Eerder leren van angst maakt de snelle assimilatie van nieuwe angstherinneringen rechtstreeks in corticale netwerken mogelijk, deel 2

Voorafgaand contextueel leren van angst zorgt ervoor dat de voorste cingulaire cortex onmiddellijk nieuwe herinneringen kan coderen

Tot nu toe hebben we de dynamiek van systeemconsolidatie in auditieve angstherinneringen onderzocht. Het model van systeemconsolidatie komt echter grotendeels voort uit onderzoeken naar hippocampusafhankelijk geheugen.

Auditieve angst is een veel voorkomend psychologisch probleem dat een grote impact kan hebben op het dagelijks leven van mensen. Wanneer auditieve fobie optreedt, kunnen mensen zich erg ongemakkelijk voelen en zelfs verschillende gezondheidsproblemen veroorzaken. Maar tegelijkertijd zijn er ook experimenten die bewijzen dat auditieve angst ook het geheugen kan verbeteren.

De afgelopen jaren hebben onderzoekers ontdekt dat mensen met een auditieve fobie aandachtiger en gevoeliger zijn dan anderen. Hun hersenen reageren sterker en sneller op geluidsstimulatie. Deze reactie maakt ze gevoeliger voor de geluiden in hun leven. In sommige gevallen zijn ze beter in staat een verscheidenheid aan informatie te verwerken en zelfs nuttigere aanwijzingen uit de geluiden te halen, waardoor hun algehele geheugen mogelijk wordt verbeterd.

Wanneer een persoon zich in een gespannen of angstige emotionele toestand bevindt, geven de hersenen een stof af die adrenaline wordt genoemd. Deze stof kan de activiteit van hersenneuronen bevorderen en de concentratie van mensen verhogen. Daarom leidt het vrijkomen van adrenaline tijdens een auditieve angsttoestand tot een grotere concentratie en geheugen bij de luisteraar.

Tegelijkertijd kunnen de hersenen, wanneer de auditieve angststimulus aanhoudt, zich aan deze stimulus aanpassen door een diepere herinnering aan het geluid op te bouwen. Dit geheugen kan patiënten helpen beter te reageren op verschillende geluidsstimuli, waardoor ze zelfverzekerder en onafhankelijker worden.

Hoewel auditieve angst veel ongemakken kan veroorzaken in het dagelijks leven van mensen, kan het daarom ook een positieve invloed hebben op het geheugen. Wanneer mensen leren omgaan met dit psychologische probleem, kunnen ze hun angsten overwinnen en er zelfs voordeel uit halen. Dit herinnert ons er ook aan dat we psychologische problemen correct moeten bekijken, aandacht moeten besteden aan de geestelijke gezondheid en een positieve houding moeten gebruiken om met moeilijkheden om te gaan om ons leven te verbeteren. Het is duidelijk dat we ons geheugen moeten verbeteren. Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche deserticola ook de balans van neurotransmitters kan reguleren, zoals het verhogen van de niveaus van acetylcholine en groeifactoren. Deze stoffen zijn erg belangrijk voor het geheugen en het leren. Bovendien kan vlees ook de bloedstroom verbeteren en de zuurstoftoevoer bevorderen, wat ervoor kan zorgen dat de hersenen voldoende voedingsstoffen en energie krijgen, waardoor de vitaliteit en het uithoudingsvermogen van de hersenen worden verbeterd.

Klik op supplementen kennen om het geheugen te verbeteren

Er wordt aangenomen dat deze herinneringen aanvankelijk zowel op het hippocampale als op het corticale niveau worden gevormd. In de loop van de tijd leidt de gecoördineerde wisselwerking tussen de hippocampus en corticale netwerken tot een geleidelijke hermodellering van corticale circuits die uiteindelijk herinneringen op afstand opslaan [1–5]. In lijn hiermee zijn bij naïeve dieren hippocampaal-afhankelijke angstherinneringen, namelijk contextuele angstherinneringen, aanvankelijk afhankelijk van de hippocampus en worden ze geleidelijk afhankelijk van een corticaal netwerk dat de ACC en de prefrontale cortex omvat [1,2,6–8 ].

We hebben dus overwogen of deze tijdsafhankelijke reorganisatie anders plaatsvond als systeemconsolidatie van een eerder geheugen eerder had plaatsgevonden. Ratten werden getraind om de context met de VS te associëren. Twee weken eerder had één groep ratten een ander verband geleerd tussen een andere context en de VS (CtxA-CtxB), terwijl een andere groep alleen onmiddellijke pijnlijke stimuli ontving die het leren van contextuele angst belemmerden (shock-CtxB) (S1A Fig). Dieren werden 24 uur na contextueel leren geïnjecteerd met CNQX of zoutoplossing in de ACC (Fig. 4A en S1B).

