Kwantificering van neurietendegeneratie met verbeterde nauwkeurigheid en efficiëntie in een in vitro model van de ziekte van Parkinson, deel 1

Abstract

Neurietdegeneratie wordt geassocieerd met vroege stadia van neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson (PD) en amyotrofische laterale sclerose. Eén methode die vaak wordt gebruikt om neurietdegeneratie te analyseren, omvat de berekening van een degeneratie-index (DI) na het gebruik van de Analyse Particles-tool van ImageJ om neurietfragmenten te detecteren in microfoto's van gekweekte cellen. DI-analyses zijn echter gevoelig voor verschillende soorten meetfouten, kunnen tijdrovend zijn om uit te voeren en zijn beperkt in toepassing.

Neurodegeneratie verwijst naar veranderingen die optreden in of rond neuronen, die de menselijke cognitieve functie, intelligentie, emotie, gedrag, enz. kunnen beïnvloeden. Veel mensen denken dat neurodegeneratie nauw verband houdt met geheugenverslechtering, maar dit is misschien niet het geval.

Ten eerste betekent neurodegeneratie niet noodzakelijkerwijs dat het geheugen afneemt met de leeftijd. Sommige mensen kunnen een goed geheugen behouden en zelfs gerechtigheid begrijpen. Dit komt omdat het geheugen van een persoon wordt beïnvloed door een combinatie van factoren zoals lichaamsbeweging, voeding en levensstijl.

Ten tweede kan het menselijk brein nieuwe neurale verbindingen herstellen en nieuwe herinneringen vormen, wat plasticiteit wordt genoemd. Ongeacht de leeftijd leren de hersenen voortdurend en vormen ze nieuwe herinneringen. Daarom is neurodegeneratie eenvoudigweg een natuurlijke verandering in de hersenen en betekent dit niet noodzakelijkerwijs dat het geheugen verslechtert.

Ten slotte kan het handhaven van een optimistische houding ook iemands geheugen verbeteren. Zorgen en stress kunnen nadelige gevolgen hebben voor de hersenen, wat kan leiden tot geheugenverlies. Een positieve houding kan de gezondheid van de hersenen bevorderen en het geheugen en het cognitieve vermogen verbeteren.

Samenvattend leidt neurodegeneratie niet noodzakelijkerwijs tot geheugenverlies, en een optimistische levenshouding kan ons helpen een goed geheugen en cognitieve vaardigheden te behouden. Daarom moeten we een optimistische houding behouden en het beheer van lichaamsbeweging, voeding en levensstijl versterken om de gezondheid van de hersenen en het geheugen te behouden. Het is duidelijk dat we ons geheugen moeten verbeteren. Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche ook de balans van neurotransmitters kan reguleren, zoals het verhogen van het niveau van acetylcholine en groeifactoren. Deze stoffen zijn erg belangrijk voor het geheugen en het leren. Daarnaast kan vlees ook de doorbloeding verbeteren en de zuurstoftoevoer bevorderen, wat ervoor kan zorgen dat de hersenen voldoende voeding en energie krijgen, waardoor de vitaliteit en het uithoudingsvermogen van de hersenen verbeteren.

Klik op manieren kennen om de hersenfunctie te verbeteren

Hier beschrijven we een verbeterde methode voor het uitvoeren van DI-analyses. De nauwkeurigheid van de metingen werd verbeterd door aanpassing van de selectiecriteria voor het detecteren van neurietfragmenten, het verwijderen van beeldartefacten en niet-neurietmaterialen uit beelden, en optimalisatie van het beeldcontrast. Dergelijke verbeteringen zijn geïmplementeerd in een ImageJ-macro die snelle en volledig geautomatiseerde DI-analyse van meerdere afbeeldingen mogelijk maakt. De macro biedt bewerkingen voor het automatisch verwijderen van cellichamen uit microfoto's, waardoor de toepassing van DI-analyses wordt uitgebreid voor gebruik in experimenten met gedissocieerde culturen.

We presenteren experimentele bevindingen die ondersteunen dat, vergeleken met de conventionele methode, de verbeterde analysemethode metingen oplevert met verhoogde nauwkeurigheid en aanzienlijk minder tijd vereist om uit te voeren.

Bovendien demonstreren we het nut van de methode om neurietendegeneratie te onderzoeken in een celkweekmodel van PD door een experiment uit te voeren dat de effecten onthult van c-Jun N-terminale kinase (JNK) op neurietendegeneratie geïnduceerd door oxidatieve stress in menselijke mesencefale cellen. Deze verbeterde analysemethode kan worden gebruikt om nieuw inzicht te verwerven in factoren die ten grondslag liggen aan degeneratie van neurieten en de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen.

Trefwoorden:

Axonale degeneratie; degeneratie-index; neurietdegeneratie; neurodegeneratie; oxidatieve stress; Ziekte van Parkinson.

Betekenisverklaring

Neurietdegeneratie is een cellulaire gebeurtenis die verband houdt met de vroege stadia van meerdere soorten neurodegeneratieve aandoeningen. Moleculaire factoren die de degeneratie van neurieten reguleren, worden nog steeds slecht begrepen, en bestaande methoden voor het bestuderen van degeneratie van neurieten hebben een beperkte toepassing en efficiëntie. Hier identificeren we wijzigingen in een veelgebruikte procedure voor het analyseren van neurietdegeneratie die de meetfout vermindert.

Dergelijke methodologische verbeteringen werden opgenomen in een ImageJ-macro, waardoor een snelle en volledig geautomatiseerde analyse van neurietendegeneratie mogelijk werd met behulp van grote sets microfoto's. Met behulp van een celcultuurmodel voor de ziekte van Parkinson (PD) demonstreren we dat de macro nauwkeurigere en efficiëntere metingen van neurietdegeneratie mogelijk maakt, terwijl de geschiktheid van de analysemethode voor experimenten met gedissocieerde culturen wordt vergroot.

Invoering

Neurietdegeneratie is een cellulair proces waarbij axonen of dendrieten progressieve disfunctie en morfologische veranderingen ondergaan, wat leidt tot een verlies aan neurietintegriteit. Neurietdegeneratie is een evolutionair geconserveerd proces dat van cruciaal belang is voor de juiste totstandkoming van neurale netwerken tijdens de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel (Neukomm en Freeman, 2014).

Het proces wordt echter ook in gang gezet als reactie op verschillende vormen van letsel, zoals mechanische schade of blootstelling aan medicijnen die voor chemotherapie worden gebruikt (Salvadores et al., 2017). Bovendien wordt neurietdegeneratie geassocieerd met de progressie van een verscheidenheid aan leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en amyotrofische laterale sclerose.

Interessant is dat voor al dergelijke neurodegeneratieve aandoeningen het toenemende bewijs suggereert dat neurietdegeneratie een belangrijke gebeurtenis in een vroeg stadium is die voorafgaat aan neuronale dood of het begin van klinische symptomen (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert en Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Studies die factoren onderzoeken die dit cellulaire proces reguleren, kunnen dus nieuwe doelen onthullen voor de behandeling van een verscheidenheid aan neurodegeneratieve aandoeningen.

Het onderzoeken van degeneratie van neurieten is vooral belangrijk voor het begrijpen van Parkinson, een ziekte die wordt gekenmerkt door de accumulatie van eiwitaggregaten die a-synucleïne bevatten, progressief verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc), en de ontwikkeling van een verscheidenheid aan motorische en cognitieve symptomen. (Aarsland et al., 2017).

Bewijs uit postmortale en menselijke beeldvormingsstudies geeft aan dat a-synucleïne-aggregaten overvloediger aanwezig zijn in neuronale vezels dan in de cellichamen, en dat degradatie van dopaminerge axonen in grotere mate plaatsvindt dan verlies van dopaminerge neuronen in de SNpc gedurende de periode die leidt tot het klinische begin. (Tagliaferro en Burke, 2016).

Hoewel de moleculaire interacties die bijdragen aan de progressieve achteruitgang van dopaminerge neurieten nog steeds onvolledig worden begrepen, geeft recent bewijs aan dat degeneratie van neurieten kan worden gemedieerd door gebeurtenissen die onafhankelijk zijn van signaalcascades die ten grondslag liggen aan neuronale dood (Fukui, 2016; Geden en Deshmukh, 2016). Studies die de fysiologische onderbouwing van neurietdegeneratie rechtstreeks evalueren, zijn dus van cruciaal belang voor de ontwikkeling van therapieën die vroege progressie van de ziekte van Parkinson belemmeren.

Als reactie op het bewijs van een centrale rol voor neurietendegeneratie bij de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen, is een verscheidenheid aan methoden ontwikkeld om neurietendegeneratie te meten met behulp van microfoto's van gekweekte neuronen. Er zijn bijvoorbeeld meerdere verschillende methoden ontwikkeld om de degeneratie van neurieten te meten met behulp van software om een ​​verminderd aantal of een verminderde lengte van neurieten te detecteren (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Omdat dergelijke methoden de fragmentatie van neurieten echter niet rechtstreeks evalueren, kan de interpretatie van resultaten om de impact van een variabele op de degeneratie van neurieten te bepalen, worden vertroebeld door de potentiële effecten van de variabele op de uitgroei van neurieten. Bepaalde onderzoeksgroepen hebben ook de degeneratie van neurieten gemeten door subjectief beelden van neurieten te scoren op basis van morfologische kenmerken en de mate van schijnbare fragmentatie (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Deze alternatieve methode is echter tijdrovend en kan tot fouten van de onderzoeker leiden.

Eén methode die objectieve en directe meting van neurietfragmentatie mogelijk maakt, omvat het gebruik van het Analyse Particles-algoritme van ImageJ om het gebied van neurietfragmenten in microfoto's van gekweekte cellen te meten. De metingen worden gebruikt om een ​​degeneratie-index (DI) te berekenen, een schaal tussen {{0}}.0 en 1,0 die de mate van neurietdegeneratie weerspiegelt (Sasaki et al., 2009).

Hoewel DI-analyses kunnen worden gebruikt om verschillende graden van neurietenfragmentatie te detecteren, wordt de nauwkeurigheid van metingen doorgaans beperkt door verschillende bronnen van fouten, en is de toepassing van de methode voornamelijk beperkt tot explantaatculturen of cellen gekweekt in gecompartimenteerde microfluïdische apparaten. Bovendien zijn DI-analyses tijdrovend wanneer ze worden geëxtrapoleerd naar grote beeldsets. Daarom probeerden we deze beperkingen te overwinnen door de DI-analyseprocedure aan te passen om grotere nauwkeurigheid en efficiëntie mogelijk te maken, terwijl de toepasbaarheid werd uitgebreid.

In de huidige studie identificeren we verschillende bronnen van fouten die vaak worden geassocieerd met DI-analyses en rapporteren we methodologische herzieningen die de verschillende vormen van fouten verminderen. We nemen de procedurele verbeteringen op in een ImageJ-macro genaamd Automated Neurite Degeneration Index (ANDI) om DI-analyses van grote beeldsets volledig te automatiseren. Voor de werking van de ANDI Macro zijn alleen software en bestanden nodig die open source en gratis beschikbaar zijn. Metingen verkregen met ANDI profiteren van een grotere nauwkeurigheid, terwijl de tijd die nodig is om de analyses uit te voeren aanzienlijk wordt verkort.

Bovendien demonstreren we hoe de nieuwe analysemethode kan worden toegepast om nauwkeurige en snelle meting van neurietdegeneratie uit te voeren in een celcultuurmodel van PD waarbij gedissocieerde cellen zijn gekweekt zonder compartimentering. Gezamenlijk kunnen deze methodologische verbeteringen leiden tot nieuw inzicht in factoren die ten grondslag liggen aan een belangrijk cellulair proces dat verband houdt met neurodegeneratie.

Materialen en methodes

Cel cultuur

Culturen van menselijke mesencefale (LUHMES) cellen uit Lund werden tot stand gebracht in Lab Tek II-glaasjes met acht putjes, bekleed met poly-L-ornithine (PLO) en fibronectine, poly-D-lysine (PDL) en laminine, alle vier de substraten, of geen substraten, zoals aangegeven. Om te coaten met PLO en fibronectine werden de objectglaasjes een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd met een oplossing die 200 mg/ml PLO bevatte (Sigma-Aldrich, catalogus #P3655).

Na wassen met steriel water (Avantor) werden de objectglaasjes gedurende 3 uur bij 37 graden geïncubeerd met 2 mg/ml fibronectine (Sigma-Aldrich, catalogus #F0895). De objectglaasjes werden vervolgens gewassen met steriele PBS (Corning Life Sciences, catalogus #21-040-CV) en aan de lucht gedroogd. Om te bekleden met PDL en laminine werden de objectglaasjes bij kamertemperatuur geïncubeerd met een oplossing die 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalogus #P7280) en 10 mg/ml laminine (Corning, catalogus #354232) bevatte.

Na een incubatie gedurende de nacht werden de objectglaasjes gewassen met steriele PBS en aan de lucht gedroogd. Om met alle vier de substraten te coaten werden de bovengenoemde procedures achtereenvolgens uitgevoerd. LUHMES-cellen (ATCC, RRID: CVCL_B056) werden uitgeplaat in de gecoate kamerglaasjes met de aangegeven dichtheden in differentiatiemedium bestaande uit DMEM/F12 (Invitrogen, catalogus #11330057) aangevuld met 2 mM glutamine (VWR), 1% (v/v) N-2 supplement, 1 mg/ml tetracycline (Sigma-Aldrich, catalogus #87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenosine cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, catalogus #BML-CN125-0100), en 2 ng/ml van gliale cellijnen afgeleide neurotrofe factor (GDNF; R&D Systems, catalogus #212-GD-010).

Tenzij anders aangegeven, werden alle culturen uitgeplaat met een dichtheid van 115,000 cellen per putje. Tot de behandeling werd elke 48 uur een mediavervanging met een volume van 50% uitgevoerd. Om genetische drift te voorkomen, werden voor alle experimenten celvoorraden gebruikt die zes of minder keer waren gepasseerd.

Experimenten met primaire culturen van sympathische neuronen werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Eastern Kentucky University of de University of Virginia. Superieure cervicale ganglia werden ontleed uit postnatale dag 0–6 C56Bl/6 muizen, geïncubeerd bij 37 graden in een enzymatische dissociatiebuffer, en gewassen met groeimedia om proteolytische enzymen te verwijderen en getritureerd.

Celsuspensies werden uitgeplaat met een dichtheid van 7000 cellen per putje in Lab Tek II-glaasjes met acht putjes. Media werden vervangen op dag in vitro (DIV) 1, gevolgd door mediavervanging om de andere dag. Media werden aangevuld met cytosine arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) op DIV1-DIV3 om de groei van niet-neuronale cellen te voorkomen, gevolgd door verwijdering van Ara-C uit de media gedurende ten minste 24 uur vóór de behandeling zoals aangegeven. Voor experimenten uitgevoerd aan de Eastern Kentucky University waarbij behandeling met waterstofperoxide betrokken was, werden de objectglaasjes in de kamer gecoat met 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, catalogus #P3655), 2 mg/ml fibronectine, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalogus #P7280) en 10 mg/ml laminine (Corning, catalogus #354232) vóór gebruik, en dissociatie werd uitgevoerd via 30-min incubatie in buffer bestaande uit DMEM (ThermoFisher, catalogus #11960- 044) met 0,025% trypsine (Corning Life Sciences, catalogus #25-053-CI) en 0,3% collagenase (Worthington Biochemical, catalogus #LS004176).

Groeimedia voor dergelijke experimenten bestonden uit DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen, catalogus #26140-079), 2 mM L-glutamine (Corning, catalogus #25-005-CI) en 40 ng/ml zenuwgroeifactor (Fisher Scientific, catalogus #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) werd gebruikt voor het verwijderen van niet-neuronale cellen.

Voor experimenten uitgevoerd aan de Universiteit van Virginia waarbij NGF-onttrekking betrokken was, werden de cellen uitgeplaat op kamerglaasjes bekleed met 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) en 10 mg/ml laminine (Invitrogen), en werd de dissociatie uitgevoerd via 20-min incubatie in buffer bestaande uit DMEM/F12 dat BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), collagenase type 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma) en hyaluronidase (Sigma-Aldrich) bevat. Groeimedia voor dergelijke experimenten bestonden uit DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen), 1 U/ml penicilline/streptomycine (Invitrogen) en 45 ng/ml NGF (gezuiverd uit speekselklieren); 10 mM Ara-C werd gebruikt voor het verwijderen van niet-neuronale cellen.

Cel behandelingen

Gedifferentieerde LUHMES-cellen werden op hun vijfde dag in het differentiatiemedium blootgesteld aan de aangegeven concentraties van {{0}}hydroxydopamine (6-OHDA; Sigma-Aldrich, catalogus #162957) of vehikeloplossing. Voorraden van 6- OHDA werden bereid in gekoelde PBS die 0,02% ascorbaat bevatte (Sigma-Aldrich, catalogus #A5960), en porties werden bewaard in tegen licht beschermde flesjes onder inert gas bij 80 graden. Na 24 uur behandeling werden de cellen gefixeerd door 25 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in PBS dat 4% paraformaldehyde (PFA) bevatte.

Om de rol van c-Jun N-terminale kinase (JNK) bij degeneratie van neurieten geïnduceerd door oxidatieve stress te bepalen, werden de culturen gedurende 1 uur voorbehandeld met 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, catalogus #S5567) of vehikeloplossing vóór volledige vervanging van media door media die 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA en 10 mM SP600125 bevatten, of voertuigoplossingen. Er werden voorraden SP600125 bereid door de remmer op te lossen in steriel dimethylsulfoxide (DMSO), en bevroren hoeveelheden werden bewaard in tegen licht beschermde flesjes gevuld met inert gas van 20 graden. Behandelingen werden zodanig uitgevoerd dat cellen werden blootgesteld aan niet meer dan 0,1% DMSO.

Primaire kweken van sympathische neuronen werden behandeld op DIV5. Voor experimenten met neurietendegeneratie geïnduceerd door waterstofperoxide, werden de culturen blootgesteld aan 500 mM waterstofperoxide (Sigma-Aldrich, catalogus #H1009-100ML) of vehikeloplossing bestaande uit steriel water (Cytiva, catalogus #SH30529.02) voor 24 uur.

Voor experimenten waarbij NGF-onttrekking betrokken was, ontvingen SCG-culturen ofwel een mediavervanging door groeimedia of werden ze onderworpen aan NGF-deprivatie. SCG-culturen waarvan NGF moest worden onthouden, werden driemaal gespoeld met NGF-vrije groeimedia en vervolgens 80 uur geïncubeerd in NGF-vrije groeimedia zonder mediaveranderingen. Na de behandeling werden de cellen gefixeerd door 30 minuten incubatie in 4% PFA in PBS, gevolgd door verwijdering van het PFA door spoelen met PBS.

Kleuring en fluorescentiemicroscopie

Voor experimenten met LUHMES-cellen, evenals de experimenten met sympathische neuronen behandeld met waterstofperoxide, werden objectglaasjes met acht putjes met daarin gefixeerde cellen gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 in PBS en geblokkeerd voor 1 uur met 10% normaal geitenserum in PBS met 0,1% Triton X-100. De objectglaasjes werden vervolgens een nacht bij 4 graden in een blokkerende oplossing geïncubeerd met een primair antilichaam dat specifiek is voor BI-tubuline (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773). Vervolgens werden de objectglaasjes gewassen met PBS, gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met een secundair antilichaam gekoppeld aan Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) en onderworpen aan extra wasbeurten.

Voor experimenten waarbij kleuring met tyrosinehydroxylase (TH) betrokken was, werden de objectglaasjes onderworpen aan een extra incubatie in PBS met 10% normaal geitenserum, 0,1% Triton X-100, een antilichaam specifiek voor TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) bij 4 graden gedurende de nacht. De objectglaasjes werden vervolgens gewassen met PBS, geïncubeerd met een secundair antilichaam gekoppeld aan Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) en onderworpen aan aanvullende PBS-wasbehandelingen.

Na voltooiing van de immunolabeling voor bIII-tubuline of TH werden de objectglaasjes gedurende 5 minuten geïncubeerd met 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-fenylindool (DAPI; catalogus #D9542) in PBS. De objectglaasjes werden vervolgens gewassen met PBS en de dekglaasjes werden gemonteerd met behulp van Fluoromount G-montagemedium (Southern Biotech, catalogus #0100-01).

Voor experimenten met sympathische neuronen die werden onderworpen aan NGF-onttrekking, werden de objectglaasjes gedurende 1 uur geblokkeerd door incubatie bij kamertemperatuur in een buffer bestaande uit 5% normaal geitenserum (Life Technologies) en 0.0005% Triton X-100 in PBS, gevolgd door incubatie in primaire antilichaamoplossing die muis-anti-muis Tuj1 (1:1000, Covance) bevat, overnacht bij 4 graden. Vervolgens werden de objectglaasjes gespoeld met PBS, gedurende 1 uur geïncubeerd in geit-anti-muis IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) en 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) in blokkeerbuffer, onderworpen aan aanvullende PBS-spoelingen en toegestaan drogen. De objectglaasjes werden gemonteerd met Fluoromount-G (Southern Biotech, catalogus #0100-01) en bewaard bij kamertemperatuur.

Dia's met LUHMES-cellen werden gevisualiseerd met een 20-objectief van een Nikon Eclipse II Ti-U omgekeerd microscoopsysteem met een Lumencor Mira 4-Channel LED-lichtbron. 1280 1024-pixelafbeeldingen zijn gemaakt met een Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD-camera en NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Tenzij anders aangegeven, zijn alle fasecontrastbeelden vastgelegd met instellingen voor lichtintensiteit en belichtingstijd die een gemiddelde achtergrondintensiteit van 165 in 8-bit-afbeeldingen opleverden.

Om achtergrondschaduw of andere inconsistenties te verminderen, werd vóór elke microscopiesessie een beeld van een lege put gemaakt en gebruikt voor achtergrondcorrectie tijdens LUHMES-celbeeldvorming. Objectglaasjes met sympathische neuronen gekweekt aan de Eastern Kentucky University of de Universiteit van Virginia werden afgebeeld met behulp van respectievelijk een Zeiss LSM 800 microscoopsysteem of een Zeiss LSM 980 microscoopsysteem. Beelden werden vastgelegd met een vergroting van 20 en een resolutie van 1024 1024 met behulp van Zen-software (Carl Zeiss Microscopy).

Analyse van de levensvatbaarheid van de cellen

Gedifferentieerde LUHMES-celculturen werden tot stand gebracht op Lab Tek II-glaasjes met acht putjes die zoals aangegeven waren gecoat met verschillende substraten. Elke 48 uur werd een mediawisseling van 50% uitgevoerd en de cellen werden op de zesde dag van differentiatie gefixeerd met 4% PFA in PBS. Dia's met gefixeerde cellen werden onderworpen aan kleuring met DAPI, en beelden van nucleaire kleuring werden vastgelegd met een Nikon Eclipse II Ti-U omgekeerd microscoopsysteem en een Nikon DS-Fi1 5 MP CCD-camera.

Cellen werden door een geblindeerde onderzoeker beoordeeld als gezond of ongezond op basis van het uiterlijk van de kernen. Cellen met een verminderd nucleair oppervlak of nucleaire fragmentatie werden als ongezond gescoord. Het aantal gezonde cellen per afbeelding werd in elk experiment beoordeeld voor ten minste vijf gezichtsvelden per conditie.

DI-metingen

Traditionele DI-metingen werden uitgevoerd met behulp van een Fiji Is Just ImageJ (FIJI)-pakket met ImageJ 1.52p via een methode met veel geciteerde parameters voor DI-analyse (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin en Cho, 2020). Acht-bits afbeeldingen van gedifferentieerde LUHMES-cellen met goed gescheiden axonkanalen werden onderworpen aan binarisatie met behulp van het standaard binarisatie-algoritme, met binaire opties geconfigureerd om een ​​afbeelding te produceren met zwarte cellen op de voorgrond en een witte achtergrond.

Het tekengereedschap uit de vrije hand werd gebruikt om handmatig alle afbeeldingsgebieden met cellichamen te traceren, en alle zwarte pixels in de getraceerde gebieden werden omgezet in wit. De Measure-tool van ImageJ werd toegepast om het totale zwarte gebied van de gebinariseerde afbeeldingen te meten die uitsluitend neurieten bevatten. Vervolgens werd het hulpmiddel Deeltjes analyseren toegepast met een grootte-instelling van 20–10,000 pixels en een circulariteitsinstelling van 0,2–1,0 om neurietfragmenten te detecteren. Het opgetelde gebied van alle neurietfragmenten werd vervolgens gedeeld door het totale zwarte gebied om de DI van het beeld te berekenen.

Voor experimenten gerelateerd aan de optimalisatie van grootteparameters voor de identificatie van neurietfragmenten werden circulariteitscriteria van {{0}}.2–1.00 gebruikt voor alle deeltjesmetingen. De Particle Remover-plug-in (versie 20{{10}}4/02/09), ontwikkeld door Wayne Rasband, is verkregen van https://imagej.nih.gov/. Waar aangegeven werd de toepassing van de Particle Remover-plug-in met behulp van grootteparameters van 0-9 pixels en circulariteitsparameters van 0,0-1,0 uitgevoerd om kleine, niet-neurietobjecten te verwijderen uit gebinariseerde beelden verkregen uit fasecontrastmicrofoto's.

Op dezelfde manier werden grootteparameters van {{0}}–4 pixels en circulariteitsparameters van 0–1,0 gebruikt om kleine objecten te verwijderen uit gebinariseerde beelden verkregen uit fluorescentiemicrofoto's die b III-tubuline-immunokleuring vertegenwoordigen. Tenzij anders aangegeven, werden vóór DI-analyse alle fasecontrastbeelden onderworpen aan contrastverbetering door ImageJ te gebruiken om een ​​Lookup Table (LUT) toe te passen met een minimum van 90 en een maximum van 205.

Meting van kunstmatige fragmentatie

Culturen die gezonde LUHMES-cellen bevatten, werden op de zesde dag van differentiatie gefixeerd met 4% PFA en immunologisch gemerkt voor bIII-tubuline. Met behulp van een 20-objectief werden 1280 1024-pixelfasecontrastmicrofoto's en fluorescentiemicrofoto's, die elk identieke gezichtsvelden weergeven, vastgelegd uit willekeurig bemonsterde gebieden. Er zijn in totaal tien sets afbeeldingen gemaakt van negen afzonderlijke culturen.

ImageJ werd gebruikt om gebinariseerde kopieën te genereren van de originele fasecontrast- en fluorescentiemicrofoto's, evenals kopieën van fasecontrastmicrofoto's die werden gebinariseerd na contrastverbetering via toepassing van een LUT met een minimum van 90 en een maximum van 205. Voor elke set van de beelden identificeerde een geblindeerde onderzoeker een klein 150 150-pixelgebied van de oorspronkelijke fasecontrastmicrofoto met uitsluitend gezonde en intacte neurieten.

De regiogrootte en coördinaten werden vervolgens opgeslagen in de Region of Interest (ROI) -manager van ImageJ en gebruikt om DI-metingen uit te voeren in analoge gebieden van gebinariseerde afbeeldingen uit dezelfde beeldset. De DI-metingen werden uitgevoerd met behulp van de traditionele methode met fragmentgrootteparameters van 20 -10,000 pixels. Omdat alle gemeten gebieden uitsluitend intacte neuronen bevatten, werden alle gedetecteerde fragmenten als kunstmatige fragmenten beschouwd.

ANDI Macro

De ANDI Macro is geschreven met behulp van de ImageJ Macro-taal. De macro beschikt over een reeks bewerkingen waarmee de gebruiker paden voor drie mappen kan selecteren, één map met afbeeldingen van neuronen die immunologisch zijn gemerkt voor een neuronale marker zoals b III-tubuline, een tweede map met overeenkomstige afbeeldingen die nucleaire kleuring weergeven, en een derde map. aangewezen voor het opslaan van resultaatbestanden. De fragmentgebieden en totale neurietgebieden van de afbeeldingen in de geselecteerde mappen worden vervolgens berekend via een reeks ImageJ-bewerkingen. Kortom, een afbeelding met nucleaire labeling wordt geopend, onderworpen aan contrastverbetering en gebinariseerd. De deeltjesverwijderingsplug-in wordt gebruikt om kleine, niet-nucleaire artefacten uit het gebinaire beeld te verwijderen, en het gebinaire beeld wordt onderworpen aan een reeks dilataties en erosies.

Een overeenkomstig beeld van cellen die immunologisch zijn gemerkt voor bIII-tubuline (of een andere neuronale marker) wordt geopend en onderworpen aan contrastverbetering. Het gebinariseerde beeld dat vergrote celkernen afbeeldt, wordt vervolgens afgetrokken van het beeld met cellen die immunologisch zijn gemerkt voor bIII-tubuline, waardoor een beeld wordt gegenereerd dat uitsluitend neurieten bevat. Het neurietbeeld wordt vervolgens gebinariseerd en onderworpen aan de verwijdering van deeltjes tussen 0 en 4 pixels. Het gebied van het Neurietfragment wordt berekend door het Analyse Particle-algoritme toe te passen om deeltjes te meten met een circulariteit tussen 0.2 en 1.0 en een grootte tussen 5 en 10,0000 pixels. Het totale neurietoppervlak wordt berekend door het meetinstrument toe te passen om het totale zwarte gebied te berekenen. Een afbeelding die het gebinariseerde neurietgebied met gemarkeerde fragmenten weergeeft, wordt opgeslagen in een door de gebruiker aangewezen map, samen met .csv-bestanden die het gefragmenteerde neurietgebied en de totale metingen van het neurietgebied rapporteren.

Naast de bovengenoemde bewerkingen zijn er verschillende aanvullende bewerkingen in de macro opgenomen om het gebruiksgemak te ondersteunen en gebruikersfouten te beperken. Deze omvatten functies die schaalinformatie uit afbeeldingen verwijderen en ervoor zorgen dat metingen in pixeleenheden worden verkregen; configureer de ImageJ-kleurinstellingen en binaire opties voor de juiste beeldaftrekking en binarisatie; verifieer dat de geselecteerde mappen voor afbeeldingen van b III-tubulinekleuring en DAPI-kleuring een gelijk aantal afbeeldingen bevatten; sluit eerder gebruikte afbeeldingen om de verwerkingstijd te verbeteren; duidelijke resultaten uit eerdere analyses voordat nieuwe analyses worden uitgevoerd; en voorkom fouten die verband houden met het maken van .ini-bestanden door Windows 10.

Voor experimenten waarbij analyses van sympathische neuronen betrokken zijn, is de ANDI-macro herzien om een ​​operatie op te nemen die een dialoogvenster presenteert waarmee de gebruiker kan bepalen hoe vaak binaire afbeeldingen van kernen worden verwijd. De versie van ANDI met deze herziening werd ANDI v1.1 genoemd. Als u de waarde in het dialoogvenster naar een hoger getal wijzigt, wordt de soma-verwijderingsgrootte vergroot, terwijl het wijzigen van de waarde naar een lager getal de soma-verwijderingsgrootte verkleint. De standaardwaarde is 12, wat het aantal dilataties is dat wordt gebruikt voor alle experimenten met LUHMES-cellen. Een waarde van 16 werd gebruikt om grotere cellichaamgebieden te verwijderen tijdens analyses van sympathische neuronen.

De ANDI Macro is open source en gratis beschikbaar voor gebruik of wijziging via de volgende URL: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. De nauwkeurige werking van ANDI is geverifieerd met behulp van meerdere personal computers met het Windows 10-besturingssysteem. Een beeldenset met LUHMES-celculturen die verschillende graden van neurietdegeneratie vertonen, is ook beschikbaar op het bovengenoemde webadres en kan worden gebruikt om de nauwkeurige uitvoering van de macro door andere typen computers te onderzoeken. Het webadres biedt ook toegang tot een protocol waarin wordt beschreven hoe de macro moet worden gebruikt.

Tijdschattingen

Om de tijd te evalueren die nodig is om DI-metingen handmatig uit te voeren, zijn fasecontrastmicrofoto's gemaakt van LUHMES-cellen die zijn behandeld met een voertuigoplossing, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, of 7,5 mM 6-OHDA werd onderworpen aan DI-scores met behulp van eerder vastgestelde methoden (Kraemer et al., 2014). Elke afbeelding werd onderworpen aan contrastverbetering en binarisatie. Het gereedschap uit de vrije hand van ImageJ werd vervolgens gebruikt om alle afgebeelde cellichamen digitaal uit de gebinariseerde afbeeldingen te verwijderen. Het gereedschap Deeltjes analyseren werd gebruikt om fragmenten te meten met een circulariteit tussen 0.2 en 1.0 en een grootte tussen 20 en 10,000 pixels, en het gereedschap Meten werd gebruikt om het totale neurietoppervlak te bepalen.

Waarden over het gefragmenteerde neurietengebied en het totale neurietengebied werden overgebracht naar een spreadsheet in Microsoft Excel, en een wiskundige bewerking in Excel werd gebruikt om de DI-scores te berekenen. Nadat een afbeelding met ImageJ was geopend, werd de tijd gemeten die nodig was om elk van deze procedures handmatig uit te voeren. De gemiddelde analysetijden werden berekend op basis van in totaal 36 afbeeldingen. De beelden werden verkregen uit negen onafhankelijke celcultuurpreparaten, en analyses werden uitgevoerd met behulp van één beeld per behandelingsconditie van elk celcultuurpreparaat. Om de snelheid te bepalen van DI-metingen die werden uitgevoerd met behulp van de ANDI Macro, werden dezelfde beeldsets gebruikt om de tijd te bepalen die nodig was om de macro in ImageJ te openen, de macrobewerkingen uit te voeren, de gegevens naar een Excel-spreadsheet over te brengen en de DI te berekenen.

Statistieken

Kwantitatieve vergelijkingen worden gepresenteerd als box- enwhiskerplots, waarbij de middelste lijn de mediaan weergeeft, boxen zich uitstrekken tot het 25e en 75e percentiel, enwhiskers het 5e en 95e percentiel weergeven. Middelen werden statistisch vergeleken in GraphPad Prism 9.1.2 door herhaalde ANOVA-metingen met post-hocvergelijkingen met behulp van een Sidák-correctie. De normaliteit voor kwantitatieve gegevens werd getest met behulp van de Shapiro-Wilk-test in IBM SPSS 26.

Wanneer de aanname van normaliteit werd geschonden (figuren 1C, 3D), werden groepsvergelijkingen uitgevoerd via de niet-parametrische Friedman-test, waarbij Dunn's test werd uitgevoerd voor post-hocvergelijkingen. Correlationele analyses worden weergegeven als spreidingsdiagrammen en bevatten de best passende lijnen. Dergelijke relaties werden geanalyseerd met behulp van Pearson product-moment correlaties of Spearman's r wanneer de aanname van normaliteit werd geschonden. De normaliteit van residuen voor correlatieanalyse werd beoordeeld door visuele inspectie van overeenkomstige QQ-plots.

Pearson product-moment correlatiecoëfficiënten werden met elkaar vergeleken met behulp van de asymptotische z-test van Steiger (Steiger, 1980; Lee en Preacher, 2013). Er zijn geen uitschieters uitgesloten. Statistische significantie werd geaccepteerd bij p=0,05. P-waarden worden afgerond op vier decimalen en worden in de hoofdtekst vermeld. Effectgroottes en 95%-betrouwbaarheidsintervallen worden ook gerapporteerd voor parametrische analyses, waarbij effectgroottes in de hoofdtekst worden beschreven en betrouwbaarheidsintervallen worden vermeld in Tabel 1.

Beschikbaarheid van data

Aanvullende gegevens over dit artikel zullen op redelijk verzoek worden gedeeld.

Toegankelijkheid van codes

De code/software die in het artikel wordt beschreven, is gratis online beschikbaar op https://github.com/kraemerb/kraemerlab. De code is beschikbaar als Extended Data 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com