Beschermende effecten en mechanismen van procyanidinen op de ziekte van Parkinson in vivo en in vitro deel 1
Mar 21, 2022
Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie
Abstract:Dit onderzoek evalueerde het moleculaire mechanisme van procyanidinen (PC's) tegen neurotoxine 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) en zijn metaboliet {{6 }}methyl-4-fenylpyridinium (MPP plus) geïnduceerde modellen voor de ziekte van Parkinson (PD). In vitro werden PC12-cellen 24 uur geïncubeerd met pc's of deprenyl en vervolgens 24 uur blootgesteld aan 1, 5 mM MPP plus. In vivo werden zebravislarven (AB-stam) 3 dagen na de bevruchting (pdf) gedurende 4 dagen geïncubeerd met deprenyl of pc's in 400 uM MPTP. Vergeleken met alleen MPP*/MPTP, verbeterden pc's de antioxidantactiviteiten aanzienlijk (bijv. glutathionperoxidase (GSH-Px), superoxide-dismutase (SOD), catalase (CAT)) en verlaagden de niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en malondialdehyde (MDA). ). Bovendien verhoogden pc's de nucleaire Nrf2-accumulatie in PC12-cellen aanzienlijk en verhoogden ze de expressie van NQO1, HO -1, GCLM en GCLC in zowel PC12-cellen als zebravissen in vergelijking met alleen MPP * / MPTP. De huidige studie toont aan dat pc's neuroprotectieve effecten hebben, de nucleaire factor-erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) / antioxidantresponselement (ARE) -route activeren en oxidatieve schade in MPP plus / MPTP-geïnduceerde PD-modellen verminderen.
trefwoorden:procyanidinen; Ziekte van Parkinson; PC12-cellen; zebravis; Nrf2/ARE-pad
1. Inleiding
De ziekte van Parkinson (PD) is een progressief neurodegeneratief syndroom dat wordt veroorzaakt door de afwezigheid van dopaminerge neuronen in de substantia nigra. De klinische manifestaties zijn onder meer motorische achterstand, tremor, stijfheid en posturale instabiliteit [1-6]. Effectieve methoden om neuronale degeneratie bij PD-patiënten te voorkomen of om te keren zijn nog onduidelijk. Daarom blijft de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe antiparkinsongeneesmiddelen een topprioriteit bij het zoeken naar PD-behandelingen.
Hoewel de pathogenese van PD onduidelijk blijft, hebben eerdere studies aangetoond dat oxidatieve stress een sleutelrol speelt bij het verlies van dopaminerge neuronen [7,8]. Dopamine kan auto- of enzymgekatalyseerde oxidatie ondergaan om de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en elektrofiele chinonmoleculen [9] te leiden, beide processen die ten grondslag kunnen liggen aan de kwetsbaarheid van dopaminerge neuronen voor oxidatieve en elektrofiele stress[10-12 ]. Daarom kan een mogelijke methode voor de preventie of behandeling van PD zijn om de behandeling met antioxidanten aan te vullen om overmatige ROS te elimineren. Natuurlijke bioactieve verbindingen zijn inderdaad voordelig omdat ze vaak veilig zijn voor consumenten en zeer weinig (of geen) bijwerkingen hebben [13]. Daarom kunnen antioxidanten uit natuurlijke bronnen helpen bij de behandeling van PD.
Cistanche kan de immuniteit verbeteren
Procyanidinen (PC's) zijn natuurlijke fenolische verbindingen van flavonoïden, waaronder oligomeren van monomeer catechine en epicatechinen [14]. PC's zijn natuurlijke voedingsstoffen en antioxidanten met antioxiderende effecten die sterker zijn dan vitamine C en E [15]. De Nrf2 / ARE-route is een belangrijke antioxidantroute. Nrf2 wordt door ROS of door een elektrofiele reactie uit Keap1 vrijgegeven. Daarna bindt de verbinding zich aan het antioxidantresponselement (ARE) in de kern en medieert de expressie van peroxiredoxine en fase II-ontgiftingsenzymen (HO-1, GCLC, GCLM en NQO-1), die fungeren als aaseters van ROS en beschermen cellen tegen oxidatieve schade [16].
Het embryonale zebravisbrein bevat verschillende clusters van dopaminerge, noradrenerge en adrenerge neuronen op locaties die vergelijkbaar zijn met die in het volwassen brein [17-19]. Drie dagen na de bevruchting (pdf) worden dopaminerge neuronen waargenomen in het ventrale diencephalon, het pretectum, de locus coeruleus, de bulbus olfactorius en het netvlies [20]. Vergeleken met experimentele muizenmodellen worden zebravismodellen geassocieerd met kortere experimentele perioden, lagere kosten en verminderde complexiteit bij genmanipulatie [21. Rat-feochromocytoomcellen (PC12-cellen) lijken qua morfologie, structuur en functie sterk op neuronen [22]. Ze zijn zeer consistent met primair gekweekte zenuwcellen en hebben de voordelen van een gemakkelijke en stabiele kweek [23]. PC12-cellen zijn op grote schaal gebruikt als modellen voor het bestuderen van zenuwcellen [24-26].
Van het neurotoxine 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) is aangetoond dat het bij mensen een syndroom veroorzaakt dat lijkt op de ziekte van Parkinson. MPTP veroorzaakt selectieve degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra, en patiënten vertonen symptomen zoals tremoren, immobiliteit en een schuifelende gang [27]. MPTP wordt gemetaboliseerd tot 1-methyl-4-fenylpyridinium (MPP) in gliale cellen in de hersenen. Na afgifte uit de glia wordt MPP plus getransporteerd naar dopaminerge neuronen via de dopaminetransporter (DAT) [28] en accumuleert het in de mitochondriën, waar wordt aangenomen dat het celdood veroorzaakt door ademhalingsenzymen te verstoren en oxidatieve schade te veroorzaken [29,30] . Eerdere studies hebben aangetoond dat pc's sommige verouderingsprocessen van vrouwelijke ratten voorkomen [31] en bepaalde beschermende effecten hebben op zenuwen [32,33]. Of pc's neuronale degeneratie bij PD kunnen voorkomen of omkeren door de Nrf2 / ARE-route te reguleren, blijft echter onduidelijk. Deze studie maakte gebruik van met MPP behandelde PC12-cellen [34,35] en met MPTP behandelde zebravissen [36] om de beschermende effecten en het potentiële mechanisme van pc's op een PD-model te beoordelen.
2. Resultaten
2.1.Effecten van pc's op MPP plus -geïnduceerde cytotoxiciteit van PC12-cellen
Incubatie van PC12-cellen tot 1,5 mM MPP plus gedurende 24 uur resulteerde in cellevensvatbaarheid van 58,88 procent (Figuur la). Voorbehandeling van cellen met pc's beschermde PC12-cellen tegen MPP plus-geïnduceerde schade door de levensvatbaarheid van de cellen te vergroten (Figuur 1b). Er was geen duidelijk verschil in celoverlevingspercentage tussen de 4ug / ml pc's-groep en de 30 μM deprenylgroep-positieve controlegroep) (Figuur 1b).
2.2. Pc's Verminderde MPP plus -veroorzaakte oxidatieve stress en verhoogde activiteit van antioxidantenzymen
ROS en malondialdehyde (MDA) niveaus geven de ernst van oxidatieve schade aan. Het blootstellen van PC12-cellen aan 1,5 mM MMP plus gedurende 24 uur verhoogde de ROS- en MDA-niveaus, die werden geremd door pc's bij 4ug/mL (Figuur 2a-c). Om het effect van pc's op de antioxidantcapaciteit van met MPP plus behandelde PC12-cellen verder te evalueren, hebben we glutathionperoxidase (GSH-Px), catalase (CAT) en superoxide dismutase (SOD) activiteit gemeten en waargenomen dat MPP plus behandeling GSH-Px onderdrukte. , CAT- en SOD-activiteit. Deze MPP-plus-effecten werden echter gered door blootstelling aan pc's bij 4 ug/ml （Figuur 2d-f）.
2.3.Effecten van pc's op Nrf2 / ARE-pad in MPP plus-geïnduceerde PC12-cellen
De expressie van nucleaire factor-erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) werd opgereguleerd en het niveau van Keap1 werd verlaagd na pc-behandeling (Figuur 3a-c). PCs（4 ug/mL） vergemakkelijkte nucleaire lokalisatie van Nrf2 onder MPP-laesieomstandigheden (Figuur 3d-f). Bovendien toonden Western-blot-gegevens een duidelijke opregulatie in de expressie van heem-oxydoreductase 1 (NQO1), glutamaat-cysteïne-ligase-katalytische subeenheid (GCLC) en glutamaat-cysteïne-ligase-modificator-subeenheid (GCLM). ) expressie na behandeling met PC (4 ug/ml), vergeleken met blootstelling aan MPPt alleen (Figuur 3g-k).
2.4.Nf2/ARE-signalering is gerelateerd aan de neuroprotectieve en antioxiderende effecten die worden gemedieerd door PCS
De knock-down van Nrf2 door siRNA schafte effectief de expressie van Nrf2 af (Figuur 4a, b). Inderdaad, Nrf2-siRNA-behandeling heft de beschermende acties van pc's tegen MPP plus-behandelde oxidatieve schade op, zoals blijkt uit de verminderde levensvatbaarheid van de cellen in de Nrf2-siRNA-getransfecteerde groep (Figuur 4c). Bovendien werden de effecten van pc's op MDA en SOD ongedaan gemaakt door Nrf2 knockdown onder MPP-laesieomstandigheden (Figuur 4d, e.
2.5.Effecten van pc's op de beweeglijkheid van de zebravis Laroae na behandeling met MPTP
MPTP verminderde de totale afstand die zebravissen zwommen. PC-behandeling (4,8 en 16 ug/ml) redde MPTP-geïnduceerde locomotieftekorten en verhoogde de totale afgelegde afstand ten opzichte van de MPTP-groep (Figuur 5a,b). Bovendien bleek deprenyl bescherming te bieden tegen MPTP-geïnduceerde schade en werd het gebruikt als een positieve controle. Met name pc's （16 ug/mL） en deprenyl （40 μM） alleen hadden geen invloed op het voortbewegingsgedrag van normale zebravislarven.
2.6.Effecten van pc's op MPTP-geïnduceerde dopaminerge neuronenletsel bij zebravissen
Zebravisembryo's geïncubeerd met MPTP vertoonden een statistisch significante afname in tyrosinehydroxylase (TH) -dichtheid (Figuur 6a, b). Niettemin keerde behandeling met 16 ug / ml pc's de vermindering van de THt-celdichtheid aanzienlijk terug (Figuur 6a, b).
Figure 2. PCs reduced MPP+-induced oxidative stress and increased antioxidant enzyme activity. (a) ROSlevels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured by imageJsoftware;(c)MDA levels;(d) GSH-Px activity;(e)CAT activity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons:ns, p>0.05;*,p<><0.01;,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">
Figure 3. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPP+-induced PC12 cells. (a)Protein levels of Nrf2 and Keep-1, as determined by Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Keap1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(d) protein expression levels of nuclear Nrf2 and cytoplasmic Nrf2, as determined by Western blotting; (e) nuclear Nrf2/LaminB protein relative expression (ratio to control); (f) cytoplasmic Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(g) protein levels of HO-1, NQO1, GCLCand GCLM, as determined by Western blotting;(h)HO-1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(i) NQO1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(j) GCLC/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(k) GCLM/GAPDH protein relative expression (ratio to control). F and pvalues of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><0.01;the error="" bars="" are="">
Figure 4. Nrf2/ARE signaling is related to the neuroprotective and antioxidant effects mediated by PCs.(a) Knockout efficiency was detected by determination of Nrf2 protein expression using Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Cell viability;(d) MDA levels;(e) SODactivity. Find values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p >0.05;*,p<0.05;**,p><0.01;**,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">
Figuur 5. Effecten van pc's op de beweeglijkheid van zebravislarven bij MPTP-behandeling. (a) Typische patronen van zwemsporen van zebravislarven in elke groep; (b) Gemiddelde totale afstand van zebravislarven in elke groep. F- en p-waarden van de eenrichtingsvariantieanalyse worden boven de grafiek weergegeven. De resultaten van Tukey's post hoc-test worden gepresenteerd voor geselecteerde vergelijkingen: **,p<0.001; the="" error="" bars="" are="">
Dit artikel is geëxtraheerd Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules
