Beschermende effecten en mechanismen van procyanidinen op de ziekte van Parkinson in vivo en in vitro, deel 2

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

2.7.Effecten van pc's op oxidatieve stress van zebravis-larae behandeld met MPTP

Behandeling van zebravislarven met pc's verminderde MPTP-geïnduceerde verhoogde intracellulaire ROS-vorming (Figuur 7a, b). Bovendien toonden de resultaten van de lipideperoxidatietest aan dat pc-blootstelling （16 ug/mL） de MPTP-geïnduceerde MDA-niveaus in zebravislarven blokkeerde (Figuur 7c). Bovendien werd de MPTP-geïnduceerde reductie in GSH-Px-activiteit ongedaan gemaakt door PC-16 ug/mL） behandeling (Figuur 7d) en PCs（4,8 en 16 ug/mL） verhoogde MPTP-geïnduceerde afnames in CAT en SOD activiteit (Figuur 7e, f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Klik hier voor meer informatie

2.8. Effecten van pc's op Nr2/ARE Patlhroay in MPTP-geïnduceerde zebravis Laroa

Behandeling van zebravislarven met pc's onderstreepte het uitgangspunt dat activering van Nr2 / ARE-routes betrokken was bij pc-gemedieerde beschermende eigenschappen. De expressie van Nrf2-, HO -1-, NQO1-, GCLC- en GCLM-markers werd opgereguleerd door pc-behandeling in vergelijking met alleen MPTP-blootstelling (Figuur 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Discussie

Pc's vertonen een sterk vermogen om radicalen op te ruimen en antioxiderende activiteit, en oxidatieve stress, veroorzaakt door de overmatige vorming van ROS en/of het aangetaste antioxidantafweersysteem, speelt een cruciale rol bij PD[37-39]. Het blijft echter onduidelijk of pc's een neuroprotectieve rol kunnen spelen door middel van antioxiderende effecten. Dit onderzoek was gericht op het onderzoeken van het moleculaire mechanisme van pc's tegen MPP plus / MPTP-geïnduceerde PD-modellen.

Cistanche kan de immuniteit verbeteren

In deze studie verhoogden pc's, vergeleken met de MPP plus / MPTP-alleen-groep, het activiteitsniveau van antioxidante enzymen (inclusief GSH-Px, CAT en SOD) en verlaagden ze de niveaus van ROS en MDA. De huidige bevindingen komen overeen met een eerdere studie die suggereert dat een laag PC-supplement via de voeding de activiteiten van GSH-Px, CAT en SOD bij gespeende biggen verbetert [40]. Een andere studie suggereert ook dat pc's de CAT- en SOD-activiteiten aanzienlijk verhogen en het MDA-gehalte verlagen, waardoor de kwaliteit van geitensperma verbetert [41]. Deze bevindingen suggereren dat pc's een beschermend effect hebben op oxidatieve schade aan zenuwcellen. Bovendien verbeterden pc's de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de MPP plus-alleen-groep in MPP plus-geïnduceerde PC12-cellen, aanzienlijk grotere totale afstand bewogen en verminderde TH plus-celdichtheid ten opzichte van de MPTP-groep in MPTP-geïnduceerde zebravislarven. Deze gegevens geven aan dat pc's een beschermend effect hebben op zenuwcellen.

We hebben verder waargenomen dat pc's de nucleaire Nrf2-accumulatie significant verhoogden in vergelijking met die van MPP plus alleen in PC12-cellen. Inderdaad, pc's reguleerden de expressieniveaus van NQO1, HO-1, GCLM en GCLC [42] aanzienlijk. Verder werd Nfr2gene-uitschakeling via Nrf2-siRNA gebruikt om de rol van Nrf2 / ARE-activering in door pc's gemedieerde neuroprotectie tegen MPP plus-geïnduceerde oxidatieve schade te onderzoeken: met Nrf2-siRNA-getransfecteerde cellen gaven een duidelijke afname van Nrf2-expressie aan. Deze huidige studie toonde ook aan dat Nrf2 knock-out zowel door pc's gemedieerde bescherming tegen MPP plus-behandelde stoornissen in de levensvatbaarheid van de cellen als de antioxiderende effecten van pc's afschafte. Deze resultaten komen overeen met een eerdere studie die suggereert dat het verbeteren van de activering van de Nrf2 / ARE-route bijdraagt ​​aan neuroprotectie [43].

