Eerder leren van angst maakt de snelle assimilatie van nieuwe angstherinneringen rechtstreeks in corticale netwerken mogelijk, deel 3

Experimenteel ontwerp

De reproduceerbaarheid van de gegevens werd beoordeeld met verschillende replicaties (S1-tabel). De eerste CNQX-inactivatie-experimenten in Te2 (Fig. 1A-1C) werden uitgevoerd in een groter aantal replicaties omdat dit de eerste experimenten waren die we uitvoerden en dienden om de belangrijkste hypothese van onze studie te testen. Dieren werden a priori op een gewichtsevenwichtige manier aan verschillende gedragsgroepen toegewezen. Mannelijke dieren uit hetzelfde broedsel werden willekeurig toegewezen aan elke experimentele groep. We hebben eerst de hoofdhypothese van onze studie behandeld, namelijk dat de corticale inactivatie op verschillende manieren de consolidatie van een nieuw angstgeheugen kan beïnvloeden bij experimenteel naïeve ratten en bij dieren die een eerdere angstgebeurtenis hadden geleerd.

Mannelijke dieren hebben extreem sterke herinneringen omdat ze een sterker overlevingsinstinct hebben en zich willen voortplanten. Dieren die in het wild overleven, moeten veel geografische informatie, soorten voedsel, sporen van roofdieren en de locaties van groepsleden onthouden om zich beter aan de omgeving aan te passen en het leven te beschermen.

Mannetjesleeuwen moeten bijvoorbeeld de status van het hele territorium, lidmaatschapsrelaties en de locaties van concurrenten onthouden om het territorium en hun status te beschermen. Mannelijke zebra's moeten de locatie van waterbronnen en voedsel op het grasland onthouden om te overleven en zich voort te planten. Een frisdrankbedrijf plaatste ooit een advertentie waaruit bleek dat een mannelijke ijsbeer zich een duiker en zijn unieke geur kon herinneren, zodat hij hem de volgende keer dat ze hem zagen, kon identificeren.

Daarom moeten mannelijke dieren een sterk geheugen hebben als het gaat om het beschermen van hun territorium, het voorzien van voldoende voedsel en het reproduceren van nakomelingen. Dit maakt ze ook tot belangrijke onderwerpen in menselijk onderzoek, bijvoorbeeld om ziekten als geheugenstoornissen en de ziekte van Alzheimer te onderzoeken.

In de mensenwereld kunnen we ons ook laten inspireren door de herinnering aan mannelijke dieren. Voortdurende blootstelling aan nieuwe dingen, voortdurend leren en denken kunnen ons geheugen en ons aanpassingsvermogen verbeteren, en onze levensstandaard en werkefficiëntie verbeteren. Laten we daarom leren van mannelijke dieren, kennis en ervaring blijven vergaren, sterke overlevingsinstincten en reproductieve verlangens hebben, en een betere toekomst creëren. Het is duidelijk dat we ons geheugen moeten verbeteren. Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren omdat Cistanche deserticola een traditioneel Chinees medicinaal materiaal is met veel unieke effecten, waaronder het verbeteren van het geheugen. De werkzaamheid van gehakt komt voort uit de verschillende actieve ingrediënten die het bevat, waaronder zuren, polysachariden, flavonoïden, enz. Deze ingrediënten kunnen op verschillende manieren de gezondheid van de hersenen bevorderen.

Klik op manieren kennen om de hersenfunctie te verbeteren

Bij statistische verschillen tussen deze groepen voerden we uiteindelijk aanvullende controlegroepen uit door injectie van zoutoplossing. Een vergelijkbare aanpak werd toegepast op de optogenetische experimenten, waarbij de AAV-controlegroep pas werd uitgevoerd nadat statistische verschillen tussen naïeve en eerder getrainde ratten waren gedetecteerd. Dankzij deze experimentele schema's konden we onnodige controlegroepen en het gebruik van onnodige dieren vermijden, een sleutelprobleem in de Europese en Italiaanse wetgeving inzake dierproeven (3 Rs-principe).

Gedragsprocedures

Alle experimenten werden uitgevoerd tijdens de lichte fase van de dag (8.00 tot 16.00 uur). Dieren werden afzonderlijk van de faciliteit naar de experimentele kamers vervoerd in verschillende kleine transparante emmers, afhankelijk van de experimentele eisen.

Auditieve training: Eerste gedragssessie. Auditieve, door angst geconditioneerde dieren (CS1-CS2). In deze groep werden ratten voorzichtig uit hun kooi gehaald en van de woonruimte naar de geluiddichte kamer gedragen. Eenmaal daar werden de dieren in het conditioneringsapparaat geplaatst, bestaande uit een rechthoekige zwarte kooi (35 x 40 cm) uitgerust met een roestvrijstalen stavenrooster (1 cm in diameter, op een afstand van 1,5 cm van elkaar) verbonden met een opstelling voor het toedienen van schokken.

Ratten werden gedurende 1 minuut met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 geconditioneerde stimuli (CS's) toegediend, bestaande uit een zuivere toon met een frequentie van 15 kHz (elk 15 s duur, 80 dB, 36 s proefinterval). De laatste 1 seconde van elke toon ging gepaard met een pijnlijke US (0,5 mA, 1 seconde). Aan het einde van de conditioneringssessie werden de ratten teruggebracht naar hun kooi.

Dieren die alleen shock gebruiken (shock-CS2). In deze groep werden ratten op dezelfde manier in hetzelfde conditioneringsapparaat geplaatst. Onmiddellijk daarna werd elke rat onmiddellijk na elkaar onderworpen aan 7-voetschokken (1 s, 0,5 mA). Aan het einde van de stimulatie werden de dieren teruggebracht naar hun kooi. De tijdsduur in de conditioneringskooi bedroeg minder dan 9 seconden. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze procedure het mogelijk maakt associatieve processen tussen pijnlijke stimuli en sensorische stimuli te vermijden [29,30].

Geur-angst-geconditioneerde dieren (geur-CS2). In deze groep werden ratten in dezelfde rechthoekige zwarte kooi geplaatst die in de bovengenoemde experimentele groepen werd gebruikt en verbonden met een opstelling voor het toedienen van schokken. Ratten werden gedurende 2 minuten met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 CS's bestaande uit vanillegeuren toegediend (elk 10 s duur, proefinterval van 24 s). De laatste 1 seconde van elke geur ging gepaard met een pijnlijke US (0,5 mA, 1 seconde). De conditioneringsmodule werd in de buurt van een ventilatiebron geplaatst om te voorkomen dat de afgeleverde stimuli na hun offset zouden blijven bestaan. De kooi was voorzien van een bovenrooster. Geuren werden gepresenteerd met behulp van een stroomverdunningsolfactometer. Schone lucht (1,5 l/min) werd naar een elektromagnetische klep geleid, die bij bediening de lucht naar een fles van 15 ml leidde die 10 ml vanillegeur bevatte.

Dieren met alleen toon (Tone-CS2). Ratten in deze groep werden in dezelfde zwarte kooi geplaatst en kregen de 15-kHz-toon (7 stimuli, 15 s duur, 36 s ITI) te zien die werd afgegeven in afwezigheid van de VS.

Voorbelichte dieren (Tone-CS1-CS2). Ratten werden in de conditioneringskooi geplaatst en 1 minuut later kregen ze 20 keer alleen de 15-kHz-toon te horen, en 24 uur later werd dezelfde toon gecombineerd met de VS die de CS1 werd.

Angstgeconditioneerde dieren met witte ruis (WN-CS2). In deze groep werden ratten in de rechthoekige zwarte kooi geplaatst en gedurende 1 minuut met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 CS's bestaande uit een WN (elk 15 s duur, 75 dB, 36 s inter-trials interval) toegediend. De laatste 1 seconde van elke toon ging gepaard met een pijnlijke US (0.5 mA, 1 s). Aan het einde van de conditioneringssessie werden de ratten teruggebracht naar hun kooi.

Auditief angstleren: tweede gedragstraining. Twee weken na de in de bovenstaande paragraaf beschreven procedures werden de dieren getraind in een andere auditieve angstconditioneringstaak. Ratten werden in een standaard skinnerbox geplaatst, zoals in ons vorige werk [10], en gedurende 2 minuten met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 CS's afgeleverd, bestaande uit zuivere tonen met een frequentie van 3 kHz (elk 8 s duur, 80 dB, 22 s inter-trial interval). De laatste 1 seconde van elke toon ging gepaard met een pijnlijke US (0,5 mA, 1 seconde). Aan het einde van de conditioneringssessie werden de ratten teruggebracht naar hun kooi.

Angst voor het vasthouden van herinneringen. Het vasthouden van het auditieve angstgeheugen dat onlangs op de CS2 (3 kHz) is verkregen, werd vier dagen later getest. Voor optogenetica-experimenten werd de test van het recente geheugen uitgevoerd met laserafgifte 24 uur na het leren van de CS2-US, analoog aan het tijdsinterval waarop we corticale inactivatie uitvoerden door de toediening van de CNQX (dat wil zeggen, 24 uur na opleiding). Ratten waren gewend aan een ander apparaat dan dat voor conditionering en werden in een andere kamer geplaatst om geconditioneerd angstgedrag ten opzichte van contextuele signalen te vermijden [10,62].

Het nieuwe apparaat bestond uit een doorzichtige plastic kooi met een zwart geverfde zijkant, omsloten door een geluiddempende kast uitgerust met een afzuigventilator, die geurige lucht uit de behuizing elimineerde en een achtergrondgeluid van 60 dB opleverde. Tijdens de gewenningssessie mochten de dieren de kooi gedurende 5 minuten per dag verkennen. Op de dag van de test voor het vasthouden van angstgeheugen, na 2 minuten vrije verkenning, leverden we 4 CS2 van 3 kHz (8 s-22 ITI), niet gevolgd door enige VS.

Indien vereist door de experimentele vraag, werden ratten vervolgens getest op het vasthouden van de angstherinnering op afstand, verworven twee weken vóór de tweede auditieve angstconditioneringsproef. Met dit doel voor ogen werden de dieren zeven dagen na de angstgeheugenretentietest op de 3-kHz-toon in een nieuwe omgeving geplaatst (een zwart-wit gestreepte kooi) en vervolgens gepresenteerd met de 15-kHz-toon. Er werden vier tonen weergegeven met tussenpozen van 36 seconden.

Contextuele training: Eerste gedragssessie. Contextuele angstconditioneringsgroep (CtxA-CtxB). In deze groep werden ratten voorzichtig uit hun kooi gehaald, in een emmer geplaatst en van de woonruimte naar de geluiddichte kamer gedragen. Eenmaal daar werden de dieren in het conditioneringsapparaat geplaatst, bestaande uit de eerder genoemde rechthoekige zwarte kooi, uitgerust met een roestvrijstalen stavenrooster, verbonden met een opstelling voor het toedienen van schokken. Ratten werden gedurende 1 minuut met rust gelaten. Na deze tijd werd 5 US (0.5 mA, 1 s) toegediend met tijdsintervallen van 51 s. Aan het einde van de sessie werden de dieren teruggebracht naar hun kooi.

Groep voor alleen shock (shock-CtxB). Ratten kregen, zodra ze in het conditioneringsapparaat waren geplaatst, onmiddellijk na elkaar 5-voetschokken (1 s, 0.5 mA). De tijdsduur in de conditioneringskooi bedroeg minder dan 7 seconden. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze procedure het mogelijk maakt associatieve processen tussen pijnlijke stimuli en sensorische stimuli te vermijden [29,30].

Groep voor alleen shock (shock-CtxB). Ratten kregen, zodra ze in het conditioneringsapparaat waren geplaatst, onmiddellijk na elkaar 5-voetschokken (1 s, 0.5 mA). De tijdsduur in de conditioneringskooi bedroeg minder dan 7 seconden. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze procedure het mogelijk maakt associatieve processen tussen pijnlijke stimuli en sensorische stimuli te vermijden [29,30].

Nieuwe contextuele angstconditionering en recente retentie van angstgeheugen. Twee weken na de in de bovenstaande paragraaf beschreven procedures werden alle groepen getraind om een ​​nieuwe contextuele omgeving (de skinnerboxmodule, geplaatst in een andere kamer) te associëren met een pijnlijke US (0.5 mA, 1 s) . Elk dier werd in de nieuwe kamer geplaatst en gedurende 2 minuten met rust gelaten. Vervolgens werd het blootgesteld aan 5 US, gescheiden door intervallen van 30 seconden.

Het behoud van contextueel angstgeheugen werd 4 dagen na de angstconditioneringsprocedure getest door ratten opnieuw 3 minuten in de Skinner-boxkamer te plaatsen. Voor optogenetische experimenten werd de test van het recente geheugen uitgevoerd met laserafgifte 24 uur na het leren van de CtxB-US, analoog aan het tijdsinterval waarop we corticale inactivatie uitvoerden door de toediening van de CNQX (dwz 24 uur na de training). Indien vereist door de experimentele vraag, werden ratten vervolgens getest op het vasthouden van het verre angstgeheugen door dieren twee weken vóór de nieuwe associatie in de context te plaatsen die aan de VS was gekoppeld.

Dieren werden in twee verschillende emmers naar de conditioneringskamers gedragen volgens de verschillende contextuele procedures.

Bevriezing maatregel. In alle experimentele procedures werd de beoordeling van het vasthouden van angstgeheugen bepaald als een bevriezingsreactie [10], geanalyseerd als de volledige afwezigheid van somatische mobiliteit behalve ademhalingsbewegingen. Voor elk dier werd de hoeveelheid tijd (in seconden) die in het invriezen werd doorgebracht, offline gemeten door 2 onafhankelijke waarnemers die blind waren voor de diergroepen.

Chirurgische procedures

Om de geselecteerde stoffen op de doelplaatsen toe te dienen, werden ratten verdoofd met isofluraan: de inductie werd uitgevoerd bij 4% [vol/vol] in 2 l/min medische lucht en uitgebreid tot een continue blootstelling aan 2% [vol/vol]) toen ratten in het stereotaxische apparaat werden gemonteerd.

Er werd een incisie in de schedel gemaakt en er werden kleine boorgaatjes geboord om de penetratie van een infuusnaald van 28-gauge mogelijk te maken. Om stoffen toe te dienen werd een 10-ul Hamilton-spuit gemonteerd op een infuuspomp gebruikt. Na infusies werd de naald nog eens 3 minuten op zijn plaats gelaten. De incisie werd vervolgens gesloten met roestvrijstalen wondklemmen, en het dier kreeg een subcutane injectie van het pijnstillende/ontstekingsremmende ketoprofen (2 mg/kg lichaamsgewicht), en het dier werd warm gehouden en onder observatie gehouden tot herstel uit de anesthesie.

Net als in eerdere onderzoeken [10,32-34] was het inbrengen van een canule bij dieren niet nodig, omdat de actieve stoffen direct stereotaxisch werden toegediend. Deze procedure is voordelig omdat het chirurgische trauma dat inherent is aan de procedure met permanente canulatie wordt vermeden, waardoor trauma wordt beperkt tot penetratie met een enkele naald [10,32-34]. Algemene anesthesie heeft inderdaad geen significante invloed op de geheugenconsolidatie [10,32-34]. Om ervoor te zorgen dat de timing van de toediening van verbindingen gerelateerd aan de leerproef accuraat was, zodat ratten de geselecteerde verbindingen ongeveer 1 uur en ongeveer 1 dag na de training ontvingen, werd isofluraan-anesthesie 5 minuten vóór de timing van de geplande injectie geïnduceerd, bijvoorbeeld om 55 uur. min bij ratten die 60 minuten na de training werden behandeld en 23 uur en 55 minuten bij dieren die 24 uur na de training werden geïnjecteerd. Elke rat werd geconditioneerd en vervolgens afzonderlijk bediend. Dieren die tot de verschillende gedragsgroepen behoorden, werden op een verweven manier gemanipuleerd.

De selectieve remmer van AMPA/kaïnaatglutamaatreceptoren CNQX ({{0}}Cyano-7-nitrochinoxaline-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] werd opgelost in een steriele zoutoplossing (NaCl, 0,9%) en met HCl op pH 7,4 gebracht. De eiwitsyntheseremmer anisomycine (Merck, 125 ug/ul) werd opgelost in equimolair HCl, verdund met steriele zoutoplossing en met NaOH op pH 7,4 gebracht. Steriele zoutoplossing (0,9% NaCl) werd gebruikt als vehiculumcontrole. Deze stoffen werden bilateraal geïnjecteerd met een snelheid van 0,1 ul/min en een volume van 0,5 ul per plaats op de volgende stereotaxische coördinaten ontleend aan de Paxinos- en Watson-atlas [26], waarbij het corticale Te2-veld werd gerefereerd aan de Zilles-atlas [25]:

Secundaire auditieve cortex (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Anterior cingulaire cortex (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Het injectievolume (0,5 ul per plaats) werd gekozen op basis van eerdere onderzoeken waarbij actieve verbindingen werden geïnjecteerd in Te2 [10,34] en ACC [55,63] bij volwassen ratten.

