R. Vesicarius L. oefent nefroprotectief effect uit tegen door cisplatine geïnduceerde oxidatieve stress

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Md. Mahmudul Hasan¹, Meest. Sayla Tasmin², Ahmed M. El-Shehawi³, Mona M. Elseehy⁴, Md. Abu Reza¹en Ariful Haque^2*

Abstract

Achtergrond:Cisplatine is een uitstekend middel tegen kanker, maar het gebruik ervan is opmerkelijk afgenomen vanwege ernstige nefrotoxiciteit. R. plaatsvervangend L. is een bladgroente met een duidelijk anti-angiogeen, ontstekingsremmend, antiproliferatief, hepatoprotectief en nefroprotectief potentieel. Daarom was deze studie ontworpen om het methanolextract (RVE) te inspecteren op mogelijk nefroprotectief effect.

Methoden:In de eerste plaats werd in vitro de antioxidantactiviteit van RVE bevestigd op basis van het vermogen van 2, 2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) vrije radicalen. Daarna werden mannelijke Zwitserse Albino-muizen gedurende 5 opeenvolgende dagen behandeld met cisplatine (2,5 mg/kg) om nefrotoxiciteit te induceren. Herstel van nefrotoxiciteit werd onderzocht door de dieren gedurende de volgende 5 opeenvolgende dagen intraperitoneaal (ip) te behandelen met RVE (25, 50 en 100 mg/kg). Na voltooiing van de behandeling werden de muizen opgeofferd en werden de nieren verzameld. Een deel ervan werd gehomogeniseerd in natriumfosfaatbuffer voor het evalueren van het malondialdehyde (MDA)-niveau, een ander deel werd gebruikt om de genexpressie (NQO1, p53 en Bcl-2) te evalueren. Bovendien werd het waterstofperoxide (H2O2)-neutraliserende vermogen van RVE in vitro geëvalueerd in HK-2-cellen. Ten slotte werden bioactieve fytochemicaliën in RVE bepaald met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS).

Resultaten:RVE vertoonde in vitro antioxidantactiviteit op een dosisafhankelijke manier met een IC50-waarde van 37,39 ± 1,89 ug/ml.

Behandeling met RVE verminderde opmerkelijk (p < {{0}}.05)="" het="" mda-gehalte="" in="" nierweefsel.="" bovendien="" was="" de="" expressie="" van="" nqo-,="" p53-="" en="" bcl-2-genen="" significant="" (p=""><0,05) op="" een="" dosisafhankelijke="" manier="" verminderd="" door="" de="" toediening="" van="" rve.="" rve="" keerde="" significant="" (p="">< 0,05)="" het="" h2o2-niveau="" in="" hk-2-cellen="" om="" tot="" bijna="" normaal.="" van="" gc-ms,="" tien="" verbindingen,="" waaronder="" drie="" bekende="" antioxidanten="" "4h-pyran-4-one,="" 2,="" 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-"="" ,="" "hexadecaanzuur"="" en="" "squaleen"="" werden="" gedetecteerd.="" het="" extract="" was="" rijk="" aan="" een="" alkaloïde="">

Conclusie:Over het algemeen heeft RVE een beschermend effect tegen door cisplatine geïnduceerde nierschade.

trefwoorden:Cisplatine, R. plaatsvervangend, muizen, nieren, HK-2-cellen, oxidatieve stress, NQO1-gen

Cistanche deserticola voorkomt nierziekte, klik hier voor het monster

Invoering

Oxidatieve stress is het resultaat van een disproportie tussen de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en reguliere antioxidante verdedigingsmechanismen [1]. Regelmatige biochemische reacties, frequente blootstelling aan de ongunstige omgeving en verhoogde inname van xenobiotica resulteren in ROS-productie [1]. ROS interageert met de cysteïneresiduen van redox-gevoelige signaalmoleculen, waaronder transcriptiefactoren, eiwittyrosinefosfatasen en eiwitkinasen; bijgevolg leidt oxidatie van thiolgroepen op deze residuen tot veranderingen van de beoogde eiwitten, biologische acties, signaleringscapaciteiten, immuniteit en aanvullende cel-levende/dode paradigma's [2]. Zuurstofbevattende chemische soorten met reactieve eigenschappen staan ​​bekend als ROS die vrije radicalen en niet-radicale moleculen zoals respectievelijk superoxide en H2O2 omvatten [3]. Oxidatieve stress veroorzaakt door ROS is gekoppeld aan de etiologie van talrijke ziekten, waaronder kanker. Acute myeloïde leukemie (AML) is een kankergezwel van bloedcellen in het beenmerg. De cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan AML omvatten DNA-schade, klonale voortplanting, verhoogde celdood en verdere genetische instabiliteit, die het gevolg zijn van door ROS geïnduceerde oxidatieve stress [4]. De menselijke fysiologie is begiftigd met tal van mechanismen die antioxidanten kunnen genereren om bescherming te bieden tegen oxidatieve stress, wat leidt tot het beschermen van cellen tegen toxische effecten en dienst doet voor ziektepreventie [5]. Cellen ontwikkelen echter endogene mechanismen om oxidatieve stress tegen te gaan en de vereiste ROS te behouden [6].

