Potentiële traanbiomarkers voor de diagnose van de ziekte van Parkinson - een pilotstudie Ⅰ

Samenvatting: De ziekte van Parkinson (PD) is na de ziekte van Alzheimer de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte. In deze studie werd het traanproteoomprofiel van patiënten met idiopathische PD (iPD, n=24), dragers van de E46K-SNCA-mutatie (n=3) en gezonde controle (CT, n {{4 }}) proefpersonen werden geanalyseerd om kandidaat-biomarkers te identificeren voor de diagnose van PD. Er werd een observationele, prospectieve en case-control pilotstudie uitgevoerd, waarbij de traanmonsters van de deelnemer werden onderzocht met behulp van nano-vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nLC-MS/MS) en hun neurologische stoornis werd beoordeeld. De verkregen proteomische gegevens zijn beschikbaar op ProteomeXchange met identifier 10.6019/PXD028811.

Klik om Amway voor de ziekte van Parkinson op te halen

Deze analyses leidden tot de identificatie van 560 traaneiwitten, waarvan sommige gedereguleerd waren bij PD-patiënten en die betrokken zijn bij immuunresponsen, ontsteking, apoptose, collageenafbraak, eiwitsynthese, afweer, lipidentransport en veranderde lysosomale functie. Van deze eiwitten waren er zes gerelateerd aan neurodegeneratieve processen en vertoonden een uitstekend vermogen om patiënten en controles te classificeren. Deze bevindingen onthulden dat bepaalde eiwitten werden opgereguleerd in de tranen van PD-patiënten, voornamelijk eiwitten die betrokken zijn bij de lysosomale functie. In deze studie werden dus traaneiwitten geïdentificeerd als betrokken bij neurodegeneratie die mogelijk verband houdt met een agressief ziektefenotype bij PD-patiënten.

Trefwoorden: biomarkers; Ziekte van Parkinson; traanfilm; lysosoom

1. Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte na de ziekte van Alzheimer (AD), en wordt gekenmerkt door traagheid van beweging (bradykinesie), verhoogde spierspanning (stijfheid), trillen (tremor) en verminderde houdingscontrole. Bij pathologisch bevestigde PD is er een variabele hoeveelheid en afzetting van verkeerd gevouwen alfa-synucleïne (-syn) in de vorm van Lewy-lichaampjes (LB's) en Lewy-neurieten in het centrale zenuwstelsel (CZS). Deze variabiliteit in de accumulatie van deze structuren weerspiegelt waarschijnlijk de klinische heterogeniteit bij deze ziekte [1-3]. Verschillende klinische aandoeningen liggen inderdaad in het spectrum van Lewy body-ziekten (LBD's), waaronder patiënten met idiopathische (IPD) en genetische PD en patiënten die lijden aan dementie met LB's. Een van de grootste uitdagingen bij het omgaan met neurodegeneratieve ziekten is het vinden van klinische markers die een vroege classificatie van patiënten mogelijk maken en helpen om de voortgang van de ziekte te volgen.

Factoren zoals oxidatieve stress, proteolyse en veranderde vetzuur- of fosfolipideconcentraties zijn in verband gebracht met structurele veranderingen in -syn, en post-translationele modificaties kunnen ook de grootte, structuur of eiwitbelasting van -syn veranderen [4]. Deregulerende mutaties en vermenigvuldigingen in het -syn-gen (SNCA) veroorzaken autosomaal dominante familiaire vormen van PD [5]. Misschien wel de meest pathogene mutatie waarvan bekend is dat deze PD veroorzaakt, is de E46K-mutatie in -syn (E46K-SNCA), die ten grondslag ligt aan een groep agressieve, genetische LBD's met klinische en pathologische kenmerken die doen denken aan dementie met LB's [6,7]. Hoewel mutaties in -syn zeldzaam zijn, bieden ze een unieke kans om patiënten met de ziekte van Parkinson te identificeren en de progressie van deze pathologieën beter te begrijpen.

Het is bekend dat PD-patiënten hallucinaties, veranderingen in oog- en ooglidbewegingen en veranderde traansamenstelling in kleinere hoeveelheden ontwikkelen [8,9]. Naast schade aan het oogoppervlak kunnen deze patiënten veranderingen in accommodatie, verminderde gezichtsscherpte, scotoomvorming (gebieden waar hun gezichtsveld gedeeltelijk of volledig degenereert) en een dunner worden van de netvlieslagen ervaren, met name als gevolg van een verkleining van het gezichtsveld. in het aantal zenuwvezels [10,11]. Deficiënties in neurotransmissie en monoaminemetabolisme beïnvloeden ook de pathologische veranderingen in het visuele systeem van PD-patiënten [12].

Deze veranderingen zijn vrij typisch omdat monoaminen betrokken zijn bij de overdracht van visuele informatie in het netvlies [13]. Bovendien kunnen PD-patiënten veranderingen ervaren in de innervatie van het voorste deel van het oog, wat uiteindelijk de samenstelling van tranen kan veranderen. Veel neurotransmitters en trofische stoffen worden uitgescheiden in tranen, afkomstig van het kamerwater of zenuwen die door het hoornvlies lopen [14].

De cellulaire en moleculaire mechanismen die aan deze associaties ten grondslag liggen, moeten echter nog volledig worden opgehelderd. Aangezien PD verschillende niet-motorische systemen en perifere zenuwen aantast, zou de traansecretie bij deze patiënten kunnen zijn veranderd en zou de traaneiwitsamenstelling bij deze patiënten een karakteristiek profiel kunnen vertonen dat als diagnostische biomarker zou kunnen dienen. In die zin zou het analyseren van de traaneiwitten van patiënten met E46K-SNCA en iPD kunnen helpen bij het identificeren van bruikbare kandidaat-biomarkers voor de diagnose en progressie van PD.

Daarom was de huidige studie gericht op het analyseren van het traanproteoomprofiel bij iPD-patiënten en dragers van de E46K-SNCA-mutatie om een ​​biomarker te vinden die zou kunnen helpen bij de toekomstige diagnose van PD, met behulp van niet-invasieve monsters.

2. materialen en methoden

2.1. Studie cohort

We ontwierpen een observationele, prospectieve, case-control pilotstudie waaraan 24 patiënten met iPD, 3 dragers van de E46K-SNCA-mutatie en 27 gezonde proefpersonen (CT's) deelnamen. Dit onderzoek werd uitgevoerd door medisch gekwalificeerd personeel na goedkeuring van de OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces Ethics Committee CEIC E18/47. De studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki over biomedisch onderzoek met mensen. Voorafgaand aan het verzamelen van monsters werd ondertekende geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen na uitleg van de aard en mogelijke gevolgen van het onderzoek. De patiënten werden gerekruteerd bij de dienstafdelingen Neurologie en Oogheelkunde van het Universitair Ziekenhuis Cruces (Barakaldo, Bizkaia, Spanje) tijdens poliklinische consultaties, op basis van de overeengekomen in- en uitsluitingscriteria. Patiënten met IPD voldeden aan de Parkinson's UK Brain Bank-criteria voor de diagnose van PD en hadden geen bekende mutaties.

De inclusiecriteria voor CT's waren ouder dan 40 jaar, van beide geslachten, en zonder een klinische geschiedenis van een neurologische aandoening. Personen met (of een voorgeschiedenis van) een systemische of oculaire stoornis/aandoening werden in het onderzoek opgenomen. De uitsluitingscriteria bestonden uit oogchirurgie in de afgelopen drie maanden, chronische oogmedicatie (bijvoorbeeld voor glaucoom), een voorgeschiedenis van allergieën, het gebruik van plaatselijke medicatie (anders dan kunsttranen) of orale medicatie die corticosteroïden bevat, atopie en patiënten met de ziekte van Sjögren. syndroom.

Gebruikers van contactlenzen werden ook uitgesloten om mogelijke interferentie met de interpretatie van de resultaten te voorkomen. Voorlopige oculaire tests en monsterverzameling werden op dezelfde dag uitgevoerd, terwijl patiënten met PD ook op een aparte dag werden gezien door leden van het onderzoeksteam die experts zijn in bewegingsstoornissen om de Parkinson-schaal te beoordelen.

2.2. Oogheelkundig onderzoek

Het klinisch oftalmologisch onderzoek omvatte Schirmer's test I (SCH), die bepaalt of het oog voldoende tranen produceert om het vochtig te houden. De test laat het water in tranen over de lengte van een papieren teststrip stromen, en normale waarden zijn groter dan of gelijk aan 10 mm bevochtiging van het papier na 5 minuten. De instabiliteit van de traanfilm werd beoordeeld door gebruik te maken van de traanbreektijd (TBUT) met fluoresceïne. TBUT is de tijd die nodig is voordat de eerste droge plek op het hoornvlies verschijnt na volledig knipperen. Een waarde van minder dan 10 s duidt meestal op enige instabiliteit van de traanfilm. Elke systemische ziekte of elke andere aandoening/medicatiegebruik die de interpretatie van de resultaten zou kunnen verstoren, werd beschouwd als een criterium voor uitsluiting.

2.3. Neurologisch onderzoek

Een neuroloog-expert op het gebied van bewegingsstoornissen registreerde de leeftijd van de PD-patiënten bij het verzamelen van traanvocht, hun ziekteduur en hun score op de Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) en de Hoehn Yahr-schaal. Deze tests dienen als stratificatiecriteria om de progressie van de ziekte te volgen. De vertrouwelijkheid van patiëntgegevens werd gewaarborgd door het gebruik van de Baskische Biobank.

2.4. Tear-Sample-collectie

Alle traanmonsters werden verzameld met behulp van gekalibreerde 10 µl glazen microcapillaire buisjes (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Duitsland). Er werden traanmonsters genomen van de inferieure temporale traanmeniscus, waardoor irritatie van het oogoppervlak of de ooglidrand tot een minimum werd beperkt, en zonder installatie van anesthesie. De traanmonsters werden uit beide ogen van elke deelnemer verzameld en onmiddellijk in voorgekoelde Eppendorf-buisjes geplaatst. Na traanafname werden de monsters bewaard bij -80 ◦C tot hun analyse.

2.5. Proteomics-analyses

De proteomische analyses werden uitgevoerd bij de CIC bioGUNE Proteomics Service (Derio, Bizkaia, Spanje), met behulp van het Filter Aided Sample Preparation (FASP) -protocol [15] voor monsterverwerking en digestie. Trypsine (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, VS) werd toegevoegd in een verhouding trypsine:proteïne van 1:50, en het mengsel werd een nacht bij 37 ◦C geïncubeerd, gedroogd in een RVC{{4} } Speedvac-concentrator (Christus, Wenen, Oostenrijk). De verkregen peptiden werden ontzout en opnieuw gesuspendeerd in 0,1 procent mierenzuur (FA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, VS) met behulp van C18-stadiumtips (Millipore, St. Louis, MO, VS).

Monsters werden geanalyseerd in een nieuwe hybride gevangen ionenmobiliteitsspectrometrie quadrupool time of flight massaspectrometer (timsTOF Pro met PASEF, Bruker Daltonics, Bremen, Duitsland), online gekoppeld aan een nanoElute vloeistofchromatograaf (Bruker, Coventry, VK). Deze massaspectrometer maakt gebruik van een nieuwe scanmodus genaamd parallelle accumulatie seriële fragmentatie (PASEF), die de sequentiesnelheid vermenigvuldigt zonder verlies van gevoeligheid, en het is bewezen dat het een uitstekende analytische snelheid en gevoeligheid biedt voor proteomics-analyses [16].

Monsters (200 ng) werden direct geladen op een 15 cm Bruker nano-elutie FIFTEEN C18 analytische kolom (Bruker, Coventry, VK) en opgelost bij 400 nL/min. De kolom werd in een oven verwarmd tot 50 ◦C. Identificatie en kwantificering van eiwitten werden uitgevoerd met behulp van de PEAKS-software (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, VS). Zoekopdrachten werden uitgevoerd tegen een database van canonieke menselijke Uniprot / Swissprot-items (geen isoforms-beschouwer), met toleranties voor voorlopers en fragmenten van 20 ppm en 0,05 Da.

Een gebiedsgebaseerde labelvrije eiwitkwantificering werd uitgevoerd met behulp van de PEAKS Q-module die beschikbaar is in de PEAKS-software. Alleen eiwitten geïdentificeerd met ten minste twee peptiden met een False Discovery Rate (FDR) <1 procent en aanwezig in ten minste 70 procent van de monsters van een van de experimentele groepen die werden geanalyseerd, kwamen in aanmerking voor verdere analyse. De gegevens werden op het Perseus-platform geladen [17] en verder verwerkt (log2-transformatie, imputatie) voordat een Student's t-test werd toegepast voor differentiële eiwitexpressie-analyse. De proteomics-gegevens zijn samengevat in Supplementary Materials File S1, en de massaspectrometrische proteomics-gegevens zijn gedeponeerd bij het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE [18] partnerrepository, met de dataset-ID's PXD028811 en 10.6019/PXD028811.

2.6. Statistische analyse

Statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van het IBM SPSS Statistics-pakket voor Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, New York, NY, VS). De normaliteit van continue gegevens werd beoordeeld met een Shapiro-Wilk-test. De berekende p-waarden bepalen de waarschijnlijkheid dat de associatie tussen eiwitten in de dataset en een bepaald canoniek pad, functioneel netwerk of stroomopwaartse regulator alleen door toeval wordt verklaard, op basis van een Fisher's exact-test, met een p-waarde < {{5 }}.05 wordt als significant beschouwd.

Univariate logistische regressies werden gebruikt om de statistisch significante kenmerken te identificeren die verband houden met PD-patiëntdiscriminatie. Na selectie van variabelen werden multivariate logistische regressies gebruikt om een ​​PD-discriminatiemodel te construeren en om de klinische en proteomische variabelen te identificeren die relevant zijn voor PD-identificatie. Met logistieke modellen kan de relatie tussen een discrete afhankelijke variabele en een reeks continue of discrete onafhankelijke variabelen worden geschat. De modellen maken de classificatie van patiënten met of zonder PD mogelijk, waarbij de waarschijnlijkheid wordt berekend om tot elke groep te behoren. De p-waarde van elke covariabele beschrijft de statistische significantie van de associatie tussen de respons en elke term in het model.

voor meer informatie: Ali.ma@wecistanche.com