,9 ml DPPH (60 M) oplossing. Antioxidantcomponenten in het zaadextract kunnen waterstof afstaan ​​aan DPPH en DPPH omzetten in de gereduceerde vorm. De resulterende afname in absorptie bij 517 nm werd geregistreerd met een UV-Vis-spectrofotometer [44].

2.5. ABTS plus opruimingscapaciteitstest

De ABTS plus-scavenging-capaciteit van P. dactylifera L.-zaadextract werd vergeleken met die van vitamine C ({{0}},9 mg/mL) en BHA ({{10}}. 9mg/ml). Voor deze test werd ABTS plus gebruikt. Kation werd eerst geproduceerd door de oplossing van ABTS (7 mM) te laten reageren met kaliumpersulfaat (2,45 mM), en het mengsel liet men voor gebruik ten minste 6 uur in het donker staan. De absorptie bij 734 nm werd gemeten 10 min na mengen van verschillende concentraties van het zaadextract (0,0098, 0,049 en 0,098 mg/ml) met 1 ml ABTS plus-oplossing [45].

2.6. Bepaling van het totale fenolgehalte

Het totale fenolgehalte werd bepaald met behulp van het Folin-Ciocalteu-reagens [46] en galluszuur (2 ug / ml) werd als een positieve standaard gebruikt. Verschillende concentraties van P. dactylifera L.-zaadextract (0.0196, 0.098 en 0,196 mg/ml) werden bereid in 80 procent methanol; 100 L extract werd overgebracht in een reageerbuis en 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (eerder 10-voudig verdund met gedeïoniseerd water) werd toegevoegd en gemengd. Men liet het mengsel 5 min bij kamertemperatuur staan; 1,5 ml 20% natriumcarbonaat werd toegevoegd. Na 2 uur bij kamertemperatuur te hebben gestaan, werd de absorptie afgelezen bij 760 nm met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer.

2.7. Bepaling van het verminderen van capaciteit

Vitamine C ({{0}}.008 mg/ml) of BHA (4,8 mg/ml) werden gebruikt als positieve standaarden in deze test. Het reducerend vermogen van het zaadextract werd bepaald volgens de methode beschreven door Oyaizu [47]. Verschillende concentraties P. dactylifera L.-zaadextract (0.0073, 0,036, 0,073 mg/ml) werden gemengd met fosfaatbuffer (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6 ) en kaliumferricyanide [K3Fe (CN)6] (2,5 ml, 1 procent w/v). Het mengsel werd gedurende 20 minuten bij 50°C geïncubeerd. Trichloorazijnzuur (2,5 ml, 10% w/v) werd aan het mengsel toegevoegd, dat vervolgens gedurende 10 minuten bij 1000 x g werd gecentrifugeerd. De bovenste laag van de oplossing (2,5 ml) werd gemengd met gedestilleerd water (2,5 ml) en FeCl3 (0,5 ml, 0,1 procent w/v), en de absorptie bij 700 nm werd gemeten.

2.8. Meting van ijzer (II) ionenchelaatcapaciteit

Voor het meten van het Fe2 plus -ion chelerend vermogen van P. dactylifera L. zaadextract, EDTA (0.02, 0.04, en { {10}}.08 mg/ml) werd als positieve standaard gebruikt. Verschillende concentraties van het zaadextract (0,0196, 0,098 en 0,196 mg/ml) werden toegevoegd aan een FeCl2-oplossing (0,05 ml, 1 mM). Het reactiemengsel werd omgezet met ferrozine (0,1 ml, 1 mM), vervolgens werd het mengsel gekwantificeerd tot 1 ml met methanol en gedurende 10 minuten bij 25°C geïncubeerd. De absorptie van het reactiemengsel werd gemeten bij 562 nm [48].

2.9. Cel levensvatbaarheidstest

De cellevensvatbaarheidstest werd uitgevoerd met behulp van de MTT-methode [49]. De cellen werden gedurende 24 uur bij 37 ◦C blootgesteld aan verschillende concentraties P. dactylifera L.-zaadextract (0.049, 0.245 en 0.49 mg/ml). en 5 procent CO2 in een bevochtigde incubator en de MTT-oplossing werd aan de putjes toegevoegd. Het onoplosbare derivaat van MTT werd opgelost met ethanol-DMSO (1:1 mengseloplossing). De absorptie van de putjes bij 570 nm werd gemeten met behulp van een microplaatlezer. B16F10-cellen (BCRC60031) werden verkregen van het Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu City, Taiwan. De cellen werden bewaard in DMEM (Hyclone, Logan, UT, VS) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum en 1 procent antibiotica. Bovendien werd het effect van P. dactylifera L.-zaad op de levensvatbaarheid van B16F10-cellen ook geëvalueerd met de trypan-blauw-exclusietestmethode. Na behandeling met het zaadextract werden de cellen getrypsiniseerd en gecentrifugeerd om de pellet te verzamelen. De celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in 300 L DMEM-celkweekmedia. Een kleine hoeveelheid celsuspensie (20 L) werd voorzichtig gemengd met 10 μL trypanblauw (4 procent in PBS). Het aantal cellen werd geteld (niet-levensvatbare cellen waren blauw en levensvatbare cellen ongekleurd) met behulp van een hemocytometer onder de microscoop.

2.10. Meting van de activiteit van paddestoeltyrosinase

De paddenstoeltyrosinase-oplossing (10 μL, 200 eenheden) werd toegevoegd aan een microtiterplaat met 96-wells. Het reactiemengsel bevatte 5 mM L-DOPA opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (50 mM, pH 6,8) en P. dactylifera L. zaadextract (0 0,049, 0,245 en 0,49 mg/ml), kojiczuur (200 mM; 0,03 mg/ml) of arbutine (2 mM; 0,54 mg/ml). Het testmengsel werd gedurende 30 minuten bij 37 C geïncubeerd en de absorptie van het geproduceerde dopachroom werd gemeten bij 490 nm. Meting van de tyrosinase-activiteit van paddenstoelen werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [50].

2.11. Bepaling van het melaninegehalte

De B16F10-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met -MSH (100 nM) en vervolgens behandeld met ofwel P. dactylifera L.-zaadextract (0,0245–0,147 mg/ml) of arbutine (0,54 mg/ml) gedurende nog eens 24 uur. Na behandeling werden de celpellets gedurende 60 minuten bij 60 C opgelost in NaOH-oplossing (1 N). Het melaninegehalte werd gedetecteerd bij 405 nm, zoals eerder beschreven door Tsuboi [51].

Cistanche remt de melanineproductie.

2.12. Meting van intracellulaire tyrosinase-activiteit

Intracellulaire tyrosinase-activiteit werd bepaald zoals eerder beschreven [52]. De cellen werden 24 uur behandeld met -MSH (100 nM) en daarna met P. dactylifera L. zaadextract (0.0245–0,147 mg /mL) of arbutine (0,54 mg/mL) gedurende 24 uur. Na behandeling werden de celextracten (100 L) gemengd met vers bereide L-DOPA-oplossing (0,1 procent in PBS) en bij 37 ◦C geïncubeerd en werd de absorptie bij 490 nm gemeten.

2.13. Western Blotting-experiment

De cellen werden behandeld met P. dactylifera L.-zaadextract ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 en 0.147 mg/ml) of arbutine (0,54 mg/ml) en vervolgens gelyseerd in PBS met nondiet P-40 (1 procent), natriumdeoxycholaat (0,5 procent), natriumdodecyl sulfaat (SDS, 0,1 procent), aprotinine (5 ug/ml), fenylmethylsulfonylfluoride (100 ug/ml), pepstatine A (1 ug/ml) en EDTA (1 mM) bij 4 C gedurende 20 minuten. Totale lysaten werden gekwantificeerd met behulp van een micro BCA-kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). Eiwitten (30 ug) werden gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese en elektroforetisch overgebracht naar een polyvinylideenfluoridemembraan. Het membraan werd geblokkeerd in 5 procent vetvrije melk in PBST (PBS met 0,05 procent Tween-20) en een nacht bij 4 ◦C geïncubeerd met de volgende primaire antilichamen verdund in PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tyrosinase Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500), en CERB Ab (1:200), allemaal van Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, VS)). De gebonden antilichamen werden gedetecteerd door met mierikswortelperoxidase geconjugeerd secundair antilichaam (Amersham Corp.) gevolgd door ECL-detectiesysteem (Amersham) volgens de instructies van de fabrikant.

2.14. PKA-remmertest

De cellen werden gedurende 24 uur behandeld met -MSH (1 0 0 nM), gevolgd door een toevoeging van 1 uur van 10 M PKA-regulator H89. Na behandeling werden P. dactylifera L.-zaadextract (0,147 mg/ml) en H89 aan de cellen toegevoegd en nog eens 23 uur geïncubeerd. Het melaninegehalte werd bepaald zoals hierboven beschreven.

2.15. Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Tukey's post-hoctest, die werd gebruikt voor vergelijkingen van gemeten gegevens, met behulp van het Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versie 22.0 statistische software (SPSS Inc., Chicago, IL, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). * p < 0.05="" werd="" als="" significant="" beschouwd,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Resultaten

3.1. UPLC-analyse van P. dactylifera L. zaadextract

De UPLC-analyseresultaten worden weergegeven in figuur 1A, B. Figuur 1A toont de overlappende piek van P. dactylifera L. zaadextract en ferulazuur bij 330 nm. Figuur 1B toont vergelijkbare scanspectra tussen 220 en 500 nm voor P. dactylifera L.-zaadextract en ferulazuur.

3.2. Antioxidantkenmerken van P. dactylifera L. Zaadextract

De antioxidantactiviteit van P. dactylifera L.-zaadextract in vitro onthulde de aanwezigheid van antioxidantpotentieel. In DPPH-assay, vitamine C ({{0}}.05 mM; 0,53 mg/ml) en tert-butylhydroxyanisol (BHA) (0 0,1 mg/ml) werden gebruikt als positieve antioxidantstandaarden. De DPPH-wegvangcapaciteit van het extract was 49,97 ± 2,9 procent, 81,36 ± 0,56 procent en 78,53 ± 3,83 procent van de controle voor de extractconcentraties van 0.0{{ 31}}49, 0,0245 en 0,049 (mg/ml), respectievelijk. Ter vergelijking: de opruimcapaciteiten van vitamine C en BHA waren respectievelijk 90,12 ± 0,31 procent en 90,44 ± 0,49 procent (Figuur 2A).

Dit ABTS-radicaalkation is blauw van kleur en is reactief ten opzichte van de meeste antioxidanten. Tijdens deze reactie wordt het blauwe ABTS-radicaalkation weer omgezet in zijn kleurloze neutrale vorm. De reactie werd spectrofotometrisch gevolgd. De ABTS plus wegvangende capaciteit van het extract was 5,69 ± 1,36 procent, 18,81 ± 0,68 procent en 66,82 ± 8,51 procent van de controle bij concentraties van 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 en 0,098 mg/ml respectievelijk. Daarentegen waren de ABTS plus-scavenging capaciteiten van vitamine C (0,9 mg/ml) en BHA (0,9 mg/ml) respectievelijk 95,52 ± 0,12 procent en 40,3 ± 0,83 procent. De resultaten in figuur 2B geven aan dat het zaadextract een significante hoeveelheid van het ABTS plus-radicaal wegvangt.

Om het totale fenolgehalte van het P. dactylifera L.-zaadextract te bepalen, werd galluszuur (2 ug/ml) als positieve standaard gebruikt. De resultaten in figuur 2C geven aan dat het totale fenolgehalte in 0.0196, 0.{{20}}98 en 0. 196 (mg/ml) van het extract waren respectievelijk 33,43 ± 2,33 procent, 117,22 ± 7,81 procent en 195,4 ± 10,91 procent. De galluszuurequivalenten (GAE) van de bovengenoemde concentraties van zaadextracten waren respectievelijk 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 en 0,642 ± 0,03 (Figuur 2C).

3.3. Remmende effecten van P. dactylifera L. zaadextract op melanogenese

De resultaten getoond in figuur 4A tonen aan dat 0.049 mg/mL P. dactylifera L. zaadextractoefende geen remmend effect uit op de tyrosinase-activiteit van paddenstoelen. Aan de andere kant waren de enzymremmingspercentages 8,34 ± 2,67 procent en 33 ± 2,36 procent van de controle voor de 0,245 en 0,49 mg/mlP. dactylifera L. zaadextractbehandelingen, respectievelijk. Daarnaast zijn de tyrosinaseremmingspercentages van kojiczuur (200 M; 0.03 mg/ml) en arbutine (2 mM; 0,54 mg/ml) ) waren respectievelijk 56,26 ± 5,06 procent en 64,56 ± 2,88 procent van de controle (Figuur 4A). Zo zouden de hogere concentraties van P. dactylifera L.-zaadextract (0,245 en 0,49 mg/ml) remmende niveaus van paddenstoelentyrosinase kunnen vertegenwoordigen.