In lijn met eerdere studies [1,6,8] liet de inactivatie van ACC bij dieren die geen andere angstassociatie hadden geleerd, de bevriezing van de CtxB eerder onaangetast, wat suggereert dat deze manipulatie het recente geheugen niet beïnvloedde. Echter, vergelijkbaar met de gegevens verkregen bij het leren van auditieve angst, verminderde inactivatie van de ACC de bevriezing tot de recente CtxB bij ratten die eerder een contextuele angstassociatie hadden geleerd (Fig. 4B en 4C).

Dit fenomeen hield causaal verband met de ontwikkeling van de langzame systeemconsolidatie van de eerste herinnering, omdat het afwezig was bij dieren waarbij de twee angstgebeurtenissen slechts 7 of 24 uur van elkaar gescheiden waren, en bij dieren waarbij de ACC 24 uur na beide gebeurtenissen werd geïnactiveerd. eerste en tweede contextueel leren van angst. Bovendien was het afwezig bij ratten die de verkenning van de eerste context ervoeren in afwezigheid van enige US (Context-CtxB-groep) (Fig. 4D en 4E).

Cruciaal is dat de inactivatie van de ACC die 1 uur na het leren werd uitgevoerd, ook het recente angstgeheugen beïnvloedde (Fig. 4F en 4G). Op dit tijdstip verminderde de toediening van anisomycine de bevriezing van de CtxB bij dieren die eerder contextueel angstleren hadden ervaren (Fig. 4H en 4I). Deze gegevens ondersteunen het idee dat, zodra een eerste angstgebeurtenis in het geheugen is opgeslagen, de neocortex onmiddellijk essentieel wordt voor nieuwe herinneringen, door alleen gebruik te maken van de synaptische consolidatiemechanismen.

Voorafgaand contextueel angstleren reorganiseert ACC-naar-BLA-projecties zodat ze recente herinneringen ondersteunen

We onderzochten vervolgens of de neurale connectiviteit die wordt gerekruteerd tijdens geheugenretentie op afstand bij naïeve dieren ook kan deelnemen aan de recente geheugenretentie bij dieren die eerder een ander contextueel angstgeheugen hadden geleerd. Daartoe hebben we de betrokkenheid onderzocht van projecties van de ACC naar de BLA bij het vasthouden van recente en verre contextuele herinneringen.

Een eerdere studie toonde aan dat optogenetische remming van axon-uiteinden geprojecteerd van de prefrontale cortex naar de BLA de retentie van contextueel angstgeheugen op afgelegen maar niet recente tijdstippen bij naïeve dieren verstoorde [7]. De adeno-geassocieerde virale vector (AAV5-CaMKIIa-eNpHR3.0-mCherry) of de controlevector (AAV5-CaMKIIa-mCherry) werden in 2 groepen in de ACC geïnjecteerd, zoals in de hierboven beschreven experimenten (figuren 5A – 5C en S3C). Optogenetische remming van ACC-terminals in de BLA tijdens de recente contextuele angst voor geheugenretentie verminderde het bevriezen van de CtxB alleen bij dieren die waren geïnjecteerd met eNpHR3.0-mCherry-vector en die eerder een duidelijke context-Amerikaanse associatie hadden geleerd (Fig. 5D ).

In deze groep veroorzaakte de daaropvolgende remming van ACC-terminals in de BLA ook een significante afname van het bevriezen van de CtxA, wat suggereert dat dit ook het behoud van de verre context-Amerikaanse associatie beïnvloedde (Fig. 5E). Deze resultaten ondersteunen het idee dat hetzelfde neurale pad essentieel is voor het vasthouden van de verre herinnering aan de eerste angstgebeurtenis en recente herinneringen aan nieuwe analoge gebeurtenissen. Deze gegevens suggereren ook dat de herschikking van corticale routes die afdalen naar de BLA, geïnduceerd door de eerste herinnering, een veel voorkomend proces is voor zowel auditieve als contextuele angstherinneringen.

Na eerder angstleren zijn de dorsale hippocampus en de ACC beide noodzakelijk voor de vorming van nieuwe herinneringen

Deze bevindingen werpen de vraag op of de hippocampus nieuwe herinneringen vormt, zelfs als er eerder contextueel angstleren heeft plaatsgevonden. Als alternatief kan de cortex nieuwe herinneringen vormen, zelfs als de hippocampus afwezig is. Om deze vragen te beantwoorden, hebben we de hippocampus 1 uur na contextueel angstleren geïnactiveerd in 2 groepen, vergelijkbaar met de bovenstaande experimenten.

