Kwantitatieve beoordeling van ontstekingsinfiltraten in niertransplantatiebiopten met behulp van multiplex-tyramide-signaalversterking en diepgaand leren

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Abstract

Vertraagde graftfunctie (DGF) is een sterke risicofactor voor de ontwikkeling van interstitiële fibrose en tubulaire atrofie (IFTA) bij niertransplantaties. Kwantitatieve beoordeling van inflammatoire infiltraten in nierbiopten van DGF-patiënten kan voorspellende markers voor IFTA-ontwikkeling onthullen. In deze studie hebben we multiplex tyramide signaalversterking (mTSA) en convolutionele neurale netwerken (CNN's) gecombineerd om de inflammatoire micro-omgeving te beoordelen in nierbiopten van DGF-patiënten (n=22) genomen 6 weken na transplantatie. Patiënten werden gestratificeerd voor IFTA-ontwikkeling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola voorkomt nierziekte, klik hier voor het monster

Invoering

Vertraagde transplantaatfunctie (DGF) na niertransplantatie is multifactorieel en voornamelijk gerelateerd aan donorkenmerken en ischemietijd. DGF wordt over het algemeen beschreven als de noodzaak van dialyse binnen 7 dagen na transplantatie en is een sterke risicofactor voor chronisch niertransplantaatletsel [1-3]. Een klassiek onderdeel van chronisch nierletsel is de aanwezigheid van interstitiële fibrose en tubulaire atrofie (IFTA). Niet alle DGF-patiënten ontwikkelen echter IFTA en de complexe relatie tussen DGF en IFTA wordt nog steeds slecht begrepen. Dit komt ten eerste door de vertraging tussen potentieel oorzakelijke gebeurtenissen en functionele achteruitgang, en ten tweede door de variabele en complexe effecten van potentiële inductoren zoals afstoting en bijwerkingen van medicatie [1, 4]. De algemene aanwezigheid van ontsteking en specifieke macrofagen is in talrijke studies beschreven als een voorspeller voor transplantaatverlies [5-8]. De onderliggende pathologische processen worden echter niet volledig begrepen en hoge niveaus van ontsteking leiden niet altijd tot langdurig transplantaatverlies. Als gevolg van omgevingsstimuli verwerven macrofagen gespecialiseerde functies en polariseren ze in verschillende fenotypes. Talrijke studies suggereren dat specifieke macrofaagsubtypes (alternatief geactiveerde macrofagen) betrokken zijn bij weefselremodellering door weefselherstel of fibrose te induceren. Van de polarisatie naar een weefselhermodellerend (soms pro-fibrotisch) fenotype is bekend dat het afhankelijk is van een breed scala aan omgevingsstimuli, onder andere geleverd door subtypes van T-helperlymfocyten [9-11]. Beoordeling van T-helpercelpopulaties in het transplantaat ten tijde van DGF onthulde een overwegend T-helper 1-subtype, maar correlaties met transplantaatuitkomst of progressie naar IFTA werden tot nu toe niet onderzocht [12]. Een uitgebreide beoordeling van de inflammatoire micro-omgeving, specifiek gericht op macrofagen en T-helpercelsubsets in zorgvuldig geselecteerde patiëntencohorten, zou inzicht kunnen verschaffen in waarom sommige, maar niet alle DGF-patiënten doorgaan naar de ontwikkeling van IFTA.

Een uitgebreid onderzoek naar ontstekingsinfiltraten wordt echter bemoeilijkt door een aantal (technische) beperkingen. Traditionele immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentietechnieken ondersteunen de visualisatie van slechts een beperkt aantal celmarkers in één weefselsectie. Seriële coupes van kleine, waardevolle weefselfragmenten zoals nierbiopten zijn niet gewenst en de interpretatie van relaties tussen cellen in verschillende coupes is moeilijk. Bovendien gaat de kwantitatieve beoordeling van de inflammatoire infiltraten door visuele schatting gepaard met een significant niveau van interobservervariabiliteit [13]. Traditionele beeldverwerkingstechnieken zoals pixeldrempelwaarde, stroomgebied en op morfologie gebaseerde segmentatie zijn afhankelijk van voorkennis van alle morfologische celrepresentaties en weefselkleuringintensiteit in een dataset [14-16]. Daarom missen deze methoden vaak robuustheid voor biologische en technische beeldvariaties en vertalen ze slecht naar nieuwe of externe datasets. De opkomst van digitale pathologie heeft de ontwikkeling van alternatieve methoden voor de beoordeling van hele diabeelden (WSI) versneld [17, 18]. Deep learning-modellen, met name convolutionele neurale netwerken (CNN's) hebben bewezen in staat te zijn om relevante biologische structuren in histopathologische dia's te segmenteren en te detecteren [19-23]. Deze technieken hebben het potentieel om van subjectieve visuele schatting en traditionele beeldverwerking over te gaan naar nauwkeurige, objectieve en reproduceerbare celdetectie.

Het doel van deze studie is om een ​​methode te ontwikkelen voor objectieve, kwantitatieve beoordeling van meerdere inflammatoire celmarkers, waardoor de noodzaak van uitgebreide seriële coupes van dia's wordt omzeild. Om dit te doen, combineren we multiplex IHC, multi-spectrale beeldvorming en deep learning-modellen. Om de toepasbaarheid van deze technieken aan te tonen, bestuderen we de correlaties van de inflammatoire micro-omgeving, gekwantificeerd door deep learning-modellen, met de ontwikkeling van IFTA in surveillance-transplantaatbiopten van DGF-patiënten.

cistanche-extract voor de behandeling van nierziekten

materialen en methodes

Om de inflammatoire micro-omgeving in nierbiopten van DGF-patiënten te beoordelen, hebben we multiplex IHC uitgevoerd op surveillancebiopten die 6 weken na transplantatie zijn genomen. Patiënten werden gestratificeerd voor IFTA-ontwikkeling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Weefselmonsters

We gebruikten bewakingsbiopten van ontvangers van niertransplantaties aan de Hannover Medical School (Hannover, Duitsland), verkregen in de context van een prospectief bewakingsbiopsieprogramma. Inclusiecriteria waren: DGF optreden (gedefinieerd als<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA-beoordeling

De mate van interstitiële fibrose (ci) en tubulaire atrofie (ct) (IFTA) na 6 weken en 6 maanden, uitgedrukt met behulp van het Banff laesiebeoordelingssysteem [24] werd verkregen uit het pathologierapport. Om de relatie tussen vroege inflammatoire infiltraties en IFTA-ontwikkeling in meer detail te beoordelen, werden alle PAS-gekleurde dia's gedigitaliseerd voor heronderzoek met behulp van een Pannoramic 250 Flash II digitale diascanner (3DHistech, Hongarije) met een 20 × objectief met een resolutie van 0,24 m/pixel. De PAS WSI van beide tijdstippen (6 weken en 6 maanden) werden door drie nierpathologen gescoord voor de omvang van IFTA (percentage oppervlakte, met 10 procent intervallen). De gemiddelde IFTA-scores van de pathologen werden als eindscore gebruikt om de verandering in IFTA tussen 6 weken en 6 maanden na transplantatie te berekenen. Patiënten werden gestratificeerd naar absolute toename van de IFTA-score van 10 procent of meer (n=13) en geen of<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Bovendien werden de Banff-laesiescores vergeleken tussen tijdspunten met behulp van de door Wilcoxon ondertekende rangentest. Dit bracht significante verschillen aan het licht tussen biopsieën van 6 weken en 6 maanden voor Banff-categorieën ti (p=0.017), ci (p=0.004) en ct (p=0.011) .

Multiplex TSA-kleuring

We voerden multiplex IHC uit met behulp van mTSA om meerdere celmarkers in de biopsieën van 6 weken te visualiseren. Na incubatie met een primair en secundair antilichaam werd het weefsel behandeld met fluorescerend gelabeld tyramide. Het mierikswortelperoxidase uit het secundaire antilichaam katalyseert de vorming van actieve tyramideradicalen. De tyramideradicalen binden covalent aan de tyrosineresten op het antigeen. Deze permanente binding zorgde voor door warmte geïnduceerde verwijdering van het primair-secundaire antilichaamcomplex met behoud van de fluorescerende tyramide-afzetting [25]. Dit maakte de daaropvolgende opeenvolgende incubatie met verdere antilichamen van dezelfde soort tegen de doelantigenen mogelijk.

mTSA werd uitgevoerd op twee opeenvolgende glaasjes van de 6 weken durende surveillancebiopten. We hebben twee mTSA-panels ontwikkeld om het inflammatoire infiltraat en de peritubulaire capillaire omvang in onze patiëntengroepen te beoordelen. Paneel I bestond uit anti-CD3-, CD4-, CD8-, CD20-, CD68- en CD34-antilichamen. Paneel II werd gebruikt om de T-helpercel- en macrofaagpolarisatie te onderzoeken met behulp van anti-CD4-, Tbet-, GATA3-, CD68- en CD163-antilichamen. Antilichaamspecificaties, verdunningen en kleurvolgorden staan ​​vermeld in aanvullende tabel 1. Alle objectglaasjes werden gedeparaffineerd in xyleen, gedehydrateerd in 95 procent ethanol, gewassen in leidingwater en gekookt om epitoop te verkrijgen in 10x verdund triboraat-EDTA (TBE 10x , 0658, VWR Life Sciences, VS) buffer. Na afkoeling werden de objectglaasjes gewassen in 3 procent waterstofperoxidase-oplossing voor endogene peroxidaseblokkering en gewassen met een tris-gebufferde zoutoplossingbuffer met 0,05 procent Tween 20 (822184, Merck KGaA, Duitsland) (TBS-T). Eiwitblokkering werd uitgevoerd met behulp van TBS-T met 1 procent runderserumalbumine (BSA) (mTSA-stap 1). Primaire antilichamen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius geïncubeerd (mTSA-stap 2). Na wassen in TBS-T werden de objectglaasjes 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, The Netherlands) (mTSA stap 3). Vervolgens werd TSA uitgevoerd met behulp van de Opal TSA-fluorforen uit een Opal 7-kleuren Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, VS) (mTSA stap 4) (fluorforen en hun overeenkomstige antilichamen worden vermeld in aanvullende tabel 1). Het antilichaam-TSA-complex werd verwijderd met een kookcyclus in TBE-buffer (mTSA-stap 5). mTSA-stappen 1-5 werden herhaald totdat de objectglaasjes waren gekleurd met alle antilichamen van het betreffende paneel. De objectglaasjes werden bedekt met fluormount-G met DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, VS).

herba cistanche

Multiplex TSA-validatie

Herhaalde kookcycli kunnen de affiniteit van het doelepitoop beïnvloeden. Sommige antilichamen vertonen een zwakker kleurpatroon nadat het weefsel meerdere keren is gekookt, andere antilichamen hebben meer kookcycli nodig om de optimale kleurintensiteit te bereiken, en andere worden helemaal niet beïnvloed. We hebben dit effect voor alle antilichamen beoordeeld met behulp van chromogene IHC op FFPE-controle tonsillen weefsel. Voor elk getest antilichaam (n=9) werden zes secties gesneden (4 m dik). Alle objectglaasjes werden gedeparaffineerd in xyleen, gedehydrateerd in 95 procent ethanol, gewassen in kraanwater en gekookt voor epitoopwinning in 10x verdunde TBE (kookcyclus één). Na afkoeling werd één objectglaasje per getest antilichaam bewaard in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De overige glaasjes werden opnieuw gekookt. Deze cyclus werd vijf keer herhaald. Alle objectglaasjes werden vervolgens gewassen in 3% waterstofperoxidase-oplossing en gevolgd door spoelen in PBS. Primaire antilichamen (aanvullende tabel 1) werden 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na incubatie werden de objectglaasjes gewassen in PBS. Objectglaasjes gekleurd met anti-CD68-, Tibet- en GATA3-antilichamen vereisten een extra incubatie met post-antilichaamblokkering (PAB) gedurende 15 minuten (VWRKDPVB-blokkering, Immunologic, Nederland). Na incubatie werden de objectglaasjes gewassen in PBS en geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (volgens PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nederland, zie voor andere secundaire antilichaam aanvullende tabel 1). Visualisatie werd uitgevoerd met behulp van 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nederland). De resultaten zijn gevisualiseerd in aanvullende figuur 1. Op basis van deze resultaten hebben we de optimale antilichaamvolgorde voor de mTSA-experimenten bepaald, zoals vermeld in aanvullende tabel 1.

Als epitopen van belang co-gelokaliseerd zijn, kunnen de tyramide-afzettingen met elkaar interfereren. Om deze sterische remming te testen, gebruikten we weefselglaasjes voor amandelcontrole en kleurden deze met onze mTSA-panelen. De antilichaamexpressie in de mTSA werd vergeleken met die in enkelgekleurde objectglaasjes, die hetzelfde aantal kookcycli doorliepen. We hebben geen verschillen waargenomen in kleurpatronen tussen de enkelvoudig en multiplex-gekleurde objectglaasjes (voorbeelden opgenomen uit het paneel I, aanvullende figuren 2 en 3). Alle primaire antilichamen in de mTSA werden gebruikt in dezelfde verdunning die werd gebruikt voor chromogene IHC. De intensiteit van het fluorescerende signaal werd geoptimaliseerd door de verdunningen van de TSA-oplossing aan te passen.

Multiplex TSA-beeldvorming

Multispectrale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, VS) met een 20x objectief, met een resolutie van 0,49 m per pixel, en met behulp van DAPI, FITC, CY3, Texas Red en Cy5 spectrale kubussen. Het Vectra-systeem maakt handmatige selectie van regio's voor multispectrale acquisitie mogelijk, die vervolgens door het systeem in tegels worden verdeeld (Fig. 1.1). De spectra van autofluorescentie en alle Opal TSA-fluorforen werden vooraf opgenomen in een spectrale "bibliotheek" met behulp van de Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, VS). De spectrale bibliotheek maakte het mogelijk om de multiplextegel te ontbinden in meerdere afzonderlijke tegels die de bijdrage van elke fluorofoor vertegenwoordigen ("ontmengen"). Dit resulteerde in monochrome tegels met meerdere kanalen, waarbij elk kanaal overeenkomt met een enkele fluorofoor en dus antilichaam (Fig. 1.2).

Conversie naar kunstmatige helderveld IHC

Op basis van opgeslagen coördinaten werden de tegels genaaid om een ​​meerkanaals WSI te creëren met behulp van een aangepast python-script (Fig. 1.3). De kanalen die het DAPI-signaal (IDAPI) vertegenwoordigen en de kanalen die een van de antilichamen (IIHC) vertegenwoordigen, werden omgezet in respectievelijk kunstmatige hematoxyline- en DAB-kleuring (Fig. 1.4 en 1.5). Op basis van bekende chromatische hematoxyline en DAB Cx, Cy-coördinaten na transformatie van tint-verzadiging-densiteit (HSD), werden in eerdere onderzoeken kleurvectoren verkregen [26, 27]. Deze kleurvectoren werden gebruikt om de rood-groen-blauwe waarden voor de kunstmatige helderveld-IHC te berekenen (Fig. 1.5), als:

met CR, st de lichtabsorptie van kleurstof st in het rode deel van het spectrum. De waarden voor B en G werden op een vergelijkbare manier berekend.

Foto analyse

Regio's van belang (ROI's)

Regio's van belang (ROI's) werden geannoteerd voor elk geval in het cohort met behulp van de geautomatiseerde dia-analyseplatformsoftware (ASAP; versie 1.9, beschikbaar als open-sourcesoftware op GitHub). Deze ROI's bestonden uit corticale tubulointerstitium, dus exclusief de capsule, glomeruli en slagaders. Aangezien een ontsteking in de subcapsulaire regio's van de nieren als niet-specifiek wordt beschouwd in transplantatiepathologie, werden de biopsieën in deze studie voornamelijk geanalyseerd met uitzondering van de subcapsulaire regio (gedefinieerd als 400 µm onder het kapsel). Ten tweede hebben we de analyses herhaald, inclusief het subcapsulaire gebied. Visuele voorbeelden van de ROI's zijn opgenomen in aanvullende figuur 4.

Lymfocytdetectie CNN I

De kunstmatige Brightfield IHC-afbeeldingen die CD3-, CD4-, CD8- en CD20-kleuring vertegenwoordigen, werden geanalyseerd met behulp van een bestaande CNN met een U-Net-architectuur [22, 28]. Dit netwerk is speciaal ontworpen voor de detectie van cytoplasmatische lymfocytmarkers in IHC. CNN-prestaties kunnen worden uitgedrukt in precisie, herinnering en een F1--score, waarbij:

De CNN behaalde een precisie van {{0}},76, een recall van 0,79 en een F1-score van 0,78 op de testset dat werd gebruikt in het originele papier, bestaande uit traditionele IHC WSI. Detectie van individuele positieve cellen vereist drempelwaarde voor de CNN-uitvoer, gevolgd door nabewerking. Omdat de CD3-kleuring in het mTSA-paneel sterker was in vergelijking met CD4, CD8 en CD20, werd een lagere objectdetectiedrempel gebruikt voor de laatste drie (0,4) en de oorspronkelijke objectdetectiedrempel voor CD3 (0,7). Om de CNN-prestaties op de kunstmatige Brightfield IHC WSI's in dit onderzoek te beoordelen, werden in dit onderzoek vier kunstmatige Brightfield IHC WSI's (CD8 en CD20 van twee patiënten) als testset gebruikt. Puntannotaties (n=1115) werden gegenereerd met ASAP-software. Na het toepassen van het netwerk werden de precisie, recall en F1--score berekend om de CNN-prestaties te beoordelen. Detecties werden als echt positief beschouwd als ze werden gevonden binnen 4 µm (gemiddelde lymfocytdiameter) vanaf een grondwaarheidsannotatie. Wanneer twee detecties werden gevonden binnen een bereik van 4 µm, werd alleen de detectie die het dichtst bij de annotatie lag als echt positief beschouwd. Vervolgens werd lymfocytdetectie CNN I gebruikt voor de analyse van alle kunstmatige helderveld IHC WSI die cytoplasmatische lymfocytmarkers vertegenwoordigen (CD3, CD4, CD8 en CD20).

Lymfocytdetectie CNN II

De analyse van kunstmatige helderveld IHC WSI met nucleaire kleurpatronen (zoals gepresenteerd door T-bet en GATA3) kanalen die DAPI en CD4 vertegenwoordigen, werden geselecteerd om te worden gecombineerd in één WSI (4). Vlekvectoren verkregen in eerdere onderzoeken werden gebruikt om het DAPI-signaalblauw (hematoxyline) en het CD4-signaalbruin (DAB) kunstmatig te kleuren, wat resulteerde in een kunstmatige helderveld IHC WSI (5).

vereiste training, validatie en testen van een nieuwe CNN. Voor dit doel werden negen objectglaasjes gesneden uit nier-, tonsil- en appendix-FFPE-controleweefsel. Deze objectglaasjes waren IHC-gekleurd met anti-Tibet (kloon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, VS) en anti-GATA3 (kloon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nederland) antistoffen. De dia's werden gedigitaliseerd met behulp van een Pannoramic 250 Flash II digitale diascanner met een resolutie van 0,12 m/pixel. Twee waarnemers maakten met ASAP-software 5726 puntannotaties in verschillende regio's. Annotaties van vijf dia's werden gebruikt voor het trainen van een U-Net-architectuur CNN met behulp van patches van 256 × 256 pixels met een pixelgrootte van 0.49 m / pixel. Twee WSI's werden gebruikt voor de validatie van de CNN en voor het bepalen van de objectdetectiedrempel (0,4). De CNN-prestaties op traditionele IHC WSI werden beoordeeld op een ingehouden testset van twee IHC WSI's. CNN-prestaties op kunstmatige Brightfield IHC WSI werden beoordeeld op een secundaire testset bestaande uit vier kunstmatige Brightfield IHC WSI (Tibet en GATA3 van twee patiënten) met 1082 puntannotaties. Precisie, recall en F1-score werden berekend om de prestaties op beide testsets te beoordelen. Detecties werden als echt positief beschouwd als ze binnen 4 µm van een grondwaarheidsannotatie werden gevonden. Wanneer twee detecties werden gevonden binnen een bereik van 4 µm, werd alleen de detectie die het dichtst bij de annotatie lag als echt positief beschouwd. Vervolgens werd lymfocytdetectie CNN II gebruikt voor de analyse van alle kunstmatige helderveld IHC WSI's die nucleaire (lymfocyten) markers vertegenwoordigen (Tibet en GATA3).

Macrofaagdetectie CNN

In tegenstelling tot de detectie van lymfocyten is de identificatie van individuele macrofagen niet eenduidig. Vooral in geclusterde scènes kan een aanzienlijk niveau van waarnemersvariabiliteit worden verwacht. Daarom werd een veel groter aantal gevallen en menselijke annotaties gebruikt om een ​​speciale, derde CNN te trainen voor de detectie van CD68 plus en CD163 plus macrofagen. IHC-gekleurde objectglaasjes (n=111) van natief en transplantaatnierweefsel werden verzameld. IHC-kleuringen werden uitgevoerd met anti-CD68 (kloon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Denemarken of kloon KP1, M0876, Dako, Denemarken) of anti-CD163 (kloon MRQ -26 of 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, VK) antilichaam. De IHC-dia's werden gedigitaliseerd met behulp van een panoramische 250 Flash II digitale diascanner of een Aperio AT2 diascanner (Leica Biosystems, Wetzlar, Duitsland) met een resolutie van 0.24 of 0 0,25 m/pixel, respectievelijk. Vier waarnemers produceerden 37.709-puntannotaties over meerdere ROI's in de WSI's, met behulp van een protocol voor macrofaagannotatie, dat was overeengekomen na de eerste pilootexperimenten. De annotaties van 101 dia's werden gebruikt voor het trainen van een YoloV2-architectuur CNN [29]. Yolo is bij uitstek geschikt voor taken gericht op detectietaken. Het netwerk, bestaande uit zeven convolutionele lagen, werd getraind op patches van 256 × 256 pixels die zijn geëxtraheerd met een resolutie van 0,98 m / pixel met begrenzingsvakken van 21 m (gebaseerd op de gemiddelde macrofaaggrootte). Er werden tien WSI's gebruikt voor de validatie van de CNN en voor het bepalen van de objectdetectiedrempel (0,45) en niet-maximale onderdrukkingsparameters (0,05). De CNN-prestaties op traditionele IHC WSI werden beoordeeld op een ingehouden testset van tien IHC WSI's. CNN-prestaties op kunstmatige Brightfield IHC WSI werden beoordeeld op een secundaire testset bestaande uit vier kunstmatige Brightfield IHC WSI (CD68 en CD163 van twee patiënten) met 1033 dot-annotaties. Precisie-, recall- en F1-scores werden berekend om de prestaties op beide testsets te beoordelen. Detecties werden als echt positief beschouwd als ze werden gevonden binnen 21 µm (gemiddelde macrofaagdiameter) vanaf een grondwaarheidsannotatie. Wanneer er meer detecties werden gevonden binnen een bereik van 21 µm, werd alleen de detectie die het dichtst bij de annotatie lag als echt positief beschouwd. Vervolgens werd de macrofaagdetectie CNN gebruikt voor de analyse van alle kunstmatige helderveld IHC WSI die macrofaagmarkers vertegenwoordigen (CD68 en CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dubbele positiviteit

De positiviteit van cellen voor twee markers (dubbele positiviteit) werd beoordeeld door het aantal pixels tussen celdetecties in de verschillende kanalen te bepalen. Als de afstand tussen twee lymfocytdetecties was<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Celaantallen werden berekend binnen de ROI's en celdichtheden waren gebaseerd op het aantal cellen en het gebied van de geannoteerde ROI.

Ruimtelijke relaties

Geautomatiseerde celdetectie in WSI maakt het onderzoek naar ruimtelijke relaties tussen cellen mogelijk. De gemiddelde kortste afstand werd bepaald (in regio's met uitzondering van het subcapsulaire gebied) voor CD68 plus cellen en CD3 plus, CD3 plus CD8 plus en CD20 plus cellen in de WSI van panel I voor beide patiëntengroepen, en tussen CD163 plus cellen en CD4 plus , CD4 plus Tbet plus en CD4 plus GATA3 plus in de WSI voor beide patiëntengroepen.

Peritubulaire capillaire omvang

Om de peritubulaire capillaire omvang te beoordelen, werden niet-gemengde WSI's die het CD34-kanaal vertegenwoordigen geanalyseerd in Fiji (ImageJ versie 2.0.0, VS, macro's en plug-ins: "Open and Duplicate", "ASAP ROI-lezer") [30]. Positieve pixels werden bepaald via automatische drempelwaarde en vervolgens uitgedrukt als het percentage van het totale aantal pixels binnen de ROI.

statistische analyse

De dichtheden van de volgende celpopulaties werden berekend in de 6 weken durende biopsieën: T-lymfocyten (CD3 plus), cytotoxische T-lymfocyten (CD3 plus CD8 plus), B-lymfocyten (CD20 plus), macrofagen (CD68 plus, panelen I en II), gepolariseerde macrofagen (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), T-helper 1-lymfocyten (CD4 plus Tbet plus) en T-helper 2-lymfocyten (CD4 plus GATA3 plus). Spearman's correlatiecoëfficiënten werden berekend om te beoordelen of er een correlatie aanwezig was tussen T-helper 1 en T-helper 2 lymfocytdichtheid (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) en gepolariseerde macrofaagdichtheid (ofwel CD68 plus CD163 plus of CD163 plus). We hebben het CD68-signaal (fluorofoor 540 nm) waargenomen in de kunstmatige CD4 (fluorofoor 520 nm) IHC's van een panel I. Daarom rapporteren we bovendien de celdichtheden voor CD3- en CD8a-cellen. Om verschillen tussen patiëntengroepen met verschillende IFTA-uitkomsten te beoordelen, rapporteren we mediane, minimale en maximale celdichtheidswaarden per groep. Significante verschillen in celdichtheid en peritubulaire capillaire omvang (gedefinieerd als het CD34-positieve pixelpercentage) tussen groepen werden beoordeeld met behulp van de Mann-Whitney's U-test voor onafhankelijke monsters. Of patiënten met verschillende IFTA-uitkomsten significant verschillende CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus celverhoudingen vertoonden, werd beoordeeld met behulp van een t-test voor onafhankelijke steekproeven. Verschillen tussen patiëntengroepen in ruimtelijke relaties van CD68 plus- en CD163 plus-cellen met andere immuuncellen werden beoordeeld op significantie met behulp van de Mann-Whitney's U-test voor onafhankelijke monsters.

Resultaten

Op CNN gebaseerde detectie van IHC-positieve cellen

Om bestaande CNN's, die oorspronkelijk waren ontwikkeld voor helderveldmicroscopie, toe te passen, werden mTSA-fluorescentiebeelden getransformeerd naar kunstmatige helderveldbeelden. Voorbeelden van mTSA-gekleurde regio's met hun overeenkomstige kunstmatige helderveld-IHC-afbeeldingen zijn opgenomen in figuur 2. Een voorbeeld van een kunstmatige helderveld-IHC WSI wordt gedemonstreerd in aanvullende figuur 4. De WSI's met meerdere resoluties kunnen worden geopend en bekeken in digitale diaweergave software zoals ASAP en Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Zoals gevisualiseerd in figuur 2, was de kunstmatige helderveld IHC WSI geschikt voor geautomatiseerde analyse door CNN's die oorspronkelijk waren ontwikkeld voor traditionele IHC WSI.

Drie CNN's werden gebruikt voor de kwantitatieve beoordeling van ontstekingscellen in de 6 weken durende mTSA-gekleurde transplantatiebiopten: voor lymfocytdetectie met cytoplasmatische (CNN I) en nucleaire (CNN II) IHC-kleuring en voor macrofaagdetectie. Tabel 2 toont de CNN-prestaties (precisie-, terugroep- en F1-scores) voor hold-out-sets van zowel DAB-gekleurde IHC WSI's als kunstmatige Brightfield IHC WSI's. De prestaties van CNN waren doorgaans even goed of beter dan de eerder beschreven baseline CNN (met een F1-score van 0,78), waarvan werd aangetoond dat deze prestaties vertoonde die vergelijkbaar waren met die van ervaren handmatige waarnemers [22] . Terwijl de lymfocytdetectie CNN II enigszins verminderde prestaties vertoonde op virtuele helderveldbeelden in vergelijking met de echte DAB-beelden (waarop de CNN was getraind), werd het tegenovergestelde waargenomen voor de CNN voor macrofaagdetectie.

Een voorbeeld van een succesvolle automatische dubbele positiviteitsbeoordeling is opgenomen in figuur 3.

Correlatie van verschillende celtypes

De sterkste correlatie werd waargenomen tussen CD4 plus GATA3 plus celdichtheid en CD163 plus celdichtheid (Spearman's coëfficiënt 0,75, p < 0.001)="" in="" de="" 6="" weken="" biopsie="" (aanvullende="" figuur="" 5a).="" deze="" correlatie="" was="" zwakker="" tussen="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celdichtheid="" en="" cd163="" plus="" celdichtheid="" (spearman's="" coëfficiënt="" 0.61,="" p=""><0.01) (aanvullende="" figuur="" 5b)="" .="" wanneer="" de="" celpopulatie="" werd="" beperkt="" tot="" dubbel-positieve="" macrofagen="" (cd68="" plus="" cd163="" plus),="" was="" spearman's="" correlatiecoëfficiënt="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" met="" cd4="" plus="" gata3="" plus-cellen="" en="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" met="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" cellen="" (aanvullende="" figuur="" 5c,="" d).="" het="" opnemen="" van="" het="" subcapsulaire="" gebied="" in="" de="" analyses="" veranderde="" de="" resultaten="">

Vergelijking van inammatoire infiltraten tussenpatiënten die evolueren naar IFTA versus niet-IFTA

Patiënten die na 6 maanden progressie maakten naar IFTA vertoonden significant hogere CD163 plus celdichtheden in de biopsieën die 6 weken na transplantatie werden genomen (mediaan 505 cellen/mm2) versus patiënten die niet doorgingen naar IFTA (mediaan 370 cellen/mm2; p=0 .043) (Tabel 3). Opname van het subcapsulaire gebied resulteerde in een lichte vermindering van dit effect (p= 0.051). In beide panelen werden CD68 en CD4 gebruikt. Objectglaasjes gekleurd met mTSA-paneel I vertoonden meer CD68-positiviteit dan de objectglaasjes gekleurd met mTSA-paneel II. CD4-celdichtheid is hoger in mTSA-paneel II in vergelijking met mTSA-paneel I (tabel 3).

De peritubulaire capillaire omvang was vergelijkbaar in biopsieën van 6 weken van DGF-patiënten met verschillende IFTA-uitkomsten (Tabel 3), zowel wanneer het subcapsulaire gebied werd uitgesloten (p=0.74) en inclusief (p=0.90). van/in de analyse.

Beoordeling van CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus celverhoudingen liet een significant hogere verhouding zien bij patiënten met<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

De gemiddelde kortste afstand van CD68 plus cellen naar CD3 plus, CD3 plus CD8 plus en CD20 plus cellen (paneel I) en van CD163 plus cellen naar CD4 plus, CD4 plus Tbet plus en CD4 plus GATA3 plus cellen (paneel II) verschillen niet significant tussen patiëntengroepen. De resultaten worden gevisualiseerd in Fig. 4.

cistanche-extract: verbeter de nierfunctie en fysieke kracht

Discussie

In deze studie hebben we een methode ontwikkeld voor de nauwkeurige en objectieve kwantificering van inflammatoire celinfiltraten in transplantaatbiopten van niertransplantatiepatiënten met DGF die uitgebreid serieel snijden van nierbiopsiemateriaal omzeilt. Voor dit doel hebben we multiplex IHC, tyramide-signaalversterking, multispectrale beeldvorming en kwantificering door CNN's gecombineerd. We waren de eersten die betegelde multispectrale gegevens converteerden naar één enkele kunstmatige chromogene afbeelding per celmarkering, wat WSI-analyse en toepassing van CNN's die zijn ontworpen voor Brightfield IHC, mogelijk maakte. We hebben twee nieuwe CNN's ontworpen voor de detectie van nucleair gekleurde lymfocyten en macrofagen en hebben de generaliseerbaarheid aangetoond van CNN's die zijn ontwikkeld op traditionele IHC WSI naar kunstmatige helderveld IHC WSI. De toepasbaarheid van onze methode werd aangetoond door gebruik te maken van de kwantitatieve resultaten verkregen door de CNN's om correlaties van de inflammatoire micro-omgeving te bestuderen in 6 weken biopsieën van DGF-patiënten met de ontwikkeling van IFTA 6 maanden na transplantatie.

We gebruikten een in de handel verkrijgbare handmatige kleuringskit voor multiplex IHC om immuuncellen en peritubulaire haarvaten te visualiseren in bewakingsbiopten die 6 weken na transplantatie werden verkregen. De multiplexkleuringsprocedure bestond uit meerdere was-, incubatie- en weefselkookstappen en omvat verschillende reagensoplossingen. Uitgebreide methodevalidaties en kwaliteitscontroles zijn daarom van groot belang, en het gebruik van specifieke antilichamen die een consistente kleurintensiteit opleveren wordt aanbevolen. Ondanks de uitgevoerde validatiestappen werden macrofaagachtige kleurpatronen gezien in de CD4-kanalen van objectglaasjes van mTSA-panelen I en II. CD4- en CD68-kleuringscycli werden niet achtereenvolgens uitgevoerd, dus dit fenomeen kon niet worden veroorzaakt door onvolledige stripping van het CD68-antilichaam (aanvullende tabel 1). Hoewel zeldzame gevallen van dubbele positiviteit van macrofagen met CD4 zijn beschreven [31], ligt een meer plausibele verklaring in de nabijheid van de emissiespectra van de fluoroforen die werden gebruikt voor de visualisatie van CD4 (520 nm) en CD68 (540 nm), beide behandeld door de FITC-filterkubus van de fluorescentiemicroscoop. Dit kan "bloeden" van het sterke CD68-signaal in het CD4-kanaal veroorzaken. Veel van dit signaal werd uitgesloten van analyse in paneel I omdat alleen CD4 plus-cellen die dubbel positief waren met CD3 werden gebruikt voor algemene T-helpercelanalyse. Desalniettemin hebben we besloten om indirect ook algemene T-helpercellen te beoordelen, met CD3 plus CD8− als vervanging. In panel II werd CD4 alleen gebruikt in combinatie met Tibet en GATA3, waardoor het risico op het gebruik van fout-positieve detecties werd beperkt.

Lagere CD68-positiviteit werd waargenomen in panel II vergeleken met panel I. We veronderstellen dat dit het resultaat is van sterische remming door tyramide-afzetting behorend tot CD163 ("paraplu-effect") [32]. We observeerden significant meer CD163-positieve cellen in het bestudeerde cohort dan in tonsilweefsel dat werd gebruikt om sterische remming te controleren, wat mogelijk verklaart waarom dit effect niet werd ontdekt tijdens validatie.

Multiplex IHC is gecombineerd met multispectrale beeldvorming voor het onderzoek van de micro-omgeving van de tumor in verschillende oncologische onderzoeken, en recentelijk ook voor de analyse van niertransplantaatafstoting [33–35]. Om de bijdrage van alle markers in mTSA-glaasjes te extraheren, worden secties afgebeeld met een Vectra-systeem of een vergelijkbare fluorescentiemicroscoop met een multispectrale opstelling. Nadat een overzichtsbeeld met geringe vergroting is opgenomen, verdeelt het Vectra-systeem het weefsel in tegels en scant de tegels automatisch multispectraal. Dit resulteert in beeldtegels met meerdere bijdragende spectra. Omdat de spectra van de afzonderlijke uoroforen bekend zijn uit de vooraf opgenomen spectrale "bibliotheek", is het mogelijk om de multiplextegels te ontleden in meerdere afzonderlijke uoroforen die de bijdrage van elke fluorofoor vertegenwoordigen ("ontmengen"). In de meeste onderzoeken worden de ongemengde beelden vervolgens geanalyseerd met commerciële software. In veel gevallen ondersteunen deze programma's geen WSI-analyse, hebben ze moeite met het analyseren van geclusterde cellen en zijn ze vaak niet bestand tegen artefacten en kleurvariaties. Door de ongemengde tegels om te zetten in kunstmatige Brightfield IHC WSI's, konden we een bestaand CNN toepassen dat speciaal is ontworpen voor lymfocytdetectie in IHC [22] (aangeduid als lymfocytdetectie CNN I). Dit netwerk kan individuele en geclusterde lymfocyten met hoge nauwkeurigheid detecteren, terwijl het bestand is tegen achtergrondkleuring (Fig. 2, CD3). Daarnaast hebben we twee nieuwe CNN's getraind voor de detectie van cellen met nucleaire kleurpatronen (Tibet, GATA3) (lymfocytdetectie CNN II) en voor de detectie van macrofagen. Macrofagen zijn notoir moeilijk te detecteren vanwege hun verspreide kleurpatroon. De macrofaagdetectie CNN werd daarom getraind met behulp van de annotaties van vier verschillende experts. Voorafgaand aan het maken van de annotaties waren er meerdere vergaderingen gepland waar de criteria voor het annoteren van macrofagen werden besproken en beoordeeld. Dit resulteerde in een netwerk dat macrofagen op een reproduceerbare manier kan detecteren, terwijl het robuust is voor niet-specifieke kleuring (tabel 2, figuur 2 en aanvullende figuur 6). Voor zover wij weten, is dit het eerste algoritme voor detectie van macrofagen in gescande histopathologische secties. We hebben de prestaties van alle drie de netwerken getest op een testset bestaande uit traditionele IHC WSI (vergelijkbaar met die welke tijdens de training werden gebruikt) en op een secundaire testset die bestond uit kunstmatige helderveld IHC WSI, gegenereerd op basis van de multispectraal opgenomen beelden. Alle CNN's presteren zeer goed op de primaire testsets en vergelijkbare F1-scores op de secundaire testsets. De prestatiestatistieken van lymfocytdetectie CNN I werden berekend op normaal weefsel, artefacten en celclusters. De kunstmatige helderveld-IHC van de tweede testset bevatte geen weefselartefacten en minder celclusters. Dit kan de algehele betere prestaties van dit netwerk op de tweede testset verklaren. De macrofaagdetectie CNN werd getraind en getest op annotaties van vier verschillende annotators. Hoewel vooral de annotatiecriteria werden besproken, werden er toch variaties in de annotatiestijl waargenomen. De gevoeligheid van CNN ligt daarom waarschijnlijk ergens in het midden van de uitersten van de annotatiestijl. De annotaties voor de tweede testset werden gegenereerd door één annotator, schijnbaar overeenkomend met de CNN-gevoeligheid.

Met behulp van de beschreven CNN's konden we het inflammatoire infiltraat met ongekende nauwkeurigheid onderzoeken in een unieke reeks streng geselecteerde biopsieën voor vroege surveillance van transplantatiepatiënten met DGF.

Helaas moesten meerdere monsters worden uitgesloten van analyse, meestal vanwege onvoldoende restweefsel na diagnostisch onderzoek. Zelfs met de beperkte omvang van de dataset, vonden we significant hogere CD163 plus celdichtheden in biopsieën van DGF-patiënten die doorgingen naar de ontwikkeling van IFTA, wat in lijn is met de potentieel profibrotische rol van deze cellen [11]. Hoewel de waargenomen trend consistent was met gepubliceerde gegevens, konden we het nadelige effect van de vroege aanwezigheid van CD68 plus macrofagen dat eerder is gemeld voor andere niertransplantatiepatiëntengroepen niet bevestigen [7, 36, 37]. We vonden een positieve correlatie tussen de dichtheden van CD4 plus GATA3 plus-cellen en CD163 plus-cellen, wat de bijdrage van T-helper 2-lymfocyten aan een pro-fibrotische micro-omgeving zou kunnen bevestigen. Hoewel er in deze studie geen nieuwe voorspellende biomarkers voor IFTA-ontwikkeling bij DGF-patiënten werden ontdekt, hebben we met succes methoden ontwikkeld voor de nauwkeurige, reproduceerbare en schaalbare beoordeling van inflammatoir infiltraat in dun weefsel, zoals transplantatiebiopten. Deze methoden zijn waardevol voor toekomstige kwantitatieve studies over ontsteking in histopathologisch weefsel.

Om bijnieruitputting met cistanche te verlichten, klik hier voor meer details

Beschikbaarheid van data

Samenwerkingsverzoeken waarbij gebruik wordt gemaakt van gegevens die in dit onderzoek worden gepresenteerd, kunnen worden gericht aan de corresponderende auteur (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) of FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Dankbetuigingen

We danken Mark Gorris en Kiek Verrijp voor hun advies over mTSA-kleuring en beeldvorming, Merijn van Erp voor het ontwikkelen van aangepaste ImageJ-functionaliteit, en Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg en Martijn Otten voor het genereren van grondwaarheid voor het macrofaagdetectienetwerk. Daarnaast danken we Irina Scheffner voor haar hulp bij het verzamelen van klinische gegevens.

Bijdragen van auteursMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH en JAWML

de studie ontworpen. Patiëntmateriaal en klinische gegevens werden verzameld en verstrekt door JS, WG en FF. FF coördineerde de inspanningen bij MHH. JHB, EJS en JK scoorden de PAS-dia voor IFTA-percentage. MH voerde de mTSA-kleuringen uit, validaties van panelen I en II, en de beeldvorming en ontmenging van paneel I. VV afgebeeld en ongemengd paneel II. DJG ontwikkelde de methoden voor het converteren van mTSA-tegels naar kunstmatige brightfield-WSI. MH voerde de conversies uit. ZS-C ontwikkelde de lymfocytdetectie-CNN's en schreef de scripts voor lymfocytkwantificering. JL ontwikkelde de macrofaagdetectie-CNN's en schreef de scripts voor macrofaagkwantificeringen. MH voerde de cel- en capillaire kwantificeringen uit. NSS berekende de celafstanden. MH, BS, LBH en JAWML analyseerden de gegevens. MH maakte de cijfers en stelde de paper op. De definitieve versie van het manuscript werd herzien en goedgekeurd door alle auteurs.

FinancieringDit werk werd ondersteund door het ERACoSysMed-initiatief (project SysMIFTA) als onderdeel van het Horizon 2020-kaderprogramma van de Europese Unie, aangeboden door ZonMw (subsidienr. 9003035004), met medefinanciering door het Duitse ministerie van Onderzoek en Onderwijs (BMBF), subsidienr. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) en FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML ontving adviesvergoedingen van Philips (Nederland) en subsidies van

ContextVision, Philips (Nederland) en Sectra (Zweden), buiten het ingezonden werk. JK ontving financiële steun van de Nierstichting Nederland (project DEEPGRAFT, Grant nr. 17OKG23).

Naleving van ethische normen

BelangenverstrengelingDe auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemenGegevensverzameling en -analyse werden uitgevoerd met geïnformeerde toestemming van de patiënt en met goedkeuring van de ethische raad (nr. 2765) van de Hannover Medical School.

Opmerking van de uitgeverSpringer Nature blijft neutraal met betrekking tot jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele relaties.

Vrije toegangDit artikel is gelicentieerd onder een Creative Commons Attribution 4.0 International License, die het gebruik, delen, aanpassen, distribueren en reproduceren in elk medium of formaat toestaat, zolang je de oorspronkelijke auteur(s) op de juiste manier vermeldt ) en de bron, geef een link naar de Creative Commons-licentie en geef aan of er wijzigingen zijn aangebracht. De afbeeldingen of ander materiaal van derden in dit artikel zijn opgenomen in de Creative Commons-licentie van het artikel, tenzij anders aangegeven in een kredietlijn bij het materiaal. Als materiaal niet is opgenomen in de Creative Commons-licentie van het artikel en uw beoogde gebruik niet is toegestaan ​​door wettelijke voorschriften of het toegestane gebruik overschrijdt, dient u rechtstreeks toestemming te verkrijgen van de auteursrechthebbende.

Referenties

1. Siedlecki A, Iers W, Brennan DC. Vertraagde transplantaatfunctie bij de niertransplantatie. Ben J Transplantatie. 2011;11:2279-96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Risicofactoren voor langdurig transplantaatverlies bij niertransplantatiepatiënten met chronische allograftdisfunctie. Exp Clin-transplantatie. 2010;8:277-82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Associatie tussen vertraagde transplantaatfunctie en allograft en overleving van de patiënt: een systematische review en meta-analyse. Nephrol-wijzerplaattransplantatie. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Vertraagde niertransplantaatfunctie: van mechanisme tot translatie. Nier Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Het scoren van totale ontsteking is superieur aan de huidige Banff-ontstekingsscore wat betreft het voorspellen van de uitkomst en de mate van moleculaire verstoring bij niertransplantaten. Ben J Transplantatie. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Het voorspellen van een daaropvolgende achteruitgang van de nierfunctie van het transplantaat van vroege surveillancebiopten. Ben J Transplantatie. 2005; 5:2464-72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. De rol van macrofagen bij de ontwikkeling van humane niertransplantaatfibrose in het eerste jaar na transplantatie. Ben J Transplantatie. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Als alternatief geactiveerde macrofagen in de pathogenese van chronisch niertransplantaatletsel. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plasticiteit van macrofagen en interactie met subsets van lymfocyten: kanker als een paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889-96.

10. Anders HJ, Ryu M. Niermicro-omgevingen en macrofaagfenotypes bepalen de progressie of resolutie van nierontsteking en fibrose. Nier Int. 2011;80:915-25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrofagen bij orgaantransplantatie. Grenzen Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T-helper 1, 2 en 17 celsubsets bij niertransplantatiepatiënten met vertraagde transplantaatfunctie. Transpl Int. 2011;24:233-42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Scoren van tumor-infiltrerende lymfocyten: van visuele schatting tot machine learning. Seminar Kanker Biol. 2018;52:51-7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Een op beeldanalyse gebaseerde methode voor het kwantificeren van chronische allograft-schade-indexparameters. versterkers. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Watershed-algoritmen toepassen op de segmentatie van geclusterde kernen. Cytometrie. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Efficiënt circulair drempelen. IEEE Trans Med-beeldvorming. 2014;23:992-1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Een onderzoek naar deep learning in medische beeldanalyse. Med beeld anaal. 2017;42:60-88.

18. Madabhushi A, Lee G. Beeldanalyse en machine learning in digitale pathologie: uitdagingen en kansen. Med beeld anaal. 2016;33:170-5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostische beoordeling van deep learning-algoritmen voor detectie van lymfekliermetastasen bij vrouwen met borstkanker. JAMA. 2017;318:2199-210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Op diep leren gebaseerde histopathologische beoordeling van nierweefsel. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968-79.