In figuur 4B gaven de resultaten aan dat alleen 0,147 mg/ml P. dactylifera L.-zaadextract het melaninegehalte in B16F10-melanoomcellen significant kon verlagen. Na behandeling was het melaninegehalte in B16F10-cellen 80,66 ± 5,43 procent van dat van de controle. Voor de positieve standaard, arbutine (0,54 mg/ml), was het resterende intracellulaire melaninegehalte 61,19 ± 8,17 procent van dat van de controle. De resultaten gaven aan dat 0,147 mg/ml P. dactylifera L.-zaadextract kleinere effecten vertoonde dan arbutine. De overige waarden van intracellulaire tyrosinase-activiteit waren 85,1 ± 8,1 procent en 73,7 ± 11,9 procent voor respectievelijk 0,098 en 0,147 mg/ml P. dactylifera L.-zaadextract. De resterende intracellulaire tyrosinase-activiteit was 64,3 ± 14,9 procent van de controle nadat de cellen waren behandeld met arbutine (Figuur 4C). De resultaten gaven aan dat hogere concentraties van P. dactylifera L.-zaadextract nog steeds een kleiner remmend effect op -MSH-geïnduceerde tyrosinase-activiteit in B16F10-cellen vertoonden dan arbutine.

3.4. P. dactylifera L.-zaadextract remt de expressieniveaus van eiwitten die betrokken zijn bij melaninogenese

Western-blots werden gebruikt om de expressieniveaus van melanogenese-gerelateerde eiwitten in B16F10-cellen te onderzoeken (Figuur 5A). De resultaten geven aan dat behandeling met verschillende concentraties P. dactylifera L.-zaadextract leidde tot verlaagde niveaus van MC1R, MITF, tyrosinase, TRP1 en TRP2. De remmende effecten van het extract op eiwitexpressie waren duidelijk bij een concentratie van {{10}}.147 mg/ml. De veelvoudige verandering in eiwitexpressieniveau voor MC1R was 0,74 ± 0.02; voor MITF was het {{20}}.51 ± 0.03; voor tyrosinase was dit 0,54 ± 0,26; voor TRP-1 was het 0,57 ± 0,15; en voor TRP-2 was het 0,49 ± 0,1 (Figuur 5B).

De expressieniveaus van melanogenese-gerelateerde signaleringseiwitten werden onderzocht met behulp van Western-blots (Figuur 5C). De resultaten geven aan dat behandeling met 0,147 mg/ml P. dactylifera L.-zaadextract blijkbaar leidde tot verminderde niveaus van p-p38, p-JNK, p-ERK en p-CREB. De veelvoudige verandering van het eiwitexpressieniveau voor p-p38 was 0,88 ± 0,15; voor p-JNK was het 0.68 ± 0.39; voor p-ERK was het 0.65 ± 0.23; en voor p-CREB was het 0.44 ± 0.07 (Figuur 5D).

3.5. P. dactylifera L. Zaadextract heeft geen invloed op de genexpressie van tyrosinase, TRP1, TRP2 of MITF

De genexpressieniveaus van melanogenese-gerelateerde eiwitten, zoals tyrosinase, TRP1, TRP2 en MITF werden onderzocht door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR). De relatieve genormaliseerde expressieniveaus van tyrosinase/GAPDH voor 0.0367, 0.049 en 0.147 mg/ml P. dactylifera L.-zaadextractbehandelingen waren respectievelijk 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24 en 1,64 ± 0,55. Voor TRP-1/GAPDH, de relatieve genormaliseerde expressieniveaus voor 0.0367, 0.049 en {{4{{43} }}} 0,147 mg/ml P. dactylifera L.-zaadextractbehandelingen waren 1,64 ± 0,2, 1,15 ± 0.02 en 0. 89 ± 0.07, respectievelijk. De relatieve genormaliseerde expressieniveaus van TRP-2/GAPDH voor 0.0367, 0.049 en 0.147 mg /mL van P. dactylifera L.-zaadextract waren respectievelijk 1.08 ± 0.13, 0.85 ± 0.01 en 0.7 ± 0.05. Voor MITF/GAPDH waren de relatieve genormaliseerde expressieniveaus voor 0,0367, 0,049 en 0,147 mg/mL P. dactylifera L. zaadextractbehandelingen respectievelijk 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 en 0,74 ± 0,05 (Figuur 6).

4. Discussie

Er is gemeld dat melanogenese cellulaire oxidatieve stress verhoogt. Bovendien kunnen verschillende antioxidanten, ROS-scavengers, remmer-scavengers en remmers de UV-gemedieerde melaninesynthese remmen [54]. Daarom worden antioxidanten, ROS-scavengers en remmers van melanogenese in toenemende mate toegepast op huidblekende cosmetica voor de preventie van ongewenste hyperpigmentatie van de huid [14]. Er werd ook gevonden dat stimulatie van metallothioneïne, een endogene antioxidant, melanogenese in melanocyten zou kunnen onderdrukken [55]. De menselijke huid wordt vaak blootgesteld aan oxiderende verontreinigende stoffen of UV-licht en wordt beschadigd door externe omgevingsfactoren. In het bijzonder is gemeld dat UV-straling de vorming van ROS in de huid induceert en de peroxidatie van celmembraanlipiden bevordert [56]. Om oxidatieve stress tegen te gaan, is de huid uitgerust met bepaalde antioxidantsystemen [57].

Om de antioxidantactiviteit van P. dactylifera L.-zaadextract, DPPH en ABTS plus radicale wegvangende activiteit op te helderen, werd het totale fenolgehalte, het verminderende vermogen en het metaalion-chelerende vermogen van het extract bepaald zoals eerder beschreven [47,48]. Het P. dactylifera L.-zaadextract oefende aanzienlijke antioxiderende activiteiten uit in alle bovengenoemde analytische onderzoeken. De resultaten toonden het antioxidantpotentieel van P. dactylifera L.-zaadextract over verschillende bereiken met verschillende efficiënties. De DPPH-wegvangende activiteit van het zaadextract werd getoond in figuur 2A en was anders dan die van ABTS plus getoond in figuur 2B, wat mogelijk het gevolg is van verschillende mechanismen van de antioxidant-radicale interacties. Bovendien kan de stoichiometrie van reacties tussen de antioxidantcomponenten in het zaadextract variëren, wat resulteert in een verschil in het opruimen van vrije radicalen [58]. De potentiële antioxidanten in het P. dactylifera L.-zaadextract zouden een Fe3 plus / ferricyanide-complex kunnen omzetten in de ijzerhoudende vorm, en het reducerende vermogen diende als een indicator voor de antioxidantactiviteit van het zaadextract dat wordt getoond in figuur 2D. Er werd gevonden dat kojiczuur [59] werkt als een tyrosinaseremmer omdat kojinezuur werkt als een metaalchelator om de koperionen te cheleren en te voorkomen dat die ionen de actieve plaats van tyrosinase binnendringen. Daarom kunnen antioxidanten in het zaadextract onoplosbare metaalcomplexen vormen met ferro-ionen en vervolgens de interactie tussen metaalionen en lipiden remmen. De hogere metaalion-chelerende capaciteit van het zaadextract duidde op de potentiële antioxiderende activiteit en mogelijke remmende effecten op de tyrosinase-activiteit (Figuur 2E).

Het principe van de bepaling van intracellulaire ROS is dat DCFH-DA door het celmembraan diffundeert en enzymatisch wordt gehydrolyseerd tot DCFH door esterase; dan reageert DCFH met ROS (zoals H2O2) om DCF op te leveren. Snelle toename van DCF duidde op de oxidatie van DCFH door intracellulaire radicalen [60]. Het idee achter het zoeken naar nieuwe antioxidanten voor huidblekende activiteiten ligt in de hypothese dat de oxidatieve stress als gevolg van UV-straling kan bijdragen aan de stimulatie van de melaninesynthese. Van UV-straling is gemeld dat het ROS produceert in huidweefsels die de melanineproductie kunnen induceren door tyrosinase te activeren [61]. Bovendien werd gemeld dat verschillende huidbleekmiddelen melanogenese kunnen remmen door interactie met koperionen op de actieve plaats van tyrosinase of met o-chinonen om de polymerisatie van tussenproducten in de melaninesyntheseroute te blokkeren [62]. Bovendien kan vitamine C of vitamine E de oxidatie van reeds bestaande melaninedeeltjes verminderen. Daarom zijn deze vitamines op grote schaal toegepast in producten voor het bleken van de huid [63]. Interessant is dat onze resultaten de antioxiderende eigenschappen van P. dactylifera L.-zaadextract aantoonden, wat aangeeft dat het zaadextract van P. dactylifera L. zou kunnen werken als een huidwitmakend ingrediënt in cosmetica.

De MTT-test is een bekende colorimetrische test die de activiteit meet van cellulaire NADH/NADPH-afhankelijke oxidoreductase-enzymen die MTT reduceren tot paarsgekleurde formazankleurstoffen. Deze test zou kunnen worden toegepast om de potentiële cytotoxiciteit van medicinale middelen en toxische materialen te onderzoeken, aangezien deze middelen de levensvatbaarheid van de cellen versterken of remmen. De resultaten getoond in Figuur 3A waren in overeenstemming met die van de Trypan Blue-exclusietest in Figuur 3B, wat aangeeft dat het P. dactylifera L.-zaadextract geen cytotoxisch effect had op de levensvatbaarheid van B16F10-melanoomcellen.

Paddenstoelentyrosinase wordt vaak gebruikt als een doelenzym voor het screenen van potentiële remmers van melanogenese. Eerst werd ontdekt dat het doseringsbereik ({{0}}.049–0,49 mg/ml) van het P. dactylifera L.-zaadextract de activiteit van paddenstoelentyrosinase zou kunnen remmen. De resultaten getoond in figuur 4A geven aan dat het zaadextract een lagere remmende invloed op de paddestoeltyrosinase-activiteit vertoonde dan kojiczuur. Tyrosinase speelt een belangrijke rol in de eerste twee stappen van de melanogeneseroute. Om het echte remmende effect van het P. dactylifera L.-zaadextract op de melanineproductie op te helderen, werden het B16F10-melaninegehalte en de intracellulaire tyrosinase-activiteit bepaald. De resultaten gepresenteerd in figuur 4B geven aan dat een hogere concentratie van P. dactylifera L. zaadextract een schijnbaar remmend effect uitoefende op melaninevorming. De gegevens toonden aan dat P. dactylifera L.-zaadextract de melanogenese in melanoomcellen echt blokkeert. Hiermee waren de resultaten in figuur 4C in overeenstemming met de resultaten in figuur 4B. In de bovengenoemde cellulaire experimenten werd -MSH gebruikt als een inductor om de melaninesynthese te stimuleren. Van -MSH werd gemeld dat het bindt aan de melanocortine 1-receptor (MC1R) en intracellulair adenylaatcyclase activeert, dat op zijn beurt ATP katalyseert tot cAMP en cAMP-afhankelijke PKA activeert. De resultaten in figuur 5A onthulden dat het P. dactylifera L.-zaadextract de expressie van MC1R remde, waardoor de melanineproductie blokkeerde die werd geïnduceerd door -MSH-gemedieerde intracellulaire cAMP-upregulatie. Bovendien was de cAMP-gemedieerde PKA-signaleringsroute geïnactiveerd en werd melanogenese geremd. Om de gevolgtrekking te bevestigen, hebben we de PKA-remmer-experimenten uitgevoerd, en de gegevens getoond in figuur 4D wezen op het remmende effect van P. dactylifera L. zaadextract (0,147 mg/mL) op melanogenese in B16F10-cellen werd onderdrukt door H{{ 24}}behandeling. H89 (N-[2-p-broomcinnamylamino-ethyl]-5-isochinolinesulfonamide) is een selectieve en krachtige remmer van PKA. De resultaten geven aan dat cAMP-gemedieerde PKA-signalering werd beïnvloed door P. dactylifera L.-zaadextract.

Tyrosinase, TRP1 en TRP2 zijn de drie belangrijkste enzymen die de melaninesynthese in zoogdiercellen reguleren [64]. Bovendien is MITF de belangrijkste transcriptionele regulator van tyrosinase, TRP1 en TRP2 en is het de belangrijkste regulator van melanocytpigmentatie [65]. De resultaten in figuur 5A geven aan dat het P. dactylifera L.-zaadextract de eiwitexpressieniveaus van deze melanogenese-gerelateerde eiwitten verlaagde, de tyrosinase-activiteit remde en het melaninegehalte in B16F10-cellen verlaagde.

In deze studie onderdrukte P. dactylifera L.-zaadextract CREB-fosforylering en PKA-activering. Deze gegevens suggereren dat de cAMP-PKA-route verantwoordelijk kan zijn voor door P. dactylifera L. zaadextract geïnduceerde anti-melanogenese (Figuur 5C).

Van MAPK's is gemeld dat ze de melanogenese moduleren [66]. De MAPK-familie omvat drie typen eiwitkinasen, waaronder extracellulair responsief kinase (ERK), c-Jun N-terminaal kinase (JNK) en p38 MAPK. De p38-MAPK kan het cAMP-responselement-bindende eiwit activeren (CREB en CREB activeren MITF-expressie, wat een positieve bijdrage levert aan de melaninesynthese [67]. De resultaten in figuur 5C leveren bewijs dat het P. dactylifera L.-zaadextract CREB zou kunnen inactiveren, JNK en p38 remmen op hun beurt de MITF-expressie (Figuur 5A). Deze resultaten suggereren dat het door dactylifera L. zaadextract geïnduceerde antimelanogene effect kan worden gemedieerd door neerwaartse regulatie van de PKA-routes. Bovendien is gemeld dat bestraling met UV-licht een rol speelt. prominent aanwezig bij het ontstaan ​​van verschillende huidaandoeningen, waaronder schilfering, rimpels en hyperpigmentatie.68 De resultaten suggereerden dat P. dactylifera L.-zaadextract de melanineproductie verminderde, wat kan worden toegeschreven aan de uitputting van intracellulaire ROS.

Om het effect van P. dactylifera L.-zaadextract op cellulaire melanineproductie te beoordelen, hebben we de mRNA-niveaus bepaald in B16F10-cellen die zijn behandeld met -MSH en P. dactylifera L.-zaadextract. De met -MSH behandelde cellen vertoonden, zoals verwacht, verhoogde niveaus van MITF, tyrosinase, TRP-1 en TRP-2. Interessant is dat met P. dactylifera L.-zaadextract behandelde cellen een vermindering van de mRNA-expressie van deze melanogenese-gerelateerde genen vertoonden. Er was echter geen statistisch significant verschil tussen de kolommen, wat erop wees dat P. dactylifera L.-zaadextract de genexpressieniveaus van MITF, tyrosinase, TRP1 en TRP2 niet beïnvloedt.

Dit is ons product.

Voor meer informatie, klik hier.

Er is gemeld dat het belangrijkste fenolzuur dat wordt gevonden in P. dactylifera L.-zaad ferulazuur is [69]. Van ferulinezuur is aangetoond dat het de melaninesynthese in B16-melanoomcellen effectief remt door de door caseïnekinase 2-geïnduceerde fosforylering van tyrosinase op een dosisafhankelijke manier te remmen [70]. Deze rapporten ondersteunen onze resultaten getoond in figuur 1 - ferulinezuur in het waterextract van P. dactylifera L.-zaad droeg bij aan de remming van melanogenese in B16F10-cellen. Zeker, andere functionele componenten in het zaadextract moeten in de nabije toekomst worden onderzocht.

Onze resultaten gaven aan dat P. dactylifera L.-zaadextract melanogenese in B16F10-cellen remde door PKA-signaleringsroutes neerwaarts te reguleren. Daarom zou het P. dactylifera L.-zaadextract kunnen worden gebruikt als een effectief huidbleekmiddel.

5. Conclusies

Dit is het eerste rapport over het werkingsmechanisme van P. dactylifera L.-zaadwaterextract bij de melaninesynthese. De huidige studie toonde de betrokkenheid van de cAMP/PKA/CREB-route bij het depigmenterende effect van P. dactylifera L.-zaadextract aan. Onze resultaten gaven aan dat het P. dactylifera L.-zaadextract melanogenese in B16F10-cellen remde door de PKA-signaleringsroutes neerwaarts te reguleren. Daarom zou het P. dactylifera L.-zaadextract kunnen worden gebruikt als een nieuw dermatologisch anti-timelanogenesemiddel en een effectief huidbleekmiddel.