Snel gelijktijdige bepaling van zes effectieve componenten in Cistanche Tubulosa door middel van nabij-infraroodspectroscopie

1. Invoering

Cistanche (Hoffmg. Et Link) is een overblijvend fanerogam geslacht van de Orobanchaceae plantenfamilie. De meeste soorten die tot het geslacht Cistanche behoren, worden in China al duizenden jaren als medicinale plant gebruikt; een reputatie hebben als een superieur tonicum; en staan ​​bekend als "Ginseng van de woestijnen". Cistanche tubulosa is een obligaat parasiet van de wortels van de vaste plant Tamarix chinensis. Het is gedocumenteerd in de Chinese Farmacopee als de authentieke bron vanCistanches Herba(Chinese naam: Roucongrong) uit de editie van 2005. Modern farmacologisch onderzoek naar Cistanche-soorten begon in de jaren tachtig. Farmacologisch onderzoek heeft aangetoond dat de extracten van Cistanche-planten een breed spectrum aan activiteiten bezitten, zoals het genezen van niertekorten en seniele constipatie, het bevorderen van het vermogen om te leren en te onthouden, de ziekte van Alzheimer, het verbeteren van de immuniteit, het tegengaan van veroudering, het tegengaan van vermoeidheid, enz. In de afgelopen dertig jaar zijn uitgebreide en systematische farmacologische onderzoeken gecombineerd met fytochemisch onderzoek om de materiële basis van de gunstige effecten van de wortels van Cistanche-planten te verhelderen. Deze onderzoeken geven aan dat fenylethanoïdeglycosiden (PhG's) de belangrijkste effectieve componenten waren in Cistanche-planten die een sleutelrol speelden bij de behandeling van nierdeficiëntie, impotentie, anti-veroudering en de ziekte van Alzheimer. De inhoud van twee PhG's (echinacoside en verbascoside) was vereist in de Chinese farmacopee. Ondertussen bezitten koolhydraten zoals mannitol, sucrose, glucose en fructose in Cistanche-planten de laxerende functie en de koolhydraatclusters vanCistanche-plantenzijn gebruikt voor de behandeling van constipatie.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

De wilde hulpbronnen van C. tubulosa worden voornamelijk verspreid in het gebied rond de Taklamakan-woestijn in de zuidelijke autonome regio Xinjiang in China. Net als veel andere soorten die als traditionele Chinese medicijnen (TCM's) worden gebruikt, is C. tubulosa van grote economische waarde en is hij in zijn wilde habitat bijna uitgestorven vanwege overcollectie. De teelt van C. tubulosa begon in de jaren negentig in China om de aanvoer van grondstoffen voor Cistanches Herba te garanderen en om de hulpbronnen van wilde planten te beschermen. Sinds 2017 bestaat er bijna 13.000 hectare gecultiveerde C. tubulosa in de prefectuur Hotan in Xinjiang. Er is vooruitgang in de planttechnologie nodig om de teelt uit te breiden en de kwaliteit van C. tubulosa te verbeteren.

Het primaire doel van het kweken van C. tubulosa is het produceren van Cistanches Herba, omdat het rijk is aan deze effectieve componenten. Echter, de inhoud van de effectieve componenten inCistanches Herba, zoals PhG's en oligosachariden, kunnen tijdens de productie door veel factoren aanzienlijk worden beïnvloed. Een real-time detectiesysteem voor de kwaliteit van C. tubulosa moet worden onderzocht. Daarom is het noodzakelijk om een ​​methode met hoge verwerkingscapaciteit te ontwikkelen om te voldoen aan de eis van het analyseren van een groot aantal monsters binnen een korte periode. Traditioneel werd de bepaling van die primaire effectieve componenten, zoals PhG's en koolhydraten, in C. tubulosa meestal bereikt met behulp van krachtige vloeistofchromatografie (HPLC). Hoewel het nauwkeurig en betrouwbaar is, is het tijdrovend en arbeidsintensief voor het verzamelen en verwerken van gegevens. Bovendien is er ook veel tijd en moeite nodig voor de monstervoorbereiding, wat gewoonlijk het verpulveren, extraheren en filtreren van HPLC-testen met zich meebrengt. Daarom zijn een duidelijk principe en een eenvoudig te bedienen hulpmiddel nodig om relatief veel gegevens te verkrijgen. Gelukkig wordt nabij-infraroodspectroscopie (NIRS) op grote schaal gebruikt om landbouwproducten, voedsel, medische monsters en farmaceutische producten te beoordelen, omdat het zowel snel als niet-destructief is. Daarom zou NIRS precies kunnen voldoen aan de vereisten voor efficiënte metingen van TCM's, en het is niet verrassend dat NIRS is toegepast voor kwalitatieve identificatie en de kwantificering van verbindingen in TCM's.

