Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Contactpersoon: Johanna.jia@wecistanche.com

Abstract

LC-technologie is een erkende methode die wereldwijd wordt gebruikt om de kwaliteit van traditionele Chinese medicijnen (TCM) te evalueren. De kwaliteit van TCM heeft een directe invloed op de werkzaamheid ervan. Om grondig te onthullen hoe TCM zijn werkzaamheid uitoefent, is het allereerst noodzakelijk om de materiële basis voor zijn werkzaamheid te begrijpen en vervolgens de kwaliteit van actieve verbindingen te controleren. De toepassing van de spectrum-effectrelatiemethode is cruciaal voor het bepalen van de farmacologische materiële basis. Het doel van dit artikel was om de onderliggende correlaties tussen de chemische profielen en de oestrogene activiteit vanCistanche, om de actieve verbindingen te onthullen. De chemische profielen vanCistanchewerden geregistreerd met behulp van HPLC/Q-TOF-MS/MS en de oestrogene activiteit werd bepaald met de baarmoedergroeitest en de MTT-assay. Door de resultaten van bivariate analyse, hoofdcomponentenanalyse en grijze correlatieanalysemethode te combineren, werden vijftien actieve verbindingen geïdentificeerd. Het zijn 8-epigaanzuur, salidroside, syringalide A 3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A,echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2'-acetylacteoside en twee onbekende verbindingen. Deze studie legt een basis voor in vivo studies vanCistancheen voor de ontwikkeling van de klinische toepassing ervan.

Cistanche kan oestrogeen stimuleren, klik hier voor meer informatie

trefwoorden:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; oestrogene activiteit; hoofdcomponentenanalyse (PCA); Baarmoeder groeitest.

Afkortingen

TCM: Traditionele Chinese Geneeskunde

HPLC/Q-TOF-MS: High-performance vloeistofchromatografie/quadrupole time-of-flight massaspectrometrie

BA: bivariate analyse

PCA: hoofdcomponentenanalyse

GCAM: grijze correlatieanalysemethode

MTT: Trypsine, 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide

DMSO: dimethylsulfoxide

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Inleiding

De laatste tijd is TCM steeds populairder geworden in Aziatische en westerse landen vanwege de stabiele therapeutische effecten en lage toxiciteit in de kliniek. Als gevolg hiervan is het noodzakelijk om nieuwe soorten TCM te ontwikkelen en om de effectieve samenstellingen te begrijpen die worden gebruikt tijdens hun klinische toepassing [1-6].

Ten eerste wordt de spectrum-effectrelatie bestudeerd om de correlatie tussen chromatografische vingerafdruk en farmacodynamische werkzaamheid te onderscheiden. Gebruik vervolgens de relatie om te zoeken naar effectieve componenten in TCM en om controlenormen te formuleren die hun interne kwaliteit weerspiegelen. De spectrum-effectrelatie is toegepast op veel gebieden van TCM-onderzoek, zoals de materiële basis van enkelvoudige en samengestelde TCM, componentcompatibiliteit, verwerkingsmechanisme, farmacologische effectvoorspelling en technologie-optimalisatie [7-12]. De spectrum-effectrelatie wordt gebruikt om nieuwe ideeën en methoden naar voren te brengen voor het verkennen van werkzame stoffen, het optimaliseren van formules, het verbeteren van bereidingsprocessen, het volgen en scheiden van doelingrediënten, en voor de ontwikkeling van nieuwe TCM-geneesmiddelen [13-17].

Cistancheis op grote schaal gebruikt voor de behandeling van seksuele disfunctie, constipatie, prostatitis en nierdeficiëntie. Het heeft een breed spectrum aan biologische activiteiten, waaronder oestrogene werking, anti-aging, antioxidatie en immuunwerking [18-19]. Over het algemeen werden fenylethanoïde glycosiden (zoals cistanoside A, tubuloside A), lignanen en iridoïde glycosiden beschouwd als farmacologische bestanddelen en chemische markers voor kwaliteitscontrole van Cistanche en zijn producten [20-21]. De chemische spectra vanCistancheuit verschillende gebieden werden opgenomen met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) [22-23]. In deze studie selecteren we de baarmoedergroeitest en de MCF7-celproliferatietest om hun oestrogene activiteiten te beoordelen. Hoofdcomponentenanalyse, bivariate analyse en grijscorrelatieanalysemethoden werden gebruikt om de oestrogene activiteit te correleren met de afzonderlijke componenten. Deze studie was gericht op het identificeren van bioactieve verbindingen van Cistanche die verantwoordelijk zijn voor in vivo oestrogene effecten. De studie legt een basis voor diepgaande studies vanCistanche.

Alle experimentele procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Ethical Committee van de Harbin University of Commerce.

Cistanchedeserticola(cd-20120227-005) is gekocht op de drugsmarkt en geïdentificeerd door prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