Door preconditionering geactiveerde AKT regelt neuronale tolerantie voor ischemie via de MDM2-p53-routeⅠ

Abstract

Een van de belangrijkste mechanismen van door preconditionering gemedieerde neuroprotectie is de verzwakking van celapoptose, waardoor hersentolerantie wordt veroorzaakt na daaropvolgende schadelijke ischemie. In deze context speelt de anti-apoptotische PI3K/AKT-signaleringsroute een sleutelrol bij het reguleren van celdifferentiatie en overleving.

Klik hier voor cistanche tubulosa poederneurobescherming

Van actieve AKT is bekend dat het de expressie van muriene dubbele minuut-2 (MDM2) verhoogt, een E3-ubiquitineligase dat p53 destabiliseert om de overleving van kankercellen te bevorderen. In neuronen hebben we onlangs aangetoond dat de MDM2-p53-interactie wordt versterkt door farmacologische preconditionering, gebaseerd op subtoxische stimulatie van de NMDA-glutamaatreceptor, die ischemie-geïnduceerde neuronale apoptose voorkomt.

Het is echter onbekend of dit mechanisme bijdraagt ​​aan neuronale tolerantie tijdens ischemische preconditionering (IPC). Hier laten we zien dat IPC PI3K-gemedieerde fosforylering van AKT op Ser473 induceerde, die op zijn beurt MDM2 op Ser166 fosforyleerde. Deze fosforylering veroorzaakte de nucleaire stabilisatie van MDM2, wat leidde tot p53-destabilisatie, waardoor neuronale apoptose bij een ischemische beschadiging werd voorkomen. Remming van de PI3K / AKT-route met wortmannine of door AKT-uitschakeling veroorzaakte de accumulatie van cytosolisch MDM2, waardoor door IPC geïnduceerde neuroprotectie werd opgeheven.

IPC verbetert dus de activering van de PI3K / AKT-signaleringsroute en bevordert neuronale tolerantie door de MDM2-p53-interactie te beheersen. Onze bevindingen bieden een nieuwe mechanistische route die betrokken is bij IPC-geïnduceerde neuroprotectie via modulatie van AKT-signalering, wat suggereert dat AKT een potentieel therapeutisch doelwit is tegen ischemisch letsel. Sleutelwoorden: AKT; MDM2; p53; PI3K; ischemische tolerantie; voorconditionering

1. Inleiding

Bij mensen is het bestaan ​​van een voorbijgaande ischemische aanval (TIA) onthuld als een endogene vooraf geconditioneerde toestand met de voordelen van functionele resultaten bij patiënten met een beroerte [1-3]. Endogene neuroprotectie geïnduceerd door een korte, subtoxische ischemische stimulus, bekend als ischemische preconditionering (IPC), wordt beschouwd als een strategie in het opkomende gebied van neuroprotectie tegen ischemisch letsel [4-6].

Er zijn aanwijzingen dat door IPC gestimuleerde neuroprotectie afhankelijk is van transcriptie-, translatie- en post-translationele mechanismen, die de functie van sleuteleiwitten na ischemie veranderen [6-11]. Het mechanisme dat betrokken is bij IPC-geïnduceerde ischemische tolerantie (IT) is echter niet volledig opgehelderd in het menselijk brein [12,13].

De ontwikkeling van nieuwe experimentele benaderingen om IPC-gemedieerde neuroprotectie te begrijpen, is een krachtig hulpmiddel om de endogene mechanismen die ten grondslag liggen aan hersen-IT te ontcijferen [6], die het potentieel hebben om nieuwe therapeutische doelen te onthullen die gericht zijn op het minimaliseren van hersenbeschadiging bij patiënten met een beroerte. In de afgelopen twee decennia heeft apoptotische neuronale celdood zichzelf gepositioneerd als een essentieel mechanisme dat betrokken is bij cerebrale ischemische schade [14-16]. In die zin wordt proteïnekinase B of AKT, een serine/threoninekinase waarvoor een functionele fosfoinositidekinase (PI3K) moet worden geactiveerd, beschouwd als een essentieel doelwit voor neuroprotectieve therapieën na ischemie [17,18].