In deze studie wordt de inhoud van zes effectieve componenten onderzocht, waaronderechinacoside, verbascoside, mannitol, sucrose, glucose en fructosein 116 batches C. tubulosa- monsters die in 2013–2015 werden verzameld in de prefectuur Hotan in Xinjiang, werden voor het eerst bepaald met HPLC. Daarna werden de kalibratiemodellen van deze zes componenten opgesteld met de gedeeltelijke kleinste kwadratenregressie (PLSR) -methode. Deze modellen werden vervolgens gevalideerd met de correlatiecoëfficiënten en voorspellingsfouten in de kalibratiesets. De resultaten toonden aan dat de ontwikkelde methode gebruikt kon worden als een betrouwbare methode voor kwantitatieve analyse van C. tubulosa.

2. Resultaten

2.1. HPLC-analyse

De inhoud vanechinacoside en verbascosidewerden bepaald door een goed gedefinieerde HPLC-UV-methode in de literatuur en vier koolhydraten (mannitol, sucrose, glucose en fructose) werden bepaald door een goed gedefinieerde HPLC-ELSD-methode in de literatuur voor alle 116 monsters. Methoden voor monstervoorbereiding en bepaling zijn beschreven in paragrafen 3.1 en 3.3. Figuur 1 toont de karakteristieke chromatogrammen van de gemengde standaarden. Het is duidelijk dat alle zes effectieve componenten van elkaar gescheiden waren en daarom gekwantificeerd konden worden. De HPLC-methode werd vóór het testen van de monsters gevalideerd. De belangrijkste resultaten van de HPLC-methode staan ​​vermeld in Tabel 1. Een gunstige lineaire relatie (r=0.9998) en terugvinding (98,5%) van de echinacoside-bepalingsmethode worden weergegeven in de resultaten, hetzelfde resultaat als alle vijf componenten. Hierdoor kan de inhoud van de zes effectieve componenten nauwkeurig worden bepaald. Alle vastgestelde inhoudsbereiken zijn samengevat in Tabel 1.

2.2. NIRS-analyse

Figuur 2 toont de NIR-spectra (4000–10,000 cm−1 ) van de C. tubulosa-monsters. Significante absorptiepieken verschenen in alle monsters van 4000 cm−1 tot 7500 cm−1, terwijl lichte fluctuaties optraden van 7500 cm−1 tot 10.000 cm−1. Basislijnafwijking van de NIR-spectra vond plaats omdat het monster gemakkelijk werd beïnvloed door factoren zoals deeltjesgrootte en kleur (Figuur 2A). Wiskundige voorbehandelingen van de spectra werden gebruikt om de invloed van onnodige informatie tot op zekere hoogte te verminderen. De wiskundige voorbehandelingen omvatten de eerste afleiding (1e afleiding), tweede afleiding (2e afleiding), standaard normale variëteit (SNV) en multiplicatieve verstrooiingscorrectie (MSC). Figuur 2B toont de tweede afleiding van de NIR-spectra van C. tubulosa, en de significante variaties die optraden in drie regio's, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 en 7000–7500 cm−1, worden waargenomen.

2.3. Oprichting van kwantitatieve kalibratiemodellen

Gedeeltelijke kleinste kwadratenregressie (PLSR) is een klassieke modelleringsmethode en wordt op grote schaal toegepast in kwantitatieve modellen vanwege de hoge kwaliteit van de resultaten. De voordelen van PLSR zijn onder meer het goede voorspellingsvermogen en de relatieve eenvoud. PLSR is ook op grote schaal toegepast bij het opzetten van kwantitatieve kalibratiemodellen van TCM's [25]. Op basis van de voorbehandelde NIR-spectra werd een kwantitatief NIR-analysemodel voor de zes effectieve componenten in C. tubulosa opgesteld met behulp van de PLSR-methode met HPLC-analysegegevens als de werkelijke waarden. De 116 monsters werden willekeurig verdeeld in kalibratie- en validatiesets met een verhouding van 3:1. De meest geschikte omstandigheden voor de kalibratie werden gekozen door een lage RMSEC en een hoge correlatiecoëfficiënt.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Selectie van de golfband voor de kalibratiemodellen

De selectie van een geschikte golfband was een belangrijke stap bij het bouwen van kalibratiemodellen. In deze studie werden de NIR-intervalspectra van 4000–7500 cm−1 (aanbevolen door TQ-analistensoftware) en 4000–10.000 cm−1 vergeleken. Er werd waargenomen dat dit bereik ongeschikt is voor de kalibratie op het interval tussen 4000 cm−1 en 7500 cm−1 uit Tabel 2. Daarom werden in het huidige onderzoek de spectrale intervallen voor de zes chemische bestanddelen allemaal geselecteerd uit het interval van 4000 tot 10.000 cm−1 door de prestaties van RMSEC en correlatiecoëfficiënt te vergelijken.

2.3.2. Selectie van het optimale aantal factoren voor de kalibratiemodellen

De PLSR verklaart de maximale hoeveelheid variabiliteit in de gegevens door de dimensionaliteit van de spectragegevens te verminderen door de berekening van factoren. Het probleem van "ondergeschiktheid" bleek te wijten aan onvoldoende informatie die het gevolg was van een beperkt aantal factoren; het kiezen van factoren die groter zijn dan de optimale waarden die in het model zijn geïntroduceerd, zal echter het probleem van "overfitness" veroorzaken. Zowel ‘ondergeschiktheid’ als ‘overfitness’ zal de voorspellende kracht van de gevestigde modellen verminderen [22]. Figuur 3 toont de relatie tussen RMSECV en factoren voor alle zes verbindingen. Daarom hebben we die factoren geselecteerd die overeenkomen met de laagste waarden van RMSECV. De optimale selectie van factoren voor de kalibratiemodellen staat vermeld in Tabel 3.

2.3.3. Selectie van spectrale voorbehandeling voor de kalibratiemodellen

Een andere kritische invloedrijke factor voor kalibratiemodellen is de spectrale voorbehandeling, die gericht is op het verminderen van de invloed van verstrooiing en basislijndrift, het verbeteren van de signaal-ruisverhoudingen en het verwijderen van onregelmatige variaties. Multiplicatieve verstrooiingscorrectie (MSC) en standaard normale variate (SNV) methoden werden gebruikt om de invloed van stralingsverstrooiing te elimineren. Om de effecten van basislijndrift op te lossen, werden de eerste en tweede afgeleide spectra vergeleken en werd de tweede afleiding geselecteerd. Voor het gewenste effect hebben we de spectra vóór de afleiding afgevlakt met het Savitzky-Golay (SG) filteralgoritme om ruisvergroting te voorkomen. Tabel 3 toont de informatie over de spectrale voorbehandeling en de resultaten ervan voor de kalibratiemodellen.

2.4. Evaluatie van de gevestigde modellen

Een goed NIRS-kalibratiemodel moet lage RMSEC- en RMSEP-waarden hebben, evenals een hoge correlatiecoëfficiënt (r) en kleine verschillen tussen RMSEC en RMSEP. De kalibratiemodellen van de zes geselecteerde verbindingen werden opgesteld volgens de hierboven genoemde procedures (Tabel 3). De RMSEC- en r-waarden voor de kalibratieset van echinacoside waren respectievelijk 27,6 en 0.9808. De prestatieparameters van andere modellen voor chemische verbindingen zijn vermeld in Tabel 3, waaruit we kunnen concluderen dat de gevestigde modellen bevredigende voorspellingsresultaten opleveren en kunnen worden gebruikt voor de snelle kwantitatieve analyse van C. tubulosa. In figuur 4 worden spreidingsdiagrammen van de zes chemische verbindingen weergegeven om de kalibratiemodellen beschrijvender en visueeler te maken. Zoals weergegeven in Figuur 4 deden zich kleine verschillen voor tussen de voorspellende en gemeten waarden, omdat de meeste punten rond de regressieve curve waren verdeeld met een vergelijking als y=x. Daarom werden uitstekende voorspellende prestaties waargenomen in figuur 4.

3. Materialen en methoden

3.1. Monstervoorbereiding

Van 2013 tot 2015 werden honderdzestien monsters van C. tubulosa verzameld in de prefectuur Hotan in de autonome regio Xinjiang. Alle monsters werden gekweekt, maar ze werden verzameld in verschillende groeistadia. Het verse gewicht van de monsters varieerde van 20 g tot 1000 g. Na drogen in de zon werden de gedroogde monsters vermalen en door een 60-maaszeef gezeefd.

3.2. NIR-spectroscopische gegevensverzameling

De NIR-spectra van de monsters werden verzameld met een interval van 8 cm−1 over het spectrale gebied van 4000–10.000 cm−1 met een Antaris MXFT-NIR-systeem (Thermo Scientific, Madison, WI, VS) uitgerust met een draagbare optische vezelreflectieadapter. Elk spectrum werd verkregen door het gemiddelde te nemen van 64 scans. Alle monsters mochten vóór het scannen van de NIR-spectra op kamertemperatuur (25 ◦C) komen om er zeker van te zijn dat de monsters bij dezelfde temperatuur werden geanalyseerd. De luchtvochtigheid in het laboratorium werd op omgevingsniveau gehouden.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE NIERFUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC-gegevensverzameling

3.3.1. Extractie voorbereiding

Eén gram C. tubulosa-poeder werd gedurende 30 minuten geëxtraheerd met 50 ml 50% methanol in een erlenmeyer met ultrasone trillingen (500 W, 40 KHz). Het extract werd bewaard bij 4 ◦C. Het supernatant van het extract werd gefiltreerd om een ​​monster voor HPLC-analyse te verkrijgen.

3.3.2. Gelijktijdige bepaling van echinacoside en verbascoside met HPLC-UV

Vloeistofchromatografische analyse werd uitgevoerd op een Shimadzu UHPLC-systeem (Shimadzu, Kyoto, Japan), bestaande uit twee LC-20ADXR-oplosmiddelafgifte-eenheden, een LC-20AD-pomp, een SIL-20ACXR automatische monsternemer, een CTO-20AC-kolomoven, een SPD-M20A DAD-detector, DGU-20A3R-ontgasser en een CBM-20A-controller.

Een Grace Prevail Carbohydrate ES-kolom (150 x 2,1 mm, 2,7 mm) die werd gebruikt voor de chromatografische scheidingen werd op 35 ◦C gehouden. De mobiele fase bestond uit acetonitril (A) en 0,1% waterig mierenzuur (B) en werd als volgt afgeleverd volgens het gradiëntprogramma: 0–7 min, lineaire gradiënt van 10–20% A; 7–15 minuten, 20% A; en 15–20 min, lineaire gradiënt van 20–10% A. De stroomsnelheid van de mobiele fase was 0,4 ml/min. UV-monitoring werd uitgevoerd bij 330 nm.

3.3.3. Gelijktijdige bepaling van mannitol, sucrose, glucose en fructose met HPLC-ELSD

HPLC werd uitgevoerd op een Agilent 1100-serie LC-systeem (Palo Alto, CA, VS) bestaande uit een G1322A-ontgasser, een G1311A quaternaire pomp, een G1311A autosampler, een G1316A kolomtemperatuurregelaar en een G1315B DAD-detector.

Voor chromatografische scheidingen werd een Sigma Prevail Carbohydrate ES-kolom (4,6 x 250 mm, 5 µm) gebruikt en op een kolomtemperatuur van 25 ◦C gehouden. De mobiele fase bestond uit acetonitril en water (77:23, v/v) en isocratische bondgenoot geleverd met een stroomsnelheid van 0,7 ml/min. Het effluent werd gevolgd met behulp van een verdampingslichtverstrooiingsdetector (ELSD) met standaardparameters.

3.4. Gegevensverwerking

TQ Analyst (versie 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, VS) werd gebruikt om de verdeling van de kalibratie- en validatiesets, de wiskundige voorbehandeling van de spectra, het opstellen van de kalibratiemodellen en andere berekeningen uit te voeren . Voor het maken van de figuren is gebruik gemaakt van Origin (versie 9.1).

4. Conclusies

In deze studie hebben we een snelle en niet-destructieve methode voorgesteld voor de gelijktijdige analyse vanechinacoside, verbascoside, mannitol, sucrose, glucose en fructoseinC. tubulosadoor NIRS. Analyses van RMSEC, correlatiecoëfficiënt, RMSEP en Rp-waarden toonden aan dat de gevestigde kwantitatieve NIR-modellen konden worden gebruikt om de inhoud van de zes geselecteerde effectieve componenten nauwkeurig te voorspellen.C. tubulosa. In vergelijking met HPLC kan de in dit onderzoek gerapporteerde NIRS-methode aanzienlijke arbeid en tijd besparen, terwijl een bevredigend kwantitatief analysevermogen behouden blijft. Daarom heeft de hier gerapporteerde methode het potentieel om te worden gebruikt bij de kwaliteitscontrole vanC. tubulosaen daarmee de ontwikkeling van teelt- en procestechnologie te begeleidenC. tubulosa.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%