NAD(P)H: chinonoxidoreductase 1 (NQO1) is een flavo-enzym [7] dat twee- of vier-elektronenreductie kan katalyseren en deze eigenschap gebruikt om kinines te ontgiften [8]. Het kan cellen beschermen tegen oxidatieve schade door redoxcycli opzij te houden en door de productie van vrije radicalen te verminderen [8]. Naast xenobiotische ontgifting is NQO1 ook betrokken bij superoxide-neutralisatie, modulatie van p53-proteasomale afbraak [9], Bcl-2-remming [10] en verhoogde gevoeligheid voor celbeschadiging [11].

Cisplatine is het eerste door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde op platina gebaseerde antikankergeneesmiddel [12]. Cisplatine oefent apoptose uit door oxidatieve stress en overexpressie van tumorsuppressorgen p53 [12] te induceren. Verschillende bijwerkingen, waaronder nefrotoxiciteit, hepatotoxiciteit, gastrotoxiciteit, ototoxiciteit, myelosuppressie en neurotoxiciteit, zijn het gevolg van door cisplatine geïnduceerde oxidatieve stress [12]. Deze bijwerkingen hebben het gebruik van cisplatine opmerkelijk verminderd, hoewel het een uitstekende antikankeractiviteit heeft. Van cisplatine is bekend dat het oxidatieve stress induceert en het NQO1-gen in de nieren van muizen onderdrukt [13]. Daarom wordt het zoeken naar en valideren van effectieve natuurlijke bronnen van antioxidanten een gebied van bewustzijn. Inname van plantaardige antioxidanten zoals flavonoïden, carotenoïden en fenolische verbindingen kan leiden tot bescherming tegen hart- en vaatziekten, staar en kanker [14].

R. plaatsvervangend (Polygonaceae) staat bekend als "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" in het Bengaals [15]. Het groeit in de woestijn- en halfwoestijngebieden van Azië, Australië en Noord-Afrika [16]. Het is een weinig bestudeerde bedreigde plant in Bangladesh. In Bangladesh consumeren mensen de hele plant als groente na het koken met zout, verschillende kruiden en olie. Soms gebruiken mensen alleen de verse bladeren in een gemengde salade als alternatief voor sla. Het rauwe blad is licht zuur, maar wordt na het koken sterk zuur. Bovendien worden tijdens het koken meestal een klein aantal blaadjes in visgerechten gemengd om een ​​lichtzure smaak te krijgen.

Deze plant wordt wereldwijd als plantaardig en geneeskrachtig kruid gebruikt [17]. De bladeren en zaden worden gebruikt als tegengif voor respectievelijk slangen- en schorpioengif [17]. In de volksbehandeling wordt R. plaatsvervangend lang gebruikt bij de behandeling van leveraandoeningen, slechte spijsvertering, constipatie, stapels, braken, winderigheid, hartproblemen, pijnen, miltaandoeningen, dyspepsie, kiespijn, bronchitis, astma, schurft, leucoderma en als een laxeermiddel, maag, voorgerecht, tonic, diureticum en pijnstillend [18]. Deze plant bevat tal van biologisch belangrijke verbindingen, waaronder flavonoïden, antrachinonen, carotenoïden, vitamines, lipiden en organische zuren, die bekend staan ​​als antioxidanten, antimicrobiële en antikankermiddelen [19]. Elk deel van deze plant bevat quercetine (flavonoïden) in een verhoogde hoeveelheid [15]. Deze plant bevat 0,25 mg vitamine A, 1,33 mg vitamine C, 2,37 mg vitamine E [15], 3,38 mg flavonoïden en 5,66 mg polyfenolen [20] per 100 g droog gewicht.

Shahat en collega's [21] toonden anti-angiogene en anti-proliferatieve effecten van methanol (80 procent) extract van R. plaatsvervangend bovengronds deel tegen hepatocellulair carcinoom in een rattenmodel. Een andere studie toonde in vitro anti-angiogeen potentieel van R. plaatsvervangend extract [22]. Methanol-extract van geheel R. plaatsvervangend oefent bescherming uit tegen tetrachloorkoolstof-geïnduceerde hepatotoxiciteit in vivo [23]. Ontstekingsremmend effect bij konijnen is aangetoond door methanolisch bladextract van R. vicarious [24]. Een recente studie [25] rapporteerde een in vivo nefroprotectief effect van gefractioneerd ethanolisch plaatsvervangend R.-extract tegen gentamicine- en kaliumdichromaattoxiciteit.

Rekening houdend met de bovenstaande informatie, wilden we het effect van R. plaatsvervangende extracten (RVE) onderzoeken in termen van herstel van door cisplatine geïnduceerde nefrotoxiciteit door NQO1-genexpressie in een diermodel te behouden.

cistanche gezondheidsvoordelen: behandeling van nierziekten

materialen en methodes

Chemicaliën en reagentia

Cisplatine en 2, 2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) werden gekocht bij SIGMA-ALDRICH (VS).

Creatinine Colorimetric Assay Kit (product-ID - 700.460) werd gekocht bij Cayman Chemical (VS). Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS) en antibioticum (10,000 E/mL penicilline en 10,000 ug/ml streptomycine) werden gekocht bij Gibco (Gibco Laboratories, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). ROS-Glo™ H2O2-assaykit en GoTaq® qPCR Master Mix werden verkregen van Promega (VS). Reverse-transcriptiekit TIAN-Script M-MLV werd gekocht bij TIANGEN (China) en primers van IDT (Integrated DNA Technologies, Maleisië). Alle andere chemicaliën en reagentia die in dit experiment werden gebruikt, waren van analytische kwaliteit.

Verzameling van plantenmonsters en voorbereiding van extract

Verse plaatsvervangende planten van R. werden gekocht van een lokale markt in Sonadighi, Rajshahi, Bangladesh. Plantspecimen werden geïdentificeerd en geauthenticeerd door Dr. Ahmad Humayan Kabir, Department of Botany, University of Rajshahi, Bangladesh. Een exemplaar onder bon nr. 00095 werd opgeslagen in het herbarium van het Department of Botany, University of Rajshahi. De bovengrondse delen van de plant werden schoongemaakt, gedroogd op 37 graden, vermalen tot een grof poeder met behulp van een elektronische droger en bewaard in een afgesloten container op 4 graden. Het fijne poeder (10 g) werd opgelost in methanol (500 ml). De inhoud werd gedurende 10 minuten gesoniceerd (Soniprep 150, China) bij 20 kHz. Filtratie van het extract werd uitgevoerd met behulp van glasvezelfilterpapier (Macherey NAGEL, GmBH, Duits) met DURAN Filtering Apparatus (Duits). Ten slotte werd het filtraat geconcentreerd met behulp van een vriesdroger (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, VS). Het extract kreeg uiteindelijk de naam RVE.

In vitro antioxidant activiteitstest

De in vitro antioxidantcapaciteit van RVE werd uitgevoerd op basis van het wegvangen van DPPH zoals eerder beschreven [26] met weinig modificatie. Het vermogen van RVE om radicalen weg te vangen van DPPH werd beoordeeld op basis van het omzetten van de paarse kleur van DPPH in gele kleur. Het reactiemengsel in elke microcentrifugebuis (2 ml) bestond uit 95 0 μL methanolische oplossing van DPPH-radicalen (0,1 mM) en 50 μL RVE uit vijf verschillende concentraties (200, 500, 1000, 2000 en 4000 ug /mL methanol) om eindconcentraties van 10, 25, 50, 100 en 200 ug/mL te maken. Een andere buis met 50 L methanol en 950 L methanolische oplossing van DPPH werd als controle gehouden. De reageerbuisjes werden 30 min op een donkere plaats gelaten. De absorptie van de mengsels werd genomen bij 517 nm met behulp van GENESYS 10S UV-VIS-spectrofotometer (Thermo SCIENTIFIC, VS). Ten slotte werd het percentage radicale wegvangende activiteit (RSA) berekend op basis van de verkleuring van DPPH met behulp van de volgende formule procent RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100 waarbij ADPPH de absorptie van de DPPH-oplossing is (controle) en ARVE is de absorptie van de RVE-oplossing. De concentratie waarbij RVE resulteerde in 50 procent RSA werd aangeduid als IC50-waarde en werd berekend met behulp van een grafiek waarbij het percentage RSA werd afgezet tegen verschillende gebruikte RVE-concentraties.

Proefdieren en proefopzet

Mannelijke Zwitserse Albino-muizen van 42 dagen oud (30-32 g lichaamsgewicht) werden gedurende 1 week geacclimatiseerd voordat het experiment in een kamer werd gestart (temperatuur van ongeveer 25 ± 2 graden en ~ 50 procent vochtigheid, 12 uur donker / lichtcyclus). Drinkwater en voedsel werden ad libitum verstrekt.

Muizen werden willekeurig verdeeld in acht groepen (n {{0}}). De eerste (controle)groep werd behandeld met 0,2 ml 0,9 procent NaCl. De volgende vier groepen werden gedurende 5 dagen met een tussenpoos van 24 uur behandeld met 2,5 mg/kg cisplatine. Na toediening van cisplatine werd één groep (tweede groep) zonder verdere behandeling gelaten en toegewezen als de gestresste controlegroep. De derde, vierde en vijfde groep werden gedurende 5 dagen verder behandeld met RVE van respectievelijk 25, 50 en 100 mg/kg. Verder werden drie groepen behandeld met RVE met respectievelijk 25, 50 en 100 mg/kg gedurende 5 dagen. Cisplatine en RVE werden opgelost in gedestilleerd water. Alle behandelingen werden intraperitoneaal gegeven. Na 24 uur van de laatste behandeling werden de dieren geëuthanaseerd na cervicale dislocatie [25]. Vervolgens werd het buikvlies geopend met een schaar, bloed werd verzameld na een hartpunctie en de nieren werden verzameld met een tang. Bloed werd onderworpen om het niveau van creatinine in serum te controleren. De nieren werden onderworpen aan evaluatie van het malondialdehydegehalte en genexpressie.

Meting van serumcreatinine

Serumcreatinine werd gemeten met behulp van Creatinine Colorimetric Assay Kit-700,460 (Cayman Chemical, VS) volgens het protocol van de fabrikant dat bij de kit werd geleverd.

Meting van renale lipideperoxidatie

Malondialdehyde (MDA) is een eindproduct van lipideperoxidatie in nierweefsel en wordt meestal gemeten als een indicator van ROS-productie. De MDA-spiegel werd echter gemeten in nierweefsel volgens een eerdere studie [27]. Eerst werd het nierweefsel gehomogeniseerd in natriumfosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4). Een reactieoplossing die 0,8 procent thiobarbituurzuur (1,5 ml), 8,1 procent SDS (200 L), 20 procent (pH 3,5) azijnzuur (1,5 ml) en dH2O (600 L) bevatte, werd toegevoegd aan 100 μL gehomogeniseerd weefsel en het mengsel werd vervolgens gedurende 1 uur bij 95 graden geïncubeerd. Na afkoelen werden de mengsels gecentrifugeerd bij 10 000 g gedurende 10 min bij 4 graden en de absorptie van het supernatant werd gemeten bij 532 nm met standaard 1, 1, 3, 3- tetramethoxypropaan. De hoeveelheid totaal eiwit werd gemeten met behulp van de Bradford Protein Assay-kit (BIO-RAD, VS) en door deze te vergelijken met standaard runderserumalbumine (BSA). De intensiteit van lipideperoxiden werd uitgedrukt als nanomol (nM) MDA per milligram (mg) eiwit.

Realtime polymerasekettingreactie (realtime PCR)

Real-time PCR werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [28, 29]. Totaal RNA uit nierweefsel werd geïsoleerd met behulp van TRIzol®-reagens (Invitrogen) volgens het door de fabrikant geleverde protocol. Het geïsoleerde RNA (1 ug) werd vervolgens omgezet in cDNA. Ten eerste werden 2 L willekeurige hexameer (10 M), 2 μL dNTP's (10 mM), 1 ug RNA en nuclease-vrij H O tot 15 μL genomen en gedurende 5 minuten bij 70 graden geïncubeerd. Het mengsel werd onmiddellijk 2 minuten op ijs geplaatst. Vervolgens werden 4 L 1e strengbuffer (5x) en 1 μL M-MLV reverse transcriptase in elke buis toegevoegd en gedurende 10 minuten en 50 minuten geïncubeerd.

min bij respectievelijk 25 graden en 42 graden. Ten slotte werd het M-MLV reverse-transcriptase-enzym geïnactiveerd door het mengsel gedurende 5 minuten bij 95 graden te incuberen. De gesynthetiseerde cDNA-producten werden onderworpen aan real-time PCR voor kwantificering van NQO1, p53 en Bcl-2-genexpressie met behulp van specifieke primers (Tabel 1). Elke reactie (10 L) werd in drievoud uitgevoerd, bestaande uit 5 L GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, VS), 0,5 L (10 mM) van elke primer, 3 μL nuclease-vrij water, en 1 L cDNA in 48-well reactieplaten. Thermische cycli werden uitgevoerd met behulp van een realtime PCR-machine (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, VS) met de volgende cyclusomstandigheden: 95 graden gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 graden gedurende 30 s, 50 graden voor 30 s en 72 graden voor 25 s. De specificiteit van PCR-reacties werd bevestigd door analyse van de smeltcurve gedurende 15 s bij 95 graden, 15 s bij 45 graden en 15 s bij 95 graden. De specificiteit van PCR-reacties werd bevestigd door analyse van de smeltcurve gedurende 15 s bij 95 graden, 15 s bij 45 graden en 15 s bij 95 graden. De relatieve kwantificering van genexpressie werd uitgevoerd met behulp van endogeen GAPDH-gen als controle op basis van de ΔΔCq-methode.

Celkweek en behandeling

Humane renale proximale tubulus-epitheelcellijn, HK-2-cellen, werden gehandhaafd in DMEM aangevuld met 10 procent FBS en antibiotica (50 E/ml penicilline en 50 ug/ml streptomycine) in een incubator met 5 procent CO2 en 95 procent vochtigheid bij 37 graden.

H2O2-meetassay

Het H2O2-niveau in HK-2-cellen werd geschat met behulp van de ROS-Glo™ H2O2-assaykit (Promega, VS) volgens het protocol van de fabrikant van de kit. HK-2-cellen (1000 cellen) in 70 L DMEM werden in putjes van de microtiterplaat met 96-putjes geplaatst. Nadat de cellen op het wandoppervlak waren bevestigd, werd 10 L DMEM uit putjes van de microtiterplaat vervangen door 10 L cisplatine (25 M in DMEM) en gedurende 12 uur in een incubator gehouden. Vervolgens werd 10 L RVE toegevoegd om eindconcentraties 125, 250 en 500 ug/mL in DMEM te maken en nog eens 12 uur geïncubeerd. Daarna werd aan elk putje 20 L H2O2-substraatoplossing en 100 μL ROS-Glo™-detectieoplossing toegevoegd. De reactie werd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Ten slotte werd luminescentie gemeten met behulp van GloMax Luminometer (Promega, VS).

GC-MS-analyse

GC-MS-analyse van RVE (opgelost in methanol) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [30] met behulp van GCMS-QP2020 (SHIMADZU) met een auto-sampler (AOC{ {5}}s), een auto-injector (AOC-20i) en een gaschromatograaf (GC-2010 Plus) gekoppeld aan een massaspectrometer uitgerust met een SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Sil MS capillaire kolom (30 m × 0,25 m ID × 0,25 m DF). Het dragergas Helium werd op een constante stroomsnelheid van 1,72 ml / min gehouden en een injectievolume van 5 L werd onderworpen aan een 10:1 splitsingsverhouding. De temperatuur van de injector werd op 220 graden gehouden, de temperatuur van de ionenbron was 280 graden, de oventemperatuur was geprogrammeerd van 80 graden (2 min vasthouden), met een toename van 5 graden/min tot 150 graden (houdtijd 5,0 min), dan 5 graden/min tot 280 graden, eindigend met een 8 min isotherm op 280 graden. Massaspectra werden genomen bij 1, 5 kV met een scaninterval van 0, 5 s en het monster werd uitgevoerd met een bereik van 45-350 m / z. De oplosmiddelvertraging was van 0 tot 3 minuten en de totale looptijd van de GC-MS was 55 minuten. De relatieve concentratie van de gedetecteerde verbindingen werd gemeten door het gemiddelde piekoppervlak ervan te vergelijken met het totale oppervlak. Interpretatie van massaspectrum in GC-MS werd uitgevoerd met behulp van de National Institute Standard and Technology (NIST) -databases, waaronder NIST08, NIST08s en NIST14.

statistische analyse

De statistische analyses werden uitgevoerd door ANOVA na Dunnett's T3-test met IBM SPPS-software (versie 20). Gegevens worden gearticuleerd als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). De significante vergelijking werd overwogen bij p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">

Resultaten

In vitro antioxidant activiteitstest

Hoewel eerder werd gemeld dat RVE antioxiderende activiteit heeft, hebben we de antioxidantactiviteit van ons extract opnieuw gecontroleerd met behulp van DPPH-capaciteit voor het opruimen van vrije radicalen. RVE neutraliseerde DPPH dosisafhankelijk (Fig. 1). RVE onthulde een aanzienlijke in vitro antioxidantactiviteit en de berekende IC50-waarde van RVE was 37,39 ± 1,89 ug/ml.

Meting van serumcreatinine

De serumcreatininespiegel bij muizen was significant (p < {{0}},05)="" verhoogd="" na="" toediening="" van="" cisplatine="" (tabel="" 2).="" behandeling="" met="" rve="" verbeterde="" opmerkelijk="" (p=""><0,05) het="" creatinineniveau="" op="" een="" dosisafhankelijke="" manier="" (tabel="">

Meting van renale lipideperoxidatie

Vergeleken met controle, verhoogde cisplatine aanzienlijk (p < {{0}},05)="" het="" mda-gehalte="" in="" nierweefsel="" van="" muizen="" (tabel="" 3).="" daarentegen="" herstelde="" de="" rve-behandeling="" aanzienlijk="" (p=""><0,05) mda="" tot="" bijna="" normaal="" op="" een="" dosisafhankelijke="" manier="" (tabel="">

Realtime PCR

Cisplatine verminderde significant (p < {{0}}.05)="" nqo1-mrna-expressie="" met="" 0.15--voudig="" en="" verhoogde="" p53-="" en="" bcl-2-mrna="" expressie="" met="" respectievelijk="" 24="" en="" 4,2-voudig="" (fig.="" 2).="" rve="" (p="">< 0.05)="" verminderde="" de="" mrna-expressie="" van="" nqo1,="" p53="" en="" bcl-2="" aanzienlijk="" op="" een="" dosisafhankelijke="" manier="" (fig.="" 2).="" vergeleken="" met="" de="" enige="" met="" cisplatine="" behandelde="" groep,="" was="" nqo1-mrna-expressie="" verhoogd="" met="" 3,57,="" 6,36="" en="" 9,28--voudig="" bij="" 25,="" 50="" en="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectievelijk="" (fig.="" 2a).="" nogmaals,="" p53-mrna-expressie="" was="" verminderd="" met="" 0.63,="" 0.46="" en="" 0.21--voudig="" bij="" respectievelijk="" 25,="" 50="" en="" 100="" mg/kg="" rve="" (fig.="" 2b).="" bcl="" -2="" mrna-expressie="" was="" ook="" verminderd="" met="" 0,71,="" 0,40="" en="" 0,="" 32--voudig="" bij="" respectievelijk="" 25,="" 50="" en="" 100="" mg="" kg="" rve="" (figuur="" 2c).="" maar="" er="" werden="" geen="" significante="" (p=""> 0,05) veranderingen gevonden in het expressieniveau van NQO1-, p53- en Bcl-2-genen als gevolg van behandeling met RVE (Fig. 3).

H₂O₂meettest:

In de H2O2-meetassay is de H₂O₂het niveau werd als evenredig aan de luminescentie beschouwd. Toediening van cisplatine significant (p < {{0}}.05)="" verhoogde="" het="" h2o2-niveau="" met="" een="" factor="" 2.2-="" (fig.="" 4).="" behandeling="" met="" rve="" verminderde="" aanzienlijk="" (p="">< 0.05)="" h2o2-niveau="" met="" 0,25,="" 0,38="" en="" 0,{16}}voudig="" bij="" 125,="" 250="" en="" 500="" ug/ml,="">

GC-MS-analyse

In totaal 10 verbindingen (Tabel 4 en Fig. 5), waaronder "Isoborneol, pentamethyldisilanylether (sesquiterpeenalcohol)", "Thymine (pyrimidine nucleobase)", "4H-Pyran-4-one, 2,{{ 8}}dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- (saponine)", "Hexadecaanzuur, methylester (vetzuurmethylester)", "9,12- Octadecadieenzuur, methylester (vetzuurmethylester)", "9-Octadeceenzuur (Z)-, methylester (vetzuurmethylester)", "Methylstearaat (vetzuurmethylester)", "Diisooctylftalaat (ester)", "13-Docosenamide, (Z)- (alkaloïde)" en "Squaleen (triterpeen)" werden gedetecteerd in RVE.

voordelen van cistanche tubolosa: verlaging van de bloedlipiden

Discussie

Natuurlijke en synthetische antioxidanten zijn uitgebreid bestudeerd en bleken functioneel te zijn voor de preventie of verbetering van toxiciteit in de dierfysiologie [31]. Supplementen met antioxidanten zijn het bestanddeel dat is ontwikkeld door chemische synthese of door extractie uit natuurlijke voedingsmiddelen, maar deze zijn qua samenstelling niet identiek aan de antioxidanten die in voedsel beschikbaar zijn [5]. Daarom zijn de meningen in de loop van de tijd verdeeld of synthetische antioxidanten al dan niet vergelijkbare gezondheidsvoordelen bieden als natuurlijke antioxidanten [32]. De drang komt op om het gebruik van synthetische antioxidantsupplementen te verminderen en alternatieve, goedkope, hernieuwbare, natuurlijke en mogelijk veiligere bronnen van effectieve natuurlijke antioxidanten te zoeken.

Een van de belangrijkste mechanismen is de nucleaire factor erytroïde-2-gerelateerde factor-2 (Nrf2)-route die cellen over het algemeen beschermt tegen oxidatieve stress veroorzaakt door exogene of endogene stressoren [27]. De effectieve antioxidanten induceren expressie van Nrf2, die verder in de kern beweegt en bindt aan antioxidantresponselement (ARE) dat expressie van fase II-ontgiftende en antioxidantgen NQO1 veroorzaakt [33, 34]. NQO1 wordt breed en differentieel tot expressie gebracht op een weefselspecifieke manier. NQO1 is een cytosolische antioxidant flavoproteïne die de 2-elektronenreductie van chinonen tot hydrochinonen katalyseert, wat resulteert in ontgifting van de elektrofielen en anticipatie op redoxcycli [35]. Volgens een eerdere studie [36] activeert -lapachone NQO1, wat het intracellulaire NAD-plus-niveau verder verhoogt en de nier beschermt tegen cisplatine-geïnduceerde acute schade.

Van cisplatine is bekend dat het schade aan het glomerulaire filtratiemembraan veroorzaakt door oxidatieve stress, ontsteking en apoptose, wat samen leidt tot een verminderde glomerulaire filtratiesnelheid en verlies van normale membraanpermeabiliteit [37]. Daarom was het serumcreatininegehalte verhoogd. Serumcreatinine is een van de potentiële markers voor nierfunctie. Behandeling met cisplatine verhoogde het MDA-gehalte in nierweefsel, wat een secundair product is van lipideperoxidatie en dit rapport is constant met eerdere onderzoeken [27, 35, 37, 38]. Behandeling met RVE verminderde het MDA-gehalte in nierweefsel significant. Tegelijkertijd was ook het creatininegehalte verlaagd, wat wijst op het verbeterende effect van RVE.

Bovendien was de NQO1-expressie significant verlaagd en de p53- en Bcl-2-expressie significant verhoogd na blootstelling aan cisplatine. In termen van NQO1- en p53-expressie in vivo is ons resultaat consistent met een eerdere studie [13]. Een recente studie [39] toonde aan dat cisplatine de expressie van Bcl-2 in de nieren van muizen significant verminderde, maar verrassend genoeg vonden we een verhoogde expressie. Dit verschil kan het gevolg zijn van een dosisverschil [40], aangezien Mohamed en collega's [39] 8 mg/kg gedurende 12 dagen gebruikten, terwijl we 2,5 mg/kg slechts 5 dagen gebruikten. Een andere studie [41] stelde dat cisplatine de expressie van Bcl-2 kan verhogen bij een dosis die niet-cytotoxisch is. Nogmaals, verhoogde Bcl-2-expressie maakt cellen gevoelig voor oxidatieve stress [40].

De expressie van p53 is echter laag bij normale fysiologische omstandigheden, maar wordt naar verwachting opwaarts gereguleerd zodra het is behandeld met cisplatine, omdat dit op platina gebaseerde chemotherapeutische middel de p53-afhankelijke apoptotische route activeert. Nadat we muizen eenmaal met cisplatine hadden behandeld, was p53 significant verhoogd in muizennieren in vergelijking met controle. Een ander proto-oncogen Bcl-2 is ook gecorreleerd met het NQO1-expressieniveau. Door de p53-expressie na te bootsen, ontdekten we ook dat de Bcl- 2-niveaus waren verhoogd met cisplatinebehandeling, maar significant herstelden na behandeling met RVE. Dit is mogelijk als reactie op oxidatieve stress, het p53-gen wordt geactiveerd en resulteert in het stoppen van de celcyclus, senescentie of apoptose [6]. Bij ontgifting wordt overexpressie van NQO1 vaak beschouwd als gecorreleerd met apoptose in kankercellen [10], hoewel het onderliggende mechanisme van apoptose en de overexpressie van NQO1 nog steeds controversieel is. Bovendien vermindert NQO1-overexpressie bij hepatocellulair carcinoom de Bcl-2-expressie [10]. Proto-oncogen Bcl- 2 heeft ook p53 zoals de correlatie met NQO1-expressie. p53 is een sequentiespecifieke transcriptiefactor die wordt geactiveerd door talrijke soorten cellulaire stress [42], terwijl Bcl-2-overexpressie fungeerde als mitochondriale poriestabilisator om cytochroom-c-afgifte bij oxidatieve stress te vergemakkelijken [12]. In ons geval hebben we beide genresponsen gecontroleerd met cisplatinebehandeling in normaal nierweefsel en hun verhoogde expressie gevonden. RVE-behandeling bracht de expressie van p53 en Bcl-2 op een dosisafhankelijke manier terug naar bijna normaal. Dit type Bcl-2-expressie-intrekking werd ook aangetoond met behulp van ROS-scavenger Trolox [43]. Bovendien was de H2O2-spiegel ook aanzienlijk verhoogd in HK-2-cellen als gevolg van behandeling met cisplatine in vitro. Na behandeling met RVE was het H2O2-niveau significant hersteld tot ongeveer normaal. Dit is misschien te wijten aan het effect van RVE-behandeling dat de NQO1-expressie [44] verhoogde, wat bescherming biedt tegen oxidatieve stress [6].

Het GC-MS-chromatogram bevestigde het bestaan ​​van tien verbindingen in RVE. Hiervan zijn "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-", "Hexadecaanzuur" en " Squaleen" zijn bekende antioxidanten [45-47]. Deze drie verbindingen oefenden mogelijk een synergetisch nefroprotectief effect uit. Eerdere studies rapporteerden ook over inductie van NQO1-expressie door vitamine A [48], vitamine C [49], vitamine E [50], flavonoïden [51] en polyfenolen [50]. Daarom stelt dit rapport voor om te verduidelijken of dit specifieke extract iets van vitamine A, vitamine C, vitamine E, flavonoïden en polyfenol bevat, of niet.

Conclusie

De algemene bevinding suggereert dat RVE fysiologisch effectief is in het beschermen van nieren tegen door cisplatine veroorzaakte schade. Daarom is het van cruciaal belang om de exacte verbindingen op te helderen die verantwoordelijk zijn voor het verminderen van door cisplatine geïnduceerde nefrotoxiciteit, die gunstig kan zijn voor toepassing bij de mens.

cistanche tubolosa-extract

Dankbetuigingen

De auteurs zijn de Bangladesh Council of Scientific and Industrial Research (BCSIR), Rajshahi Branch, dankbaar voor het bieden van laboratoriumondersteuning om RNA te kwantificeren.

Bijdragen van auteurs

MMH voerde experimenteel ontwerp uit, experimenteerde, data-analyse en voorbereiding, manuscript schrijven en redigeren, manuscript herzien en opstellen; MST & MME hebben experimenten en data-analyse gedaan; AME & MAR droegen bij in toezicht en middelen; AH was verantwoordelijk voor conceptualisatie, supervisie, bronnen en manuscriptredactie. Alle auteurs

het manuscript bekeken. De auteurs lazen en keurden het definitieve manuscript goed.

Financiering

Het huidige werk werd gefinancierd door Taif University Students Supporting Project number (TURSP - 2020/75), Taif University, Taif, Saoedi-Arabië.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen.

Alle relevante gegevens zijn beschikbaar en kunnen op verzoek aan de corresponderende auteur worden verstrekt.

Verklaringen

Ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemen

De ethiek om dit experiment uit te voeren is goedgekeurd door het Institutional Animal, Medical Ethics, Biosafety, and Biosecurity Committee (IAMEBBC), Institute of Biological Sciences (IBSc), University of Rajshahi, en werd verstrekt onder het memonummer 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Alle methoden werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de bovengenoemde ethische commissie. Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). "Toestemming om deel te nemen" is niet van toepassing op dit onderzoek.

Auteur details

1 Molecular Biology and Protein Science Laboratory, Afdeling Genetische Engineering en Biotechnologie, Faculteit Levens- en Aardwetenschappen, Universiteit van Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 2Molecular Pathology Laboratory, Instituut voor Biologische Wetenschappen, Universiteit van Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 3 Department of Biotechnology, College of Science, Taif University, PO Box 11099, Taif 21944, Saoedi-Arabië. 4Departement Genetica, Faculteit Landbouw, Universiteit van Alexandrië, Alexandria 21545, Egypte.

Referenties

1. Bagchi K, Puri S. Vrije radicalen en antioxidanten bij gezondheid en ziekte: een overzicht. East Mediterr Health J. 1998;4:350-60.

2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH, et al. Ferulate, een actief bestanddeel van tarwekiemen, verbetert door oxidatieve stress geïnduceerde PTK / PTP-onbalans en PP2A-inactivatie. Toxicol res. 2018;34(4):333-41.

3. Hassan AI, Ibrahim RY. Sommige genetische profielen in de lever van Ehrlich ascites tumordragende muizen onder de stress van bestraling. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.

4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY, et al. Betrokkenheid van oxidatieve stress bij de terugval van acute myeloïde leukemie. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.

5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Vrije radicalen, antioxidanten bij ziekte en gezondheid. Int J Biomed Sci. 2008;4:89-96.

6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Rollen van NAD (P) H-chinonoxidoreductase 1 (NQO1) op kankerprogressie en chemoresistentie. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.

7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: chinonoxidoreductase 1 (NQO1) in de gevoeligheid en resistentie tegen antitumorchinonen. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.

8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: chinonacceptoroxidoreductase 1 (NQO1), een multifunctioneel antioxidant-enzym en uitzonderlijk veelzijdige cytoprotectie. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.

9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP, et al. Dicumarol-remming van NADPH: chinonoxidoreductase induceert groeiremming van alvleesklierkanker via een superoxide-gemedieerd mechanisme. Kanker onderzoek. 2003;63(17):5513–20.

10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Overexpressie van NAD (P) H: chinonoxidoreductase 1 remt de proliferatie van hepatocellulaire carcinoomcellen en veroorzaakte apoptose door de AMPK/PGC-1-route te activeren. DNA cel biol. 2017;36(4):256–63.

11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Onderdrukking van NAD (P) H-chinonoxidoreductase 1 verhoogde de gevoeligheid van cholangiocarcinoomcellen voor chemotherapeutische middelen. J Exp Clin Kanker Res. 2014;33(1):1–13.

12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatine bij kankertherapie: moleculaire werkingsmechanismen. EurJ Pharmacol. 2014;740:364-78.

13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allylmercaptocysteïne verzwakt door cisplatine geïnduceerde nefrotoxiciteit door onderdrukking van apoptose, oxidatieve stress en ontsteking. voedingsstoffen. 2017;9(2):166.

14. Matkowski A. Planten in vitro-cultuur voor de productie van antioxidanten - een overzicht. Biotechnologie Adv. 2008;26(6):548-60.

15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Antioxiderende activiteit van Rumex plaatsvervangend L. in het vegetatieve groeistadium. Aziatische J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.

16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) in Australië: een heroverweging. Nuytsië. 1984;5:75–122.

17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Chinon oxidoreductase 1 inducerende activiteit van sommige Saoedi-Arabische geneeskrachtige planten. Planta Med. 2013;79(06):459–64.

18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Een profiel van bioactieve verbindingen van Rumex plaatsvervangend L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195-202.

19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde- Filho PF, et al. Bronnen van alfa-, bèta-, gamma-, delta- en epsilon-carotenen: een twintigste-eeuwse recensie. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.

20. Laouini SE, Ouahrani MR. Fytochemische screening, in vitro antioxidant en antibacteriële activiteit van Rumex plaatsvervangend L.-extract. Wetenschappelijk onderzoek Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.