Onlangs hebben we aangetoond dat de remming van de PI3K/AKT-signaalroute de neuronale gevoeligheid voor excitotoxiciteit verhoogt [19]. AKT is betrokken bij een complex anti-apoptotisch signaleringsnetwerk [20], waarvan de componenten op verschillende subcellulaire locaties aanwezig kunnen zijn, afhankelijk van het weefseltype [21,22]. In het hart is AKT betrokken geweest bij preconditionering-bevorderde cardioprotectie [23].

Bewijs toont ook aan dat gefosforyleerde AKT neuronale overleving bevordert bij het begin van cerebrale ischemie [24]. Hoewel AKT-activering kan bijdragen aan de inductie van IT in de hersenen [25], blijft het exacte mechanisme van de IPC-gemedieerde activering ongrijpbaar. In tumorcellen leidt activering van de PI3K/AKT-signaalroute tot MDM2-fosforylering op Ser166/186, wat de nucleaire translocatie van MDM2 bevordert [26,27] en de alomtegenwoordige activiteit ervan verbetert [28].

In de kern bindt MDM2 aan p53 en bevordert de alomtegenwoordigheid en daaropvolgende proteasomale afbraak, wat de functie van p53 remt [29]. Onder stressomstandigheden zou p53 ook MDM2-overexpressie kunnen veroorzaken, wat omgekeerd p53-activering onderdrukt in een negatieve feedbacklus [30]. De remming van PI3K voorkomt AKT-activering [31] en MDM2-fosforylering in het gepreconditioneerde hart [32].

In deze context hebben we eerder ontdekt dat in vivo preconditionering van de hersenen het infarctvolume verminderde na voorbijgaande occlusie van de middelste cerebrale arterie (tMCAO) door de expressie van het MDM2-eiwitniveau te verhogen. Bijgevolg verzwakte het MDM2-p53-complex door ischemie geïnduceerde activering van de p53/PUMA/caspase-3-signaalroute in primaire corticale neuronen [33].

Hier gaan we dieper in op de rol van de PI3K/AKT-signaleringsroute in IPC-gemedieerde neuronale tolerantie tegen een daaropvolgende ischemische verwonding, evenals het onderliggende mechanisme, en we richten ons vooral op de mogelijke link tussen AKT-activering en het MDM2-p53-complex. .

2. Resultaten

2.1. IPC-bevorderde neuroprotectie

Wordt gemedieerd door fosforylering van AKT op Ser473, fosforylering van MDM2 op Ser166 en p53-destabilisatie We beschreven eerder de impact van MDM2-p53-interactie op neuronale gevoeligheid voor ischemie [34] en IT [33]. Hier hebben we de potentiële rol van AKT op IPC-gemedieerde neuroprotectie onderzocht als een kandidaat om betrokken te zijn bij de MDM2-p53-route.

Ten eerste hebben we bevestigd dat ischemie AKT-activering in neuronen bevorderde, zoals blijkt uit AKT-fosforylering op Ser473. Zoals weergegeven in figuur 1A, induceerde korte (20 min) OGD significant p (Ser473) AKT- en MDM2-expressie, terwijl AKT-eiwitniveaus ongewijzigd bleven (figuur S1A). AKT-fosforylering werd echter niet waargenomen wanneer neuronen werden onderworpen aan langdurige OGD (90 min). Bovendien waren de MDM2-eiwitniveaus lager, wat consistent is met de hogere expressie van p53-eiwit, zoals weergegeven in figuur 1A.

De tijdsafhankelijke opregulatie van Mdm2-expressie na OGD (Figuur 1B) bevestigt dat subacute ischemie belangrijk kan zijn om mechanismen te induceren die p53-stabilisatie na OGD voorkomen, zoals eerder beschreven [33]. We gebruikten korte OGD (20 min) gevolgd door 2 uur reoxygenatie als een model van IPC (Figuur S1B) [33]; dus analyseerden we neuronale extracten verzameld na 4 uur reoxygenatie na OGD (OGD / R) of na OGD voorafgegaan door het IPC-protocol (IPC plus OGD / R). Tegelijkertijd werden neuronen geïncubeerd in normoxia (Nx) of preconditioning (IPC) instellingen (Figuur S1B).

Zoals weergegeven in figuur 1C en figuur S1C, induceerde IPC de vroege activering van AKT, zoals onthuld door fosforylering op Ser473 [35], gevolgd door MDM2-eiwitstabilisatie en fosforylering op Ser166. IPC voorkwam ook p53-stabilisatie geïnduceerd door OGD/R (Figuur 1C). Interessant is dat immunofluorescentiebeelden getoond in figuur 1D onthulden dat IPC AKT-fosforylering bevorderde bij Ser473 in neuronen, die zich voornamelijk ophoopten in de kern, en verminderde p53-stabilisatie na OGD / R (IPC plus OGD / R) in vergelijking met niet-gepreconditioneerde neuronen (OGD /R).

Bijgevolg voorkwam IPC neuronale apoptose en caspase-3-activering veroorzaakt door OGD/R, zoals gemeten met respectievelijk flowcytometrie (Figuur S1D) en fluorimetrie-assays (Figuur S1E). Om de rol van p53 in IPC-gemedieerde neuroprotectie te bevestigen, gebruikten we neuronen die (wildtype; wt) of niet (knock-out; ko) p53-eiwit tot expressie brachten. Onze resultaten laten zien dat neuronen zonder p53 (Figuur S1F) resistenter waren tegen door OGD geïnduceerde apoptose dan p53 wt-neuronen.

Bovendien waren apoptoseniveaus in p53KO-neuronen vergelijkbaar met die waargenomen in gepreconditioneerde (IPC plus OGD / R) wt-neuronen (Figuur S1G), waarmee de sleutelrol van p53-destabilisatie in IPC-gemedieerde neuroprotectie wordt bevestigd [33]. Onze resultaten laten zien dat IPC neuroprotectie induceerde tegen een ischemische beschadiging door een mechanisme dat fosforylering van AKT bij Ser473, MDM2-stabilisatie en fosforylering bij Ser166 en p53-destabilisatie omvat.

2.2. IPC triggert MDM2-fosforylering op Ser166 via de PI3K/AKT-route

De PI3K/AKT-signaleringsroute is betrokken bij neuronale IT, zowel in vitro [36] als in vivo [37]. De rol van IPC-gemedieerde activering van de PI3K / AKT-route in de regulatie van het MDM2-p53-complex blijft echter onontgonnen. Om dit te verduidelijken, werden neuronen geïncubeerd met de onomkeerbare en specifieke remmer van de PI3K/AKT-route, wortmannin [19].

Zoals weergegeven in figuur 2A, heeft wortmannine IPC-versterkte (Ser473)AKT-fosforylering en p53-destabilisatie opgeheven, zoals weergegeven in figuur 1D. Deze resultaten suggereren een direct verband tussen AKT-activering en remming van p53-gemedieerde neuronale apoptose (Figuur S1D) en caspase-3-activering (Figuur S1E) geïnduceerd na OGD/R. De belangrijkste regulator van p53-stabilisatie, MDM2, is een doelwit van AKT [26], dat MDM2 fosforyleert op Ser166 en Ser186 [26]. PI3K-remming met wortmannine verhinderde de fosforylering van zowel (Ser473)AKT als (Ser166)MDM2 geïnduceerd door IPC (Figuur 2B).

De specifieke Akt-gemedieerde fosforylering van MDM2 op Ser166 geïnduceerd door IPC werd bevestigd door een klein interfererend RNA (siRNA) te gebruiken dat specifiek is ontworpen tegen AKT1-eiwit (siAkt), dat sterk tot expressie komt in corticale neuronen, en waarvan de activiteit essentieel is voor neuronale overleving na ischemie [ 38]. Zoals getoond in Figuur 3, verlaagde siAkt de totale AKT- en p(Ser473)AKT-eiwitniveaus op dag 3 na transfectie, zowel in HEK-293T-cellen (Figuur 3A) als in corticale neuronen (Figuur 3B).

Bovendien verhinderde AKT knockdown (siAkt) (Ser166) MDM2-fosforylering (Figuur 3B). Deze resultaten tonen aan dat de door IPC geactiveerde PI3K/AKT-signaleringsroute MDM2-fosforylering op Ser166 bevordert, wat mogelijk verantwoordelijk is voor MDM2-stabilisatie en de daaruit voortvloeiende p53-destabilisatie na ischemisch letsel.

2.3. IPC-geactiveerde AKT activeert nucleaire MDM2-eiwitstabilisatie na ischemie

De activering van AKT is betrokken geweest bij de nucleaire translocatie van MDM2 in tumorcellen [26]. Gezien de relevantie van nucleaire MDM2-stabilisatie voor neuronale overleving na ischemie [34] en, meer specifiek, de neuroprotectieve rol ervan bij IPC [33], hebben we besloten om de relevantie van de PI3K/AKT-signaalroute in de regulatie van subcellulaire lokalisatie van MDM2 verder te onderzoeken. eiwit.

Zo werden neuronen of HEK-293T-cellen getransfecteerd met menselijk MDM2-gelabeld eiwit (MDM2-GFP). Representatieve blots van getransfecteerde HEK-293T-cellen en afbeeldingen van neuronen die ectopisch menselijk MDM2-eiwit tot expressie brengen na vier verschillende experimentele omstandigheden (Nx, IPC, OGD/R en IPC plus OGD/R) worden weergegeven in afbeelding 4A en afbeelding S1H , respectievelijk.

Ectopische expressie van MDM2-GFP bevestigde dat IPC de nucleaire accumulatie van MDM2 bevordert in vergelijking met niet-geconditioneerde ischemische (OGD/R) of normoxische (Nx) neuronen (Figuur 4A, B), zoals blijkt uit de kwantificering van de nucleaire/cytosolische fluorescentieverhouding (Figuur S2B) en nucleaire fluorescentie-intensiteit van MDM2-GFP (Figuur S2C).

2.4. IPC bevordert p(Ser473)AKT- en MDM2-interactie, die MDM2-stabilisatie in de kern verbetert en geïnduceerde neuronale apoptose bij ischemie vermindert

Na de demonstratie van de rol van IPC-versterkte activering van de PI3K / AKT-route in de nucleaire stabilisatie van MDM2, hebben we verder onderzocht of p (Ser473) AKT en MDM2 in de kern een interactie aangingen (Figuur 6A). MDM2-immunoprecipitatie van nucleaire eiwitextracten, gevolgd door immunoblotting tegen MDM2 en p(Ser473)AKT, onthulde dat IPC de interactie tussen p(Ser473)AKT en MDM2 bevorderde, na OGD/R, waardoor OGD/R-geïnduceerde nucleaire p53-stabilisatie werd voorkomen, zoals weergegeven in de kerninvoer (Figuur 6A).

Ten slotte hebben we het nadelige effect bestudeerd van verstoring van de PI3K/AKT-route op neuronale apoptose (Figuur 6B). AKT-remming compenseerde het beschermende effect van IPC vóór OGD, wat de neuroprotectieve rol van AKT-MDM2 in de context van IT bevestigt. Onze resultaten tonen dus aan dat IPC fosforylering en activering van AKT induceert, wat MDM2-fosforylering bij Ser166 en nucleaire translocatie bevordert, waar het interageert met p (Ser473) AKT. Dit mechanisme kan bijdragen aan verbeterde nucleaire stabilisatie van MDM2, dat een essentiële rol speelt bij IPC-geïnduceerde ischemische tolerantie.

Hoe beschermt Cistanche neuronen?

Er zijn aanwijzingen dat Cistanche neuronen kan beschermen door apoptose (geprogrammeerde celdood) te verminderen en neuronale overleving te bevorderen. Apoptose is een natuurlijk proces dat in het lichaam plaatsvindt om beschadigde of ongewenste cellen te verwijderen, maar het kan schadelijk zijn als het buitensporig of ongepast gebeurt. In laboratoriumstudies is gevonden dat Cistanche apoptose remt, en dit effect kan helpen om neuronen tegen schade te beschermen.

Bovendien bevat Cistanche een aantal bioactieve stoffen waarvan is aangetoond dat ze neuroprotectieve effecten hebben. Het bevat bijvoorbeeld echinacoside, waarvan is aangetoond dat het neuronen beschermt tegen oxidatieve stress en ontstekingen. Het bevat ook acteoside, waarvan is vastgesteld dat het ontstekingsremmende en antioxiderende eigenschappen heeft.

Wordt vervolgd...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 en Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Instituut voor Functionele Biologie en Genomica, Universiteit van Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spanje; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (camper); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Instituut voor Biomedisch Onderzoek van Salamanca, Universitair Ziekenhuis van Salamanca, Universiteit van Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spanje

3 Afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie, Universiteit van Salamanca, 37007 Salamanca, Spanje 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spanje * Correspondentie: mdesteban@usal.es ; Tel.: plus 34-923-29-4908