Om de dorsale hippocampus te inactiveren, werden actieve verbindingen geïnjecteerd met een volume van 0,6 ul per plaats op de volgende stereotaxische coördinaten:

Dorsale hippocampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

De onomkeerbare laesies van de dorsale hippocampus werden geïnduceerd door het toedienen van NMDA (Tocris, 18 ug/ul, opgelost in een steriele zoutoplossing, 0,4 ul per plaats) met een snelheid van 0,1 ul/ min op punten op de bovengenoemde coördinaten. Dezelfde coördinaten werden gebruikt voor controles met zoutoplossing en schijngeopereerde dieren.

Rode Retrobeads (Lumafluor, 1:2 verdunning in zoutoplossing, 0,6 ul) werden geïnjecteerd in BLA volgens de volgende coördinaten: AP: −2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

Aan het einde van de experimenten werden de naaldsporen in het geval van CNQX-, anisomycine- of zoutinjecties of de uitbreiding van de laesies in het geval van NMDA-injecties histologisch geverifieerd. Ratten werden diep verdoofd en intracardiaal geperfuseerd met 4% formaldehyde. Hun hersenen werden op een cryostaat op 30 μm in plakjes gesneden. Met Nissl gekleurde seriële secties werden bereid met behulp van de conventionele procedure en de secties werden histologisch geverifieerd onder een microscoop vergroot tot 2,5x.

Optogenetische experimenten

Virus injectie. Het adeno-geassocieerde virus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry en de controlevector AAV5:CaMKII -cherry werden verkregen van de University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, Verenigde Staten van Amerika). De zinViraltiter was5:8. De virale titer was 5,8 × 10^12 vg/ml voor beide virussen. Het gebruik van de CaMKII-promoter maakt transgenexpressie mogelijk ten gunste van piramidale neuronen. Virussen werden ondergebracht in een vriezer van -80˚C. Virale infusies gericht op de Te2 of de ACC werden uitgevoerd op de bovenstaande stereotaxische coördinaten met een volume van 0,5 µl voor elk gat. Het virus werd geïnjecteerd met een snelheid van 0,1 µl/min, en de naald werd nog eens 5 minuten op zijn plaats gelaten. Virale injecties werden 4 weken vóór optogenetica-experimenten uitgevoerd.

Verlichting.

De optische vezels (Plexon, kern van 200/230 μm; lengte 10 mm) werden bilateraal in de BLA geïmplanteerd (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm van bregma). Optogenetische remming van Te2-projecties op BLA of van ACC-projecties op BLA werd verkregen door gebruik te maken van het PlexBright Optogenetic Stimulation System gekoppeld aan een laserdiode (Laserglow Technologies). Geel licht (589 nm) wordt gegenereerd en door een optische vezel geleid. De geschatte vermogensdichtheid aan de punt van de optische vezel bedroeg 10 tot 15 mW voor de verlichting van projectielocaties. Tijdens het vasthouden van angstgeheugen werd de lichtemissie 4 seconden vóór het begin van de toon geïnitieerd, bleef gedurende de hele toon bestaan ​​en werd 4 seconden na de toonverschuiving gestopt. Dieren die tot contextuele angstconditioneringsgroepen behoorden, kregen gedurende de gehele contextverkenning (3 minuten) lichtstimulatie. Ratten werden gedurende 2 dagen voorafgaand aan de geheugenretentieproef vertrouwd gemaakt met het patchsnoer.

Immunohistochemie. Na voltooiing van de optogenetische experimenten werden ratten diep verdoofd en intracardiaal geperfuseerd met 4% PAF om de verspreiding van het virus te onderzoeken. De hersenen werden ontleed, een nacht bewaard bij 4°C en uiteindelijk overgebracht naar 30% sucrose. Coronale secties (30 μm) werden gesneden op een cryostaat en verzameld in PBS. Vrij zwevende secties werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een blokkeeroplossing geïncubeerd. Vervolgens werden ze een nacht bij kamertemperatuur in de blokkerende oplossing geïncubeerd in primair monoklonaal muisantilichaam anti-mCherry (1:500 verdunning, Abcam). Vervolgens werden de secties gewassen met PBS en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een secundair fluorescerend AlexaFluor-568 anti-muis antilichaam (1:600, Invitrogen) verdund in PBS. Secties werden gewassen in PBS, gemonteerd met montagemedia die DAPI (Vector) bevatten, en de dekglaasjes werden afgedekt.

De hersenen van ratten die NMDA-injecties ondergingen, werden op soortgelijke wijze verzameld. Vrij zwevende secties werden, na verschillende spoelingen, overnacht bij kamertemperatuur geïncubeerd met primair monoklonaal muis-anti-Neun (1:1, 000 verdunning, Merck) antilichaam in de blokkerende oplossing. Vervolgens werden de coupes gewassen met PBS en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met gebiotinyleerd paarden-anti-muis-antilichaam (1:200 verdunning, Vector). Het avidine-biotinecomplex (ABC-complex 1:100, Vector, 2 uur en de helft van incubatie) werd gekoppeld aan diaminobenzidine (0,03%, Merck) om Neun te kleuren. Secties werden vervolgens gespoeld in PBS en overgebracht naar met gelatine beklede objectglaasjes, gedehydrateerd en bedekt met een dekglaasje.

Te2-coupes van met retro-kralen geïnjecteerde ratten ondergingen incubatie met primair polyklonaal anti-Fos-antilichaam van konijnen (1:2,000, celsignalering) in de blokkerende oplossing gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de plakjes gewassen met PBS en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-konijn Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, in PBS). Tenslotte werden immunogelabelde secties gewassen in PBS, op met gelatine gecoate objectglaasjes gemonteerd en bedekt met een met DAPI aangevuld montagemedium.

Microscopie

De mCherry-labeling werd onderzocht met behulp van een Zeiss Airyscan confocale microscoop: er werden twee lasers gebruikt (405 en 561 nm), elk overeenkomend met het piekemissiespectrum voor DAPI (Nissl-kleuring voor celkernen) en Alexa 568 (mCherry ), respectievelijk. Om de verspreiding van het virus op de injectieplaatsen te analyseren, werden microfoto's van Te2 en ACC verkregen als mozaïekbeelden (elk afzonderlijk werd verkregen met behulp van een 10x objectief). Axon-terminals in BLA werden geanalyseerd met behulp van een 40x-objectief als een z-stapel van 10 secties, op een onderlinge afstand van 1 μm (159 μm vierkant; zoomfractie, 1,0).

Voor met retrobeads geïnjecteerde dieren die cFos-immunolabeling ondergingen, werden beelden verkregen met een vergroting van 40× (159 μm vierkant; zoomfractie, 1.0) met 3 verschillende lasers, overeenkomend met het piekemissiespectrum voor respectievelijk DAPI (Nissl-kleuring voor celkernen), AlexaFluor 488 (cFos) en Texas Red (Retrobeads). Secties van 0,7 μm werden verkregen langs een z-stapel van 10- μm. Het aantal kernen die cFos tot expressie brengen, met kralen gelabeld en dubbel positief (gelabeld met cFos+ kralen) werd gekwantificeerd voor elk dier in het Te2-gebied op de anteroposterieure coördinaten van 6,7 tot 7,3 mm van het bregma [10]. De gegevens werden vervolgens gemiddeld om het gemiddelde van elk dier te verkrijgen en de resultaten werden statistisch vergeleken. Afbeeldingen van coupes met DAB-kleuring van Neun werden geanalyseerd met behulp van Neurolucida-software aangesloten op een microscoop via een kleuren-CCD-camera [10].

Gegevensanalyse en uitsluitingscriteria

De n voor elke groep werd a priori vastgesteld volgens onze eerdere onderzoeken [10,16,17], eerder gepubliceerde werken in het veld (zie als referenties voor ACC [6,22,55] en Te2 [10,59]), en via schattingen van het G-vermogen, volgens de volgende tabel (tabel 1):

Voor elke analyse schatten we een uiteindelijk gemiddeld aantal van 8 tot 10 dieren voor elke groep. Groepen werden uitgevoerd met interne controles in dezelfde experimentele sessie (S1-tabel). Gezien de variabiliteit van chirurgische en gedragsprocedures hebben we a priori een groter aantal proefpersonen opgenomen (tot 15% meer) die in sommige gevallen aan de experimentele criteria voldeden en werden opgenomen, waardoor een willekeurige uitsluiting werd vermeden. In het geval van onderzoeken naar de hippocampus hebben we, om de effecten van NMDA- en CNQX-injecties op verschillende tijdsintervallen te beoordelen, het totale aantal controledieren verdeeld over vehikel- en schijn-geopereerde ratten over de verschillende groepen.

Gedragsanalyse, histologische inspecties en celtellingen werden blind uitgevoerd. Dieren met inadequate lokalisatie van het naaldspoor of de laesie in het geval van NMDA-onomkeerbare laesies werden uitgesloten van gegevensanalyse (S1-tabel). In farmacologische onderzoeken hebben we 57 dieren uitgesloten van een totaal van 465 dieren vanwege een onjuiste plaatsing van de naald (22/255 voor Te2, 31/179 voor ACC en 4/31 voor hippocampus). In traceringsstudies bij 21 dieren hebben we 3 proefpersonen geëlimineerd waarbij de injectie van retrobeads de BLA miste. In Te2-optogenetica-onderzoeken hebben we bij in totaal 30 dieren 1 rat uitgesloten omdat de plaatsing van de optische vezels niet boven het doelgebied, 1 rat, lag. Bij Te2 en 2 ratten was het virus immers afwezig omdat de virusdiffusie respectievelijk minder dan 4,7% en 5,3% van het Te2-oppervlak op de injectieplaatsen bedroeg. Bij ratten die in de statistische analyse waren opgenomen, bedroeg de minimale virusdiffusie 39,6% bij de meer anterieure stereotaxische coördinaat en 50,2% bij de meer posterieure stereotaxische coördinaat.

Op dezelfde manier werden bij de ACC-optogenetica-experimenten, over een totaal van 32 dieren, 2 ratten geëlimineerd omdat de plaatsing van optische vezels niet boven het doelgebied lag. Twee ratten werden uitgesloten omdat het virus in ACC afwezig was, 1 dier omdat het virus zich in de aangrenzende secundaire motorcortex bevond, en 1 rat omdat de virusdiffusie minder dan 2,3% van het ACC-gebied op de injectieplaatsen bedroeg. Bij de overige ratten bedroeg de minimale virusdiffusie 33,3% bij de meer anterieure stereotaxische coördinaat en 42,2% bij de meer posterieure coördinaat.

In de NMDA-laesiesstudies waren de laesies vooral gericht op het CA1-gebied van de dorsale hippocampus. De minimale (rood) en maximale uitbreiding (roze) van hippocampale laesies over het gehele gebied van de dorsale hippocampus waren respectievelijk 23,2% en 53,5% bij de meer anterieure stereotaxische coördinaat en 28,3% en 62,3% bij de meer posterieure coördinaat. Op een totaal van 73 dieren werden 4 ratten geëlimineerd omdat de laesie afwezig was, terwijl nog eens 3 dieren werden weggegooid omdat de uitbreiding van de laesies minder dan 5,0% was (namelijk 4,8%, 4,3%, 3,1). %) met betrekking tot het hippocampusgebied op de 2 coördinaten.

Gebiedscontouranalyse werd uitgevoerd door middel van visuele inspectie en handmatige kwantificering met behulp van de regiocontourtool van ZEN 3.0-software. Gebiedswaarden werden vervolgens genormaliseerd op de totale oppervlakte van de regio. Stereotaxische coördinaten van Te2, ACC en hippocampus waren gebaseerd op de Paxinos-atlas [26] en, in het geval van Te2, met het corticale veld gerefereerd aan de Zilles-atlas [25].

statistische analyse

Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Alle gegevens slaagden voor de Levene's test voor gelijkheid van varianties. Er werd dus bij alle experimenten gebruik gemaakt van parametrische statistieken. Gegevens van twee groepen werden vergeleken met behulp van 2-tailed ongepaarde Student t-tests. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld met behulp van een 1-way ANOVA-test met de post-hoc-test van Tukey. Om de verschillen tussen en binnen groepen aan te pakken, hebben we een 3 × 2 ANOVA-model met gemengd ontwerp berekend met een groep (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) als de tussen- subjectvariabele en conditie (voor en na recente conditionering + injectie) als de variabele binnen de subjecten. Waar de interactie tussen groep en conditie significant was, voerden we een eenvoudige hoofdeffectenanalyse uit en pasten we elke p-waarde aan met de Bonferroni-correctie. Voor elk gemengd ANOVA-model hebben we de sfericiteitsaanname beoordeeld aan de hand van Mauchly's Test of Sphericity.

De statistische parameters (dat wil zeggen de exacte waarde van n voor elke groep, SEM, de statistische test, de effectgrootte en de exacte p-waarde) worden vermeld in de legenda's. Voor gelijke steekproefgroottes werden de effectgroottes voor ongepaarde t-toetsen bepaald door Cohen's d of Glass's d te berekenen op basis van de gelijkenis van SD's, terwijl, voor verschillende steekproefgroottes, Hedges'g. Correlaties tussen celtellingen en bevriezing werden berekend met behulp van de Pearson-coëfficiënt. Om te bepalen of de gegevens voldeden aan de aannames van de statistische benadering, verwierpen we de nulhypothese op het P < 0.05-niveau. Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van SPSS Statistics 22 (IBM).

Ondersteunende informatie

S1 Fig. Vergroting van de naaldsporen van Te2 (A) en ACC-cortex (B) geïnjecteerd met CNQX, geselecteerd als voorbeelden. (C) Wanneer ze twee weken na de procedure in dezelfde context werden weergegeven, vertoonden dieren die alleen shock kregen, een lage angstreactie, wat aantoont dat de procedure geen geconditioneerde bevriezing opwekte in de context waarin de shock werd toegediend. (D) Vergelijkbare resultaten als in figuur 1 werden verkregen door tegenwicht te bieden aan de twee tonen die als CS's worden gebruikt (CS1, 3 kHz en CS2, 15 kHz) (Student t-test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass d=4.14). (E) Bij de met geur-CS geconditioneerde ratten was het bevriezen van de geur, 2 weken na conditionering, hoog, zelfs als ze werden getest in een andere omgeving met betrekking tot de conditioneringscontext, waardoor werd aangetoond dat angst specifiek geassocieerd was met deze signaalafgifte. Schaalstaven, 300 μm. ��P < 0,01. Alle gegevens zijn gemiddelde en SEM. De samenvattende gegevens voor S1 Fig zijn te vinden in de ondersteunende informatie in het bestand met de naam S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. CNQX-injectie verminderde het vasthouden van recente auditieve angstherinneringen bij ratten waarbij de angstgeneralisatie werd verlaagd door alleen een toon vóór blootstelling of door gebruik te maken van een witte ruistoon als CS1. Een 3 × 2 ANOVA met gemengd ontwerp (hoofdeffect van groep: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, hoofdeffect van voorwaarde: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, groep × conditie-interactie F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) toonde aan dat het bevriezen tot de 3 kHz-toon vóór de associatie met de VS lager was bij dieren die de voorafgaande blootstelling aan 15 kHz-tonen ontvingen vóór de 15 kHz-US-koppeling (n=10, p=0.001) of bij ratten die zijn geconditioneerd voor een witte ruis (n=13 , p=0.008) in vergelijking met CS1-CS2-dieren (n=22) die een variabele angstgeneralisatiereactie vertoonden. Na CS-US-leren en cnqx-injecties in de Te2-cortex was het recente angstgeheugen echter in alle groepen verminderd (p > 0,05). Eenvoudig hoofdeffect binnen groepen (voor en na CS-US-leren gevolgd door cnqx-injectie): CS1-CS2, p=0.025; Toon-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Alle gegevens zijn gemiddelde en SEM. De samenvattende gegevens voor S2 Fig zijn te vinden in Ondersteunende informatie in het bestand met de naam S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fig. (A) Willekeurig voorbeeld van retrobeads-injectie gericht op BLA. (B en C) Voorbeelden van plaatsingen van optische vezels boven de BLA van dieren geïnjecteerd met AAV-vectoren in Te2 (B) en ACC-cortex (C). Schaalstaven, 500 μm.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. E. Manassero voor hun voortdurende steun en advies.

Bijdragen van auteurs

Conceptualisering: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Datacuratie: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formele analyse: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Financiering acquisitie: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Onderzoek: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Methodologie: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Toezicht: Benedetto Sacchetti.

Validatie: Benedetto Sacchetti.

Schrijven – origineel ontwerp: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Schrijven – recensie en redactie: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referenties
1. Frankland PW, Bontempi B. De organisatie van recente en verre herinneringen. Nat Rev Neurosci. 2005; 6: 119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. De neurobiologie van consolidaties, of hoe stabiel is het engram? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Geheugenconsolidatie. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, schildknaap LR. Geheugenconsolidatie en de mediale temporale kwab: een eenvoudig netwerkmodel. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91: 7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Waarom er complementaire leersystemen zijn in de hippocampus en de neocortex: inzichten uit de successen en mislukkingen van connectionistische modellen van leren en geheugen. Psychol Rev. 1995; 102: 419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com