De Nrf2/ARE-route is een belangrijke antioxidantroute [44-46]. Normaal gesproken bevindt Nrf2 zich in het cytoplasma, waar het is gebonden aan het remmende eiwit, Keapl [47,48]. Wanneer cellen oxidatieve stress ondergaan, dissocieert Nrf2 van Keap1, initieert het endogene antioxidantafweersysteem en verplaatst het zich vervolgens naar de kern [46,49,50]. Het interageert vervolgens met ARE om een ​​reeks celbeschermende en antioxidantgenen te activeren, waaronder GCLC, GCLM, NQO1 en HO-1 [51-54]. Als reactie op oxidatieve stress dissocieert Nrf2 van Keap1 in het cytosol en wordt vervolgens getransloceerd naar de kern, binden aan de ARE-sequentie om transcriptie van cryoprotectieve genen te activeren [53-58]. De huidige resultaten geven aan dat pc's de Nrf2 / ARE-route kunnen activeren, Nrf2 van het cytoplasma naar de kern kunnen overbrengen, zich in de kern kunnen ophopen, de expressie van GCLC, GCLM, NOO1 en HO -1 kunnen verbeteren en het vermogen van cellen om oxidatieve stress te weerstaan. De Nrf2 / ARE-route kan inderdaad een farmacologisch doelwit van pc's zijn voor de preventie van PD.

4. Materialen en methoden

4.1. Chemische verbindingen en reagentia

MPP plus- en MPTP-agentia werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, VS) en de Cell Counting Kit -8 werd verkregen bij Beyotime (Shanghai, China). De pc's, 2', 7/-dichloorfluorescinediacetaat, MDA, GSH-Px, SOD en CAT diagnostische kits werden allemaal verkregen van Solarbio (Beijing, China). De RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT Reagent Kit met gDNA Eraser en SYBRPremix Ex TaqTMⅡI werden gekocht bij Takara (Shiga, Japan); het Nrf2-siRNA, controle-siRNA en Lipofectamine 2000 werden verkregen van GenePharma (Shanghai, China). Ten slotte werden de primaire antilichamen, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, Antityrosine Hydroxylase (TH) en overeenkomstige secundaire antilichamen verkregen van Proteintech (Wuhan, China ).

4.2.Celcultuur

PC12-cellen werden verkregen van de National Collection of Authenticated Cell Cultures. De cellen werden gehouden in DMEM aangevuld met 10 procent foetaal runderserum en penicilline-streptomycine (100 U/ml; 100 ug/ml) in een incubator met vochtige atmosfeer op 37 graden met 5 procent CO2 [59].

4.3. Cel levensvatbaarheidstest

PC12-cellen (1 x 104 cellen/putje) werden 24 uur geïncubeerd met 1,2or4ug/ml PCs of deprenvl （30 M） en vervolgens 24 uur geïncubeerd met 1,5 mM MPP plus. Vervolgens werd 10 L Cell Counting Kit-8-oplossing aan elk putje toegevoegd en gedurende 1 uur geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 450 nm [60].

4.4. Vis Onderhoud

Ethische goedkeuring voor dierlijk gebruik werd verleend door de commissie voor dierenbehoud en -gebruik van het proefdiercentrum, Zhejiang University (ZJU20200125). Volwassen zebravissen (AB-stam) werden verkregen van het laboratoriumdiercentrum van de Zhejiang University (Hang Zhou, China) en op 28 ± 1 graad gehouden onder cycli van 14 uur licht/10 uur donker. De vissen kregen tweemaal per dag Artemia nauplii [61]. Om embryo's te produceren, werden volwassen zebravissen 's nachts in kweektanks geplaatst in een verhouding van 1: 1 man: vrouw. Het paaien werd geactiveerd nadat de lichten de volgende ochtend waren aangezet en in 2 uur voltooid. Embryo's werden grootgebracht in embryowater - 13,7 mM NaCl, 540 M KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 M MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7,4 bij 28 graden -62,63 .

4.5. ROS-meting

Om de ROS-productie te meten, werden PC12-cellen (2x104 cellen/putje) gedurende 24 uur blootgesteld aan 1,2 of 4 ug/ml pc's of deprenyl （30 M） en vervolgens geïncubeerd met 1,5 mM MPPt voor 24 uur 【64】. De cellen werden gedurende 30 minuten blootgesteld aan 10 μM 2',7'-dichloorfluorescinediacetaatoplossing in donkere omstandigheden; de kleurstofoplossing werd vervolgens verwijderd en de cellen werden driemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De beelden van de cellen werden waargenomen met behulp van een Olympus laser scanning confocale microscoop (Olympus, Tokyo hoofdstad, Japan). De fluorescentie-intensiteit van de cellen werd gekwantificeerd met behulp van Image J-software v1.8.0 (Olympus, hoofdstad van Tokio, Japan). De resultaten worden uitgedrukt als een percentage van de oppervlakte van de ROS-regio's in de controlegroep.

Om de ROS-productie te meten, werden de zebravislarven 3 dagen na de bevruchting (dpf) blootgesteld aan deprenyl（40 μM） of 4,8 of 16 ug/mL pc's met of zonder 400 μM MPTP gedurende 4 dagen. Zebravislarven bij 7 dpf werden overgebracht naar een 24-well-plaat (10 larven per groep), behandeld met 20 μM 2',7'-dichloorfluorescinediacetaatoplossing en 60 minuten in het donker bij 28,5 graden geïncubeerd [65 ]. De larven werden vervolgens driemaal gewassen met embryomedium om overmaat 2',7'-dichloorfluorescinediacetaat te verwijderen. De beelden van de gekleurde larven werden waargenomen met behulp van een Olympus laser scanning confocale microscoop. De fluorescentie-intensiteit van de individuele larve werd gekwantificeerd met behulp van Image J-software. De resultaten worden uitgedrukt als een percentage van de oppervlakte van de ROS-regio's in de controlegroep. 4.6. Beoordeling van MDA, GSH-Px, SOD en CAT

PC12-cellen (2 x 104 cellen/putje) werden gedurende 24 uur blootgesteld aan 1,2 of 4 ug/ml pc's of deprenyl （30 M） en vervolgens gedurende 24 uur geïncubeerd met 1, 5 mM MPP plus. Vervolgens werd 1 ml extract toegevoegd aan cellen van 4 x 10 graden en werden de cellen gebroken door ultrasoon centrifugeren bij 8000 rpm bij 4 graden gedurende 10 minuten. Het supernatant werd vervolgens op ijs gezet om te testen en reagentia werden toegevoegd voor de bepaling van respectievelijk MDA, GSH-Px, SOD en CAT. Elke index werd in drievoud herhaald.

De zebravislarven bij 3dpf werden gedurende 4 dagen geïncubeerd met deprenyl（40 μM）or4,8 of 16 ug/mL pc's met of zonder 400 μM MPTP. Vervolgens werden 0,05 g zebravislarvenweefsel en 0,5 ml extract gehomogeniseerd in een ijsbad en vervolgens 10 minuten bij 4 graden gecentrifugeerd. Het supernatant werd op ijs gezet om te testen. Vervolgens werden reagentia toegevoegd voor de bepaling van respectievelijk MDA, GSH-Px, SOD en CAT. Elke index werd in drievoud herhaald.

4.7. Bereiding van hele-cel-, cytoplasmatische en nucleaire eiwitten

Voor extractie van hele celeiwitten werden cellen verzameld en gedurende 30 minuten op ijs geïncubeerd met RIPA-lysisbuffer die 1 procent PMSF en 1 procent proteaseremmercocktail bevat. Cellysaten werden gecentrifugeerd en het supernatant werd verzameld en bewaard. Voor de voorbereiding van subcellulaire fractionering werden celmonsters verwerkt met behulp van de extractiekit voor nucleair en cytoplasmatisch eiwit. Het eiwitgehalte werd bepaald met behulp van de BCA (Beyotime, Shanghai, China) -assay.

4.8. Nrf2 siRNA-transfectie

Nrf2-siRNA werd gebruikt om Nrf2 neer te halen. PC12-cellen werden getransfecteerd met Nrf2-siRNA (80 nM) of controle-siRNA met behulp van Lipofectamine 2000, volgens de handleiding. 4.9.Western-blotting

Eiwitmonsters werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar polyvinylideendifluoride (PVDF) -membranen. De blots werden blootgesteld aan geschikte primaire antilichamen: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH en peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van ECL (Beyotime, Shanghai, China) plus Western blotting-detectiereagentia [36,43].

4.10.Locomotorische gedragstest

De zebravislarven bij 3dpf werden gedurende 4 dagen geïncubeerd met deprenyl-40 μM ）or4,8or16 ug/mL pc's met of zonder 400uM MPTP. De 7 dpf-zebravissen werden vervolgens in 24- putplaten (1 vis per putje en 12 larven per groep) geplaatst en de totale afstand die elke vis gedurende 10 minuten zwom werd geregistreerd. Het gedrag van de zebravis werd gevolgd en geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerd videovolgsysteem (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, VS) [66].

4.11. Totale RNA-extractie, omgekeerde transcriptie en kwantitatieve realtime polymerasekettingreactie

RNA werd geëxtraheerd met behulp van RNAiso Plus volgens de instructies van de fabrikant. RNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van een PrimeScriptTMRT-reagenskit met gDNA Eraser, volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve real-time PCR-analyse werd uitgevoerd op een Applied Biosystems ViATM 7 Real-Time PCR-systeem met behulp van SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japan). -actine werd gebruikt als referentiegen en relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2-△Ct-methode. De primersequenties die in het onderzoek zijn gebruikt, staan ​​​​vermeld in tabel 1.

4.12. Zebravis Antityrosine Hydroxylase (TH) Whole-Mount Immunokleuring

Zebravislarven bij 1 dpf werden gedurende 2 dagen (10 vissen/groepbatches) geïncubeerd met deprenyl （40 μM） of 4,8 of 16 ug/mL pc's met of zonder 400 uM MPTP. Larven werden gedurende 30 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS. Na fixatie werden ze behandeld voor immunokleuring van TH [67]. Bij kamertemperatuur werden 2 procent (v/o) lamserum en 0,1 procent （w/ø）boviene serumalbumine （BSA） gedurende 1 uur geblokkeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing Tween-20(PBST). Vervolgens werden ze in de blokkeerbuffer blootgesteld aan antityrosinehydroxylase-antilichaam (1:200 verdund, Proteintech) gedurende 2 uur en vervolgens 6 keer gespoeld met PBST. De laatste immunokleuringsstap van de hele berg werd gedurende 1 uur uitgevoerd in kleurbuffer met 488 geitenantikonijn (1:500) en opnieuw gewassen met PBST. Na voldoende kleurontwikkeling werden de zebravissen plat gemonteerd met 3,5 procentmethylcelluloseen afgebeeld met behulp van een Olympus laser scanning confocale microscoop.

4.13. Statistische analyse

Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest werd gebruikt om de gemiddelden van verschillende groepen te vergelijken. Graphpad Prism v6.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, VS) werd gebruikt voor statistische analyse en het plotten van de grafieken.

5. Conclusies

Concluderend geven onze bevindingen aan dat pc's neuroprotectieve effecten uitoefenen via activering van de Nrf2 / ARE-route en de stroomafwaartse ervanontgiftingenantioxidant enzymen. Alles bij elkaar suggereren deze inzichten dat pc's nuttig kunnen zijn voor de behandeling van PD.

Dit artikel is afkomstig uit Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules