Pinocembrine verbetert hartfalen na een infarct door activering van Nrf2/HO-1-signaleringspad, deel 2

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

statistische analyse

variabelen werden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout, terwijl de proportionele variabelen als een percentage werden weergegeven. Vergelijkingen in alle groepen werden uitgevoerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gecorrigeerd door een Tukey post hoc-test, behalve die in echocardiografiegegevens die werden geanalyseerd met tweeweg-ANOVA gecorrigeerd door de Fisher minst significante verschiltest. Een p-waarde<0.5 was="" defined="" as="" statistical="">

Resultaten Pino verbeterde HF-geïnduceerde verslechtering van hartfuncties We hebben eerst echocardiografie geïmplementeerd om het HF-fenotype te bepalen dat wordt geïnduceerd door LAD-ligatie en de effecten die worden uitgeoefend door Pino op hartfuncties. Representatieve tweedimensionale echocardiogrammen in M-modus in alle groepen werden geïllustreerd in Fig. 2A. 6- week verwijderingsvrije voeding na LAD-ligatie produceerde significante HF-manifestaties, bewezen door een vermindering van LVEF en FS, en vergroting van LVID's, LVIDd, LVESV, LVEDV in respectievelijk de 6e en 8e week versus de sham-groep, naast een verhoogde serum-BNP-concentratie en hartgewicht/tibialengte in de 8e week die cardiale disfunctie en hypertrofie aantoonden (Fig. 2B, C), met de specifieke parameters , werden geïllustreerd in Tabel 1). Alle manifestaties werden echter gedeeltelijk omgekeerd door toepassing van Pino versus HF-groep na 8e week, wat de heilzame rol voor Pino op hartfuncties suggereert

na PIHF. Verder was het opmerkelijk dat hoewel Pino de basislijnfuncties van het hart in de 6e week veranderde in een richting van verbetering, de veranderingen geen significantie bereikten. Daarom werd een aanname naar voren gebracht dat de vraag of langdurige toepassing van Pino tot prominente verbeteringen kon leiden, verder onderzoek nodig had.

Klik hier om meer te weten

Pino verzwakte de hermodellering van PIHF Aangezien het regeneratieve vermogen van cardiomyocyten schaars of afwezig was, werden de verbeteringen van hartfuncties meer toegeschreven aan verbetering van de levende cardiomyocyten en weefsels door Pino dan aan regeneratie van cardiomyocyten. Daarom evalueerden we verder 3 sleutelfactoren in PIHF-remodellering: fibrose, neovascularisatie en apoptose, zoals eerder gesuggereerd (Wang et al 2010). Pino verminderde de afzetting van collageenvezels in de MI-grenszone dramatisch met ongeveer 2 vouwen (Fig. 3A). Bovendien hebben we, om de kunstmatige vooringenomenheid in het oordeel over de infarctgrenszone te vermijden, een identiek model opgesteld als een positieve controle, waarin Pino werd vervangen door enalapril, een angiotensine-converting enzyme-remmer (ACEI) die bekend staat om de omkering van HF-remodellering. We observeerden de mate van fibrose in HF- en ACEI-groepen.

bereikte geschatte percentage versus vooraf vastgestelde modellen. We hebben ook het infarctgebied gemarkeerd waar enorm afgezet collageen het myocardium verving (aanvullend bestand 1: figuur S1). Bovendien compenseerde Pino chronische HF-geïnduceerde verdunning van VEGFR2-distributie en expressie (Fig. 3B). Eerdere studies hebben aangetoond dat het p53-eiwit, dat de diversiteit van pro-apoptotische genen zou kunnen activeren, een sleutelrol speelde in anti-angiogenese via remming van hypoxie-induceerbare factor-l (HIF-la) (Gogirajuet al.2019; Guo et al. .2015). Vervolgens observeerden we overexpressie van p53-eiwit in de HF-groep, wat werd tegengegaan door Pino (Fig. 3C), wat gedeeltelijk de wijziging van VEGFR2 verklaart. We hebben ook een western blot-experiment uitgevoerd waarbij toediening van Pino de expressie van anti-apoptotisch eiwit BCL-2 opreguleerde en, in tegenstelling, de pro-apoptotische eiwitten, waaronder p53, Bax en gesplitst caspase-3, neerwaarts reguleerde. een verhoogde bcl-2/bax-verhouding versus de HF-groep, wat wijst op activering van de apoptose-procedure, wat ook werd bevestigd door de TUNEL-assay waarbij Pino een omgekeerd effect op de apoptotische snelheid aantoonde (Fig. 3D). In een conclusie verbeterde Pino de hermodellering na MI door zijn bekende effecten, waaronder anti-fibrose, angiogenese en anti-apoptose.

Cistanche kan de immuniteit verbeteren

Pino verlichtte OS door modulatie van Nrf2/HO-1-routes. Desalniettemin bleven de mechanismen waarmee Pino tot dergelijke veranderingen leidde, ongedefinieerd. Accumulerende onderzoeken hebben aangetoond dat OS dat een grote verscheidenheid aan moleculen wijzigde en nadelige remodelleringssignaleringsroutes veroorzaakte, kon leiden tot apoptose en fibrose in HF-modellen (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Wang et al.2010 ; Chen et al.2020b), veronderstelden we dus dat Pino PIHF verbeterde via mitigatie van OS. We hebben eerst de ROS-generatie in hartweefsels en SOD en MDA in serum onderzocht door respectievelijk fluorescentie- en biochemische tests om de antioxidantrollen voor Pino in HF te bepalen. In verwachting heeft Pino ROS gedeeltelijk weggevangen die is gegenereerd door chronische

HF, gemanifesteerd door een vermindering van de fluorescentie-intensiteit van DHE (Fig. 4A, B). Bovendien werd het antioxidant-enzym SOD opgereguleerd door toepassing van Pino, terwijl de MDA, die duidt op lipideperoxidatie, werd verlaagd (Fig. 4B). De bovenstaande gegevens getuigden van de antioxidantrol voor Pino in een knaagdiermodel van PIHF.

Hoewel het ROS-opruimingseffect van Pino zeker was, moesten de mechanismen die ten grondslag liggen aan de versterking van de antioxidantverdediging nog steeds worden opgehelderd. Nrf2 is een dominante component van de endogene antioxidantafweer die dissocieert met zijn remmer Kelch-lick ECH-geassocieerd eiwit 1 (Keapl) bij stress / stimuli en zich verplaatst naar de kern om te binden aan het promotorgebied van het antioxidantresponselement (ARE), wat de de expressie van een overvloed aan antioxidantgenen en enzymen, waaronder het HO-1 het representatieve enzym was en een cruciale rol speelt (Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019; Velusamy et al. 2020 Tian et al.2019). HO-1, gecodeerd door HMOX1, katalyseert heem tot afbraak tot 3 antioxidantmoleculen, waaronder biliverdine, bilirubine en koolmonoxide (CO) (Wang et al.2010; Kishimoto et al.2019). Eerdere studies hebben aangetoond dat specifieke activering of overexpressie van Nrf2 of HO-1 PIHF verbeterde (Ma et al.2019; Bubb et al.2017; Wang et al.2010), en aan de andere kant zou Pino zich kunnen concentreren op de Nrf2 / ARE-route om beschermende effecten uit te oefenen op depressie (Wang et al.2020), neurotoxiciteit (Jin et al. 2015), enz., Met de interactie ongedefinieerd in een PIHF-model. We hebben deze interactie verder onderzocht met western blot. PIHF droeg bij aan de vermindering van expressie van de algehele Nrf2 en HO -1 versus schijngroep. En Pino keerde dit verderfelijke effect significant om door opregulatie van Nrf2 naast het vermogen om HO-1-expressie te verhogen in een sterke aanleg, hoewel het verschil geen significantie bereikte (p=0.0845; Fig.4C ). De resultaten wezen op een rol voor Pino bij het activeren van de Nrf2/HO-1-route die verantwoordelijk is voor de verbetering van hartfuncties en hermodellering in PIHF.

In vitro blokkade van Nrf2 elimineerde de effecten van Pino in H9c2 cardiomyocyten

Om verder te bewijzen dat de effecten van Pino Nrf2 / HO-1-routeafhankelijk waren in plaats van integrale verbetering van de HF-pathologische status, hebben we H9c2-cardiomyocyten gekweekt zoals de eerder gerapporteerde methoden, en een specifieke Nrf2-remmer, ML385, in vitro gebruikt. Pino verzwakte ISO-geïnduceerde ROS-accumulatie samen met een toename van SOD en een afname van MDA in het medium in een vergelijkbaar responspatroon als die in vivo (Fig. 5). Alle effecten werden echter bijna teniet gedaan door de toediening van ML385, wat suggereert dat het antioxiderende effect van Pino voornamelijk werd gepresenteerd door activering van Nrf2. Bovendien is deze Nrf2/HO-1 route-afhankelijk

het effect werd verder bepaald vanwege de vermindering van expressie van Nrf2 en HO-1 in de ISO plus Pino plus ML385-groep (Fig. 6). Het was ook opmerkelijk dat het vermogen van ROS-opruiming van Pino afnam, aangezien de werkzaamheid van Nrf2 voornamelijk werd gepresenteerd door oxidantafweer. Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen was dat een onbalans van redoxhomeostase buitensporige ROS genereerde boven het maximale wegvangende vermogen van 25 uM Pino.

Vervolgens hebben we H9c2 cardiomyocyten western blot uitgevoerd om de onbalans van redox te onderzoeken

homeostase als gevolg van ML385 was verantwoordelijk voor een verhoogde gevoeligheid voor hermodellering. Toediening van Pino vertoonde parallelle effecten bij antifibrose, anti-apoptose, wat blijkt uit een afname van collageen I,p53, Bax, gesplitst caspase-3 evenals een toename van BCL-2 (Fig. 6A , B). Verder suggereerde de CCK-8 remming van de activiteit van CMF's door Pino, waarbij de reductie van collageenafscheiding optreedt, wat werd onderzocht door CMF's western blot. Bovendien toonde de omkering van al deze presentaties door ML385 in vitro verder aan dat Nrf2/HO-1 het belangrijkste doelwit van Pino was bij de verbetering van PIHE.

Discussie

In de huidige studie hebben we vastgesteld dat de Pino-behandeling gunstig was voor PIHF door de antioxiderende effecten. Pino verbeterde de hartfuncties en hermodellering als gevolg van PIHF door ROS-scavenging en Nrf2/HO-1-pathway-activering, wat de belangrijkste factoren van ventriculaire hermodellering, waaronder afzetting van collageenvezels en apoptose, verder verzwakte en neovascularisatie in een p53-eiwitdownregulatie vergemakkelijkte. afhankelijke manier.

Antioxidanten EN HF

Er wordt een consensus gepresenteerd dat OS de disfunctie en hermodellering in HF verergerde (Galli en Lombardi 2016; Dubois-Deruy et al. 2020; Velusamy et al. 2020; Tian et al. 2019; Kishimoto et al. 2019), er zijn ook een aantal van experimenten en proeven die zijn uitgevoerd voor de effecten van antioxidanten waarmee steeds meer moleculaire doelwitten en nieuwe medicijnen zijn ontdekt en bestudeerd. Echter, naast verschillende antioxidanten die zijn getest in klinische onderzoeken die vatbaar waren voor invaliditeit of zelfs een verhoogd risico op HF (Lee et al. 2005; Made et al. 2015; Olesen et al.2014; Lonn et al. 2005), talrijke moleculaire doelwitten, zoals de kinasen, microRNA's (Tian et al.2020; Vagnozziet al.2013; Pfister et al. 2014), enz., hebben veel moeite met het overbrengen van basisexperimenten naar proeven, en zelfs klinische toepassing vanwege aan de fabricage en veiligheid.

Daarentegen heeft Pino de volgende voordelen die beloven een extra antioxidant te zijn in de therapie van HF: (i) significante antioxidant werkzaamheid die is aangetoond in eerdere studies en ons huidige onderzoek; (ii) Pino kan worden gewonnen uit een aantal natuurlijke planten, honing en propolis of kunstmatig worden gesynthetiseerd, wat de toereikendheid voor productie en een relatief goedkope prijs verzekerde; (ii) de rijkdom van Pino in honing en propolis duidde op een gemakkelijke opname via de voeding. In feite is er een recente klinische fase I-studie uitgevoerd om Pino te leveren aan gezonde proefpersonen waarbij Pino goede tolerantie en veiligheid vertoonde (Cao et al. 2015). Bovendien is Pino goedgekeurd voor de behandeling van ischemische beroerte door de Chinese Food and Drug Administration, waarbij een klinische fase II-studie wordt uitgevoerd (Shen et al. 2019). Deze geboekte vooruitgang doet ons uitkijken naar verdere toepassing van Pinon bij steeds meer ziekten met betrokkenheid van PIHF.

De rollen voor Pino op HF

Voor zover wij weten, was deze huidige studie het eerste onderzoek naar de rol van Pino op een knaagdiermodel van PIHF. Hoewel de effecten van Pino op grote schaal werden onderzocht in een overvloed aan modellen, legden slechts enkele studies de nadruk op het verband tussen Pino en hart- en vaatziekten, waaronder myocardinfarct, ischemie/reperfusieschade en aritmieën (Ye et al. 2019; Zheng et al. 2020), die ons begrip van de door Pino verleende bescherming van het hart beperkte. Bovendien vertoonde Pino, zoals eerder aangetoond, anti-fibrose, -apoptose, -ontsteking en antioxiderende werkingen die ook de essentiële doelen van therapie bij PIHF waren. Sinds een van de ontstekingsroutes is de nucleaire factor-kappa B/tumornecrosefactor- (NF-KB/TNF-) route onderzocht in onze groep (Ye et al.2019), dus in deze studie hebben we ons gericht op verschillende factoren die de hartfuncties en hermodellering verslechterden, bestaande uit apoptose, oxidatieve stress, fibrose en verdunning van neovascularisatie. Zoals verwacht, verzachtte Pino-postconditionering, wat van groot belang was, apoptose en fibrose op een antioxidant-afhankelijke manier. We observeerden ook VEGFR2-afhankelijke angiogenese die zuurstof en voedingsstoffen voor cardiomyocyten leverde om overleving te vergemakkelijken, analoog aan die opgewekt door Pino in een model van de ziekte van Alzheimer (Liu et al. 2014). Er bleef echter een controverse bestaan ​​​​dat Pino was geauthenticeerd om VEGFR2-binding, migratie van haarvaten en kiemen te onderdrukken (Cuevas et al.2015; Tian et al.2014) waarmee Pino kon worden gebruikt om de proliferatie van kanker als een latent nieuw medicijn te belemmeren. Daarom was neovascularisatie in de infarctgrenszone waarschijnlijk te wijten aan het herstel van andere factoren in plaats van de directe impact van Pino. P53-eiwit opgereguleerd in PIHF zou de verandering gedeeltelijk kunnen verklaren. Of Pino andere factoren beïnvloedde die angiogenese zouden kunnen moduleren, zoals proteïnekinase B (AKT), was ook onbekend. Dus de onderliggende mechanismen van neovascularisatie die door Pino in PIHF werden verleend, hadden verder onderzoek nodig om te worden opgehelderd.

Pino voornamelijk gemoduleerde Nrf2/HO-1-route in PIHF

Nrf2/HO-1-pad was een dominant mechanisme om de schade veroorzaakt door OS te weerstaan. Het is algemeen bekend dat Pino OS kan verbeteren door de algehele Nrf2- en HO-1-expressie en Nrf2-translocatie van het plasma naar de kern te bevorderen, wat ook de reden was dat we deze route als kandidaat kozen. Het effect van Pino op de Nrf2 / HO-1-route was echter te wijten aan directe activering of indirecte modulatie nadat verbetering van de algehele status ongedefinieerd bleef. Daarom hebben we in dit onderzoek Nrf als het belangrijkste doelwit van Pino bepaald door remming van Nrf2 door ML385, wat de heilzame effecten van Pino op fibrose, apoptose en angiogenese bijna ongedaan maakte. Desalniettemin had deze in vitro uitgevoerde associatie verder onderzoek nodig waarbij Nrf2-remmer of siRNA of virus getransfecteerd voor genenstilte nodig was om in vivo te worden toegepast. Verder hebben we ook waargenomen dat de ROS-scavenging werd onderdrukt door ML385, waarover we een veronderstelling naar voren brachten dat onevenwichtige redoxhomeostase buitensporige ROS-generatie veroorzaakte boven de capaciteit van Pino bij een concentratie van 25 μM. Om van deze aanname te getuigen, werd voorgesteld een concentratiegradiënt te regelen om te detecteren of voldoende Pino in staat was om de ROS-productie tegen te gaan die werd veroorzaakt door blokkade van de Nrf2 / HO-1-route. Aangezien ROS-generatie over het algemeen wordt toegeschreven aan elektronische lekkage van mitochondriale, geactiveerde nicotinamide-adenine-dinucleotide-fosfaatoxygenase, ontkoppeling van stikstofoxidesynthase en accumulatie van geavanceerde glycosyleringsproducten, zouden meer diepgaande studies kunnen worden uitgevoerd om de gedetailleerde mechanismen te onderzoeken waarmee Pino ROS belemmerde generatie en elimineerde ROS-accumulatie.

Beperkingen van studie

De huidige studie heeft verschillende beperkingen. We moeten erkennen dat er een subjectieve vertekening was van de definitie van infarctgrenszone die de nauwkeurigheid van de resultaten sterk zou kunnen beïnvloeden. Om deze beperking op te lossen, werden de pathologische secties gekozen door 3 personen die echter niet volledig konden afzien van de vooringenomenheid. Bovendien vertoonden weinig Western-blot-afbeeldingen meerdere banden die werden toegeschreven aan de polyklonale primaire antilichamen die een negatieve invloed hadden op de kwaliteit van de cijfers. Het was ook merkbaar dat we Nrf2-remmer, ML385, gebruikten in plaats van Nrf2-siRNA of adenovirustransfectie, wat resulteerde in minder overtuiging. Last but not least waren de antioxidantmechanismen van Pino gecompliceerd, waardoor meer onderzoek nodig was om dit verder op te helderen.

Conclusie

Concluderend, toediening van Pino verbeterde door hartinfarct geïnduceerd hartfalen, bewezen door verbetering van hartfuncties en structurele hermodellering, waaronder fibrose, apoptose en neovascularisatie, gedeeltelijk door de verzwakking van OS, in een Nrf2/HO-1-route- afhankelijke manier.

Dit artikel is afkomstig uit Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7