Omdat het grootste deel van de literatuur over systeemconsolidatie afkomstig is uit onderzoeken waarbij de hippocampus permanent werd vernietigd, zijn we begonnen met het onomkeerbaar beschadigen van de dorsale hippocampus 1 uur na het leren (Fig. 6A–6C). Laesies in de hippocampus veroorzaakten in beide groepen een significante afname van de bevriezing van de CtxB (figuur 6C). Omdat excitotoxische laesies tijdelijk de activiteit van hersengebieden buiten de hippocampus, zoals de ACC, kunnen verstoren, herhaalden we dit experiment door de dorsale hippocampus te inactiveren met CNQX om lokale AMPA-glutamaatreceptoren te blokkeren en vonden we amnesische effecten in beide groepen (Fig. 6D en 6E). ).

Deze resultaten toonden aan dat de hippocampus noodzakelijk is voor de vorming van nieuwe contextuele herinneringen, ongeacht of er eerder angstleren heeft plaatsgevonden. Samen met de bovenstaande resultaten duiden deze gegevens er ook op dat bij dieren die een eerdere contextuele angstgebeurtenis hebben geleerd, zowel de hippocampus als de ACC nodig zijn om recente angstherinneringen te vormen, en dat geen van deze locaties op zichzelf geheugenvorming kan ondersteunen als er geen angst is. van het andere.

Vervolgens onderzochten we het tijdsverloop van de betrokkenheid van de hippocampus door de laesie van de hippocampus uit te stellen tot 1 week na het leren. In lijn met eerdere bevindingen [46] beïnvloedden laesies in de hippocampus nog steeds de geheugenvorming bij dieren die nooit eerder andere angstassociaties hadden geleerd. Omgekeerd hadden hippocampale laesies in de groep die een eerdere angstgebeurtenis hadden geleerd geen invloed op het geheugenretentie (Fig. 6F en 6G), wat suggereert dat een eerdere angstherinnering het tijdsbestek van hippocampale betrokkenheid verkort (van 2 weken naar 1 week), aangezien ook waargenomen voor ruimtelijk leren [3,20,21].

Discussie

In de huidige studie hebben we ontdekt dat eerdere systeemconsolidatie van een auditief angstgeheugen de Te2 in staat stelt onmiddellijk een nieuw auditief angstgeheugen te coderen via synaptische consolidatie. Bovendien worden de dalende projecties van de Te2 naar BLA die werden geactiveerd tijdens de consolidatie van eerder geleerde kennis noodzakelijk bij de vorming van nieuwe auditieve angstherinneringen.

Soortgelijke resultaten werden waargenomen bij hippocampusafhankelijk contextueel angstleren. In deze laatste taak ontdekten we ook dat eerder leren de duur van de betrokkenheid van de hippocampus bij recent contextueel angstleren verkort. Alles bij elkaar suggereren onze bevindingen dat eerder leren de hersencircuits reorganiseert, zodat nieuwe analoge informatie onmiddellijk in corticale structuren wordt geleerd.

Het huidige concept van systeemconsolidatie van hippocampus-afhankelijke herinneringen gaat ervan uit dat de hippocampus op een in de tijd beperkte manier betrokken is en dat er in de loop van de tijd een geleidelijk proces van reorganisatie van de hersencircuits plaatsvindt, zodat corticale netwerken steeds belangrijker worden [1-5].

Hoewel er ook alternatieve theorieën bestaan ​​[47], ondersteunen talrijke onderzoeken de tijdelijk beperkte rol van de hippocampus in geheugenprocessen in zowel menselijke als dierlijke modellen [1-3]. Integendeel, de reorganisatie van hersencircuits die het geheugen in de loop van de tijd ondersteunen, is vooral aangetoond in diermodellen, terwijl het bewijsmateriaal bij mensen controversiëler is [3].

Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat de activiteit van de hippocampus tijdens het ophalen van herinneringen bij mensen geleidelijk afneemt in de loop van weken en maanden, terwijl de activiteit in het ventrale mediale prefrontale gebied [48], in de temporale neocortex [49], of de connectiviteit tussen corticale gebieden [48] aanzienlijk toenam. Integendeel, recentere onderzoeken hebben aangetoond dat hoewel de activiteit van de hippocampus afnam naarmate de tijd verstreek, de corticale activiteit in de loop van de tijd stabiel bleef [50] of ook afnam [51]. Meer consistent bewijs over de reorganisatie van hersencircuits die het geheugen in de loop van de tijd ondersteunen, werd verkregen bij dieren [1-3]. Deze onderzoeken werden uitgevoerd op experimenteel naïeve dieren.

Door dit probleem te onderzoeken bij dieren die eerder een angstherinnering hebben gevormd, ontdekten we dat de hippocampus noodzakelijk is voor de vorming van nieuwe herinneringen, ongeacht of er eerder angst heeft geleerd. De reorganisatie van hersencircuits die door het eerste leerproces wordt teweeggebracht, stelt de neocortex echter in staat om onmiddellijk nieuwe herinneringen te coderen, eenvoudigweg via cellulaire mechanismen van synaptische consolidatie. Dit fenomeen is van toepassing op zowel hippocampus-afhankelijke als -onafhankelijke angstherinneringen en werd specifiek veroorzaakt door de langzame systeemconsolidatie die werd veroorzaakt door de initiële leergebeurtenis.

Het was afwezig bij ratten waar de twee leerproeven tijdelijk dicht bij elkaar lagen (een paar uur of één dag) en bij ratten waar corticale inactivatie na de eerste leergebeurtenis de herschikking van de cortex en de daaropvolgende betrokkenheid bij de snelle assimilatie van nieuwe leerprocessen uitsloot. herinneringen. Bovendien zijn de paden die van de cortex naar de BLA afdalen, zodra het eerste angstleren de connectiviteit van de hersenen heeft gereorganiseerd, niet alleen noodzakelijk voor het vasthouden van verre herinneringen, zoals bij naïeve ratten, maar ook voor recente herinneringen. We concluderen dat als een analoog geheugen eerder is gecodeerd, de reorganisatie van hersencircuits al heeft plaatsgevonden en mogelijk niet langer nodig is voor de vorming van nieuwe herinneringen, die omgekeerd de cortex en zijn wisselwerking met subcorticale plaatsen onmiddellijk betrekken.

Ondanks het grote aantal onderzoeken dat de tijdsafhankelijke reorganisatie van hersencircuits bij naïeve dieren aantoont, is het exacte doel van dit proces nog lang niet gedefinieerd. Omdat de gedragsreacties die verband houden met het geheugen in de loop van de tijd vergelijkbaar kunnen blijven, wordt aangenomen dat dit proces de geheugenstabiliteit in de loop van de tijd verbetert [1,2,52]. Op basis van onze bevindingen stellen we voor dat, wanneer een angstgebeurtenis voor de eerste keer plaatsvindt, de hersencircuits een langdurig reorganisatieproces ondergaan, zoals beschreven in het systeemconsolidatiemodel. Dit proces kan dienen om de neurale netwerken die angstgeheugen permanent opslaan te herschikken, zodat ze onmiddellijk nieuwe analoge informatie kunnen verwerven via synaptische consolidatiemechanismen. Dit werkingsmechanisme kan het nieuwe leren 'economischer' maken, omdat het de uitgaven aan middelen voor het verwerven van nieuwe gerelateerde informatie kan verminderen, waardoor er meer middelen vrijkomen voor het leren van nieuwe, niet-gerelateerde informatie.

Een belangrijke vraag die uit onze bevindingen naar voren komt is of eerder leren de neurale netwerken permanent verandert, zodat soortgelijke ervaringen onmiddellijk in de neocortices kunnen worden opgeslagen, zelfs als ze zich met zeer lange tijdsintervallen voordoen. Als alternatief zou het kunnen zijn dat het systeem wordt teruggezet naar het oorspronkelijke niveau van naïeve dieren als er niet snel nieuwe soortgelijke ervaringen plaatsvinden. Experimenten die de betrokkenheid van de neocortex met toenemende tijdsintervallen tussen het eerste en het tweede leerproces beoordelen, zullen dit punt verduidelijken.

We ontdekten ook dat de blokkade van de neocortex tijdens de vroege consolidatie van een eerste ervaring de onmiddellijke toewijzing van nieuwe soortgelijke ervaringen aan de neocortex verhinderde (zie figuren 1F en 4D). Deze resultaten suggereren dat cellulaire processen die plaatsvinden onmiddellijk na het eerste leren binnen de neocortex noodzakelijk zijn voor de rekrutering ervan in het consolidatieproces van het systeemgeheugen. Dit idee komt overeen met de bevindingen dat sommige "gelabelde" cellen binnen de neocortex worden geactiveerd bij het leren bij naïeve dieren en dienen voor de opslag van verre maar niet recente herinneringen [7,8,12,44]. Toekomstige studies zijn nodig om te verduidelijken of deze cellen deze rol ook spelen na eerder geleerd te hebben, of dat ze ook deelnemen aan de vorming van recente herinneringen.

Oorspronkelijk leidde het model van systeemconsolidatie tot het aanvullende idee dat de hippocampus nieuwe informatie snel leert, terwijl de neocortex deze langzaam leert, maar latere studies hebben aangetoond dat de neocortex ook in staat is tot snelle leerprocessen [3,20,21,53]. Onze gegevens toonden aan dat twee verschillende cortices (Te2 en ACC) onmiddellijk nieuwe informatie kunnen leren als zich eerder een soortgelijke gebeurtenis heeft voorgedaan.

Volgens onze eerdere onderzoeken [10,16,17,34,43,45] gebruiken we de term Te2 om te verwijzen naar het meest posterieure gebied van het auditieve gebied van de riem dat, gebaseerd op de onderzoeken van Zilles [24,25], voornamelijk bestaat uit de temporele associatie en de ectorinale gebieden. Hoewel we niet kunnen uitsluiten dat onze resultaten bijdragen van medicijneffecten ook in omliggende gebieden weerspiegelen, namelijk de aangrenzende visuele cortex, primaire auditieve cortex en perirhinale cortex, suggereren de gegevens die we bij naïeve dieren hebben verkregen dat deze voornamelijk te wijten waren aan de inactivatie van Te .

We ontdekten dat bij naïeve dieren de Te2 noodzakelijk was voor verre maar niet recente auditieve herinneringen, terwijl inactivatie van de aangrenzende visuele cortex de auditieve herinneringen op afstand onaangetast liet [10]. Omgekeerd verminderde een gecombineerde blokkade van de primaire en Te2-cortices ook het recente geheugen [34]. Op dezelfde manier verminderde de inactivatie van de voorste perirhinale cortex de angstherinneringen [32,54], terwijl de inactivatie van de achterste perirhinale cortex geen invloed had op recente [54] en verre [10] angstherinneringen.

Ook in het geval van ACC en contextuele angstherinneringen had de inactivatie van de aangrenzende primaire en secundaire motorcortex geen invloed op recente en verre herinneringen [55], terwijl de inactivatie van de aangrenzende prelimbische cortex zowel recente als verre herinneringen aantastte [11].

Wat betreft de rol die deze cortex speelt in geheugenprocessen, neemt Te2 deel aan het memoriseren van de emotionele waarde in combinatie met geluiden [10,13,16,56]. Dit idee is onlangs ook gedemonstreerd in de visuele cortex van hogere orde [57,58]. Aan de andere kant kan de ACC herinneringen vormen en opslaan, maar ook de activiteit van andere corticale gebieden moduleren [1–3,6].

Ondanks het grote aantal onderzoeken dat aantoont dat Te2 en ACC noodzakelijk zijn voor verre maar niet recente herinneringen, meldden enkele recente onderzoeken dat deze cortex ook nodig kan zijn voor het vasthouden van recente auditieve [34,59] en contextuele [55] angstherinneringen. De precieze randvoorwaarden die de noodzaak van deze cortex voor recente herinneringen kunnen bepalen, worden slecht begrepen.

Eén van deze onderzoeken suggereerde dat de intensiteit van de emotionele ervaring een belangrijke rol zou kunnen spelen [34], maar toekomstige onderzoeken zouden dit probleem beter moeten aanpakken. Toekomstige studies zullen ook moeten verduidelijken of de cellen die worden geactiveerd in de neocortex bij het leren bij naïeve dieren, en die dienen voor de opslag van verre maar niet recente herinneringen [7,8,12,44], deze rol ook spelen na eerdere studies. leren, of dat ze deelnemen aan de vorming van recente herinneringen.

Wat betreft de deelname van de hippocampus aan geheugenprocessen hebben we hier ontdekt dat de dorsale hippocampus noodzakelijk is voor het leren van nieuw contextueel geheugen, zelfs als eerder contextueel leren heeft plaatsgevonden. Een soortgelijk resultaat werd waargenomen door een ontwerp binnen de proefpersonen uit te voeren op ratten die zowel verre als recente contextuele herinneringen leerden [60]. Aan de andere kant is ook aangetoond dat de cellulaire mechanismen die het daaropvolgende leren in de hippocampus mediëren, kunnen verschillen van de mechanismen die betrokken waren tijdens het voorafgaande leerproces [22,61].

We ontdekten ook dat bij dieren die voor het eerst contextuele angst ervoeren, de hippocampus ook 1 week na het leren nodig is, in lijn met een eerdere bevinding bij naïeve dieren [46]. Omgekeerd hadden hippocampale laesies in de andere groep geen invloed op het geheugenretentie in dit tijdsinterval, wat erop wijst dat eerder leren door angst het tijdsbestek van betrokkenheid van de hippocampus verkort, zoals ook waargenomen bij ruimtelijk leren [3,20,21]. Deze onderzoeken en de huidige leveren daarom convergerend bewijs dat het tijdsvenster van het temporale geheugenverlies veroorzaakt door hippocampale laesies afhangt van de eerder geleerde ervaringen in zowel ruimtelijke als emotionele herinneringen.

In die onderzoeken stelden de auteurs ook voor dat het trainen van ratten voor een langere periode in een ruimtelijke taak een ‘mentaal’ kennisschema oplevert, waarin nieuwe gerelateerde informatie snel kan worden geassimileerd [3,20,21,53]. Hoewel onze bevindingen ook consistent kunnen zijn met dit idee, is het erg moeilijk te zeggen of een proef van het leren van angst een associatief ‘schema’ van kennis kan vormen en of een nieuwe en andere gebeurtenis die zich in een andere omgeving voordoet, binnen dit schema kan worden geïntegreerd. . Verdere studies zijn nodig om dit probleem op te helderen. Hoe dan ook, aangezien de meeste herinneringen bij mensen en andere dieren zijn gebaseerd op ervaringen uit het verleden, kunnen de hersennetwerken die voor het eerst angstherinneringen op afstand opslaan, netwerken zijn die zowel recente als verre angstherinneringen gedurende het hele leven coderen.

Methoden experimenteel model en onderwerpdetails

Dieren

Gezonde mannelijke Wistar-ratten (leeftijd, 65 tot 70 dagen; gewicht, 250 tot 350 g, wildtype), afkomstig van een interne dierenfaciliteit, werden gehuisvest met 3 per kooi, waarbij voedsel en water ad libitum beschikbaar waren, onder een licht van 12 uur. /donkere cyclus (licht aan om 7:00 AM) bij een constante temperatuur van 22 ± 1˚C. Alle experimenten werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (autorisatie nr. 408/2020-PR) en door de plaatselijke bio-ethische commissie van de Universiteit van Turijn.

Experimenteel ontwerp

De reproduceerbaarheid van de gegevens werd beoordeeld met verschillende replicaties (S1-tabel). De eerste CNQX-inactivatie-experimenten in Te2 (Fig. 1A-1C) werden uitgevoerd in een groter aantal replicaties omdat dit de eerste experimenten waren die we uitvoerden en dienden om de belangrijkste hypothese van onze studie te testen. Dieren werden a priori op een gewichtsevenwichtige manier aan verschillende gedragsgroepen toegewezen.

Mannelijke dieren uit hetzelfde broedsel werden willekeurig aan elke experimentele groep toegewezen. We hebben eerst de hoofdhypothese van onze studie behandeld, namelijk dat de corticale inactivatie op verschillende manieren de consolidatie van een nieuw angstgeheugen kan beïnvloeden bij experimenteel naïeve ratten en bij dieren die een eerdere angstgebeurtenis hadden geleerd. Bij statistische verschillen tussen deze groepen voerden we uiteindelijk aanvullende controlegroepen uit door injectie van zoutoplossing. Een vergelijkbare aanpak werd toegepast op de optogenetische experimenten, waarbij de AAV-controlegroep pas werd uitgevoerd nadat statistische verschillen tussen naïeve en eerder getrainde ratten waren gedetecteerd. Dankzij deze experimentele schema's konden we onnodige controlegroepen en het gebruik van onnodige dieren vermijden, een sleutelprobleem in de Europese en Italiaanse wetgeving inzake dierproeven (3 Rs-principe).

Gedragsprocedures

Alle experimenten werden uitgevoerd tijdens de lichte fase van de dag (8.00 tot 16.00 uur). Dieren werden afzonderlijk van de faciliteit naar de experimentele kamers vervoerd in verschillende kleine transparante emmers, afhankelijk van de experimentele eisen.

Auditieve training: Eerste gedragssessie.

Auditieve, door angst geconditioneerde dieren (CS1-CS2). In deze groep werden ratten voorzichtig uit hun kooi gehaald en van de woonruimte naar de geluiddichte kamer gedragen. Eenmaal daar werden de dieren in het conditioneringsapparaat geplaatst, bestaande uit een rechthoekige zwarte kooi (35 x 40 cm) uitgerust met een roestvrijstalen stavenrooster (1 cm in diameter, op een afstand van 1,5 cm van elkaar) verbonden met een schoktoediening. opgericht. Ratten werden gedurende 1 minuut met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 geconditioneerde stimuli (CS's) toegediend, bestaande uit een zuivere toon met een frequentie van 15 kHz (elk 15 s duur, 80 dB, 36 s proefinterval). De laatste 1 seconde van elke toon ging gepaard met een pijnlijke US (0,5 mA, 1 seconde). Aan het einde van de conditioneringssessie werden de ratten teruggebracht naar hun kooi.

Dieren die alleen shock gebruiken (shock-CS2). In deze groep werden ratten op dezelfde manier in hetzelfde conditioneringsapparaat geplaatst. Onmiddellijk daarna werd elke rat onmiddellijk na elkaar onderworpen aan 7-voetschokken (1 s, 0,5 mA). Aan het einde van de stimulatie werden de dieren teruggebracht naar hun kooi. De tijdsduur in de conditioneringskooi bedroeg minder dan 9 seconden. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze procedure het mogelijk maakt associatieve processen tussen pijnlijke stimuli en sensorische stimuli te vermijden [29,30].

Geur-angst-geconditioneerde dieren (geur-CS2). In deze groep werden ratten in dezelfde rechthoekige zwarte kooi geplaatst die in de bovengenoemde experimentele groepen werd gebruikt en verbonden met een opstelling voor het toedienen van schokken. Ratten werden gedurende 2 minuten met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 CS's bestaande uit vanillegeuren toegediend (elk 10 s duur, proefinterval van 24 s). De laatste 1 seconde van elke geur ging gepaard met een pijnlijke US (0,5 mA, 1 seconde). De conditioneringsmodule werd in de buurt van een ventilatiebron geplaatst om te voorkomen dat de afgeleverde stimuli na hun offset zouden blijven bestaan. De kooi was voorzien van een bovenrooster. Geuren werden gepresenteerd met behulp van een stroomverdunningsolfactometer. Schone lucht (1,5 l/min) werd naar een elektromagnetische klep geleid, die bij bediening de lucht naar een fles van 15 ml leidde die 10 ml vanillegeur bevatte.

Dieren met alleen toon (Tone-CS2). Ratten in deze groep werden in dezelfde zwarte kooi geplaatst en kregen de 15-kHz-toon (7 stimuli, 15 s duur, 36 s ITI) te zien die werd afgegeven in afwezigheid van de VS.

Voorbelichte dieren (Tone-CS1-CS2). Ratten werden in de conditioneringskooi geplaatst en 1 minuut later kregen ze 20 keer alleen de 15-kHz-toon te zien, en 24 uur later werd dezelfde toon gecombineerd met de VS die de CS1 werd.

Angstgeconditioneerde dieren met witte ruis (WN-CS2). In deze groep werden ratten in de rechthoekige zwarte kooi geplaatst en gedurende 1 minuut met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 CS's bestaande uit een WN (elk 15 s duur, 75 dB, 36 s inter-trials interval) toegediend. De laatste 1 seconde van elke toon ging gepaard met een pijnlijke US (0.5 mA, 1 s). Aan het einde van de conditioneringssessie werden de ratten teruggebracht naar hun kooi.

Auditief angstleren: tweede gedragstraining.

Twee weken na de in de bovenstaande paragraaf beschreven procedures werden de dieren getraind in een andere auditieve angstconditioneringstaak. Ratten werden in een standaard skinnerbox geplaatst, zoals in ons vorige werk [10], en gedurende 2 minuten met rust gelaten. Na deze tijd werden 7 CS's afgeleverd, bestaande uit zuivere tonen met een frequentie van 3 kHz (elk 8 s duur, 80 dB, 22 s inter-trial interval). De laatste 1 seconde van elke toon ging gepaard met een pijnlijke US (0,5 mA, 1 seconde). Aan het einde van de conditioneringssessie werden de ratten teruggebracht naar hun kooi.

Angst voor het vasthouden van herinneringen. Het vasthouden van het auditieve angstgeheugen dat onlangs op de CS2 (3 kHz) is verkregen, werd vier dagen later getest. Voor optogenetica-experimenten werd de test van het recente geheugen uitgevoerd met laserafgifte 24 uur na het CS2-US-leren, analoog aan het tijdsinterval waarop we corticale inactivatie uitvoerden door de toediening van de CNQX (dwz 24 uur na opleiding). Ratten waren gewend aan een ander apparaat dan dat voor conditionering en werden in een andere kamer geplaatst om geconditioneerd angstgedrag ten opzichte van contextuele signalen te vermijden [10,62]. Het nieuwe apparaat bestond uit een doorzichtige plastic kooi met een zwart geverfde zijkant, omsloten door een geluiddempende kast uitgerust met een afzuigventilator, die geurige lucht uit de behuizing elimineerde en een achtergrondgeluid van 60 dB opleverde. Tijdens de gewenningssessie mochten de dieren de kooi gedurende 5 minuten per dag verkennen. Op de dag van de test voor het vasthouden van angstgeheugen, na 2 minuten vrije verkenning, leverden we 4 CS2 van 3 kHz (8 s-22 ITI), niet gevolgd door enige VS.

Indien vereist door de experimentele vraag, werden ratten vervolgens getest op het vasthouden van de angstherinnering op afstand, verworven twee weken vóór de tweede auditieve angstconditioneringsproef. Met dit doel voor ogen werden de dieren zeven dagen na de angstgeheugenretentietest op de 3-kHz-toon in een nieuwe omgeving geplaatst (een zwart-wit gestreepte kooi) en vervolgens gepresenteerd met de 15-kHz-toon. Er werden vier tonen weergegeven met tussenpozen van 36 seconden.

Contextuele training: Eerste gedragssessie.

Contextuele angstconditioneringsgroep (CtxA-CtxB). In deze groep werden ratten voorzichtig uit hun kooi gehaald, in een emmer geplaatst en van de woonruimte naar de geluiddichte kamer gedragen. Eenmaal daar werden de dieren in het conditioneringsapparaat geplaatst, bestaande uit de eerder genoemde rechthoekige zwarte kooi, uitgerust met een roestvrijstalen stavenrooster, verbonden met een opstelling voor het toedienen van schokken. Ratten werden gedurende 1 minuut met rust gelaten. Na deze tijd werd 5 US (0.5 mA, 1 s) toegediend met tijdsintervallen van 51 s. Aan het einde van de sessie werden de dieren teruggebracht naar hun kooi.

Groep voor alleen shock (shock-CtxB). Ratten kregen, zodra ze in het conditioneringsapparaat waren geplaatst, onmiddellijk na elkaar 5-voetschokken (1 s, 0.5 mA). De tijdsduur in de conditioneringskooi bedroeg minder dan 7 seconden. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze procedure het mogelijk maakt associatieve processen tussen pijnlijke stimuli en sensorische stimuli te vermijden [29,30].

Dieren met alleen context (context-CtxB). Ratten werden gedurende 5 minuten in dezelfde zwarte kooi geplaatst als gebruikt in de bovenstaande experimenten zonder de toediening van enige US.

Nieuwe contextuele angstconditionering en recente retentie van angstgeheugen. Twee weken na de in de bovenstaande paragraaf beschreven procedures werden alle groepen getraind om een ​​nieuwe contextuele omgeving (de skinnerboxmodule, geplaatst in een andere kamer) te associëren met een pijnlijke US (0.5 mA, 1 s) . Elk dier werd in de nieuwe kamer geplaatst en gedurende 2 minuten met rust gelaten. Vervolgens werd het blootgesteld aan 5 US, gescheiden door intervallen van 30 seconden.

Het behoud van contextueel angstgeheugen werd 4 dagen na de angstconditioneringsprocedure getest door ratten opnieuw 3 minuten in de Skinner-boxkamer te plaatsen. Voor optogenetische experimenten werd de test van het recente geheugen uitgevoerd met laserafgifte 24 uur na het leren van de CtxB-US, analoog aan het tijdsinterval waarop we corticale inactivatie uitvoerden door de toediening van de CNQX (dwz 24 uur na de training). Indien vereist door de experimentele vraag, werden ratten vervolgens getest op het vasthouden van het verre angstgeheugen door dieren twee weken vóór de nieuwe associatie in de context te plaatsen die aan de VS was gekoppeld.

Dieren werden in twee verschillende emmers naar de conditioneringskamers gedragen volgens de verschillende contextuele procedures.

Bevriezing maatregel. In alle experimentele procedures werd de beoordeling van het vasthouden van angstgeheugen bepaald als een bevriezingsreactie [10], geanalyseerd als de volledige afwezigheid van somatische mobiliteit behalve ademhalingsbewegingen. Voor elk dier werd de hoeveelheid tijd (in seconden) die in het invriezen werd doorgebracht, offline gemeten door 2 onafhankelijke waarnemers die blind waren voor de diergroepen.

For more information:1950477648nn@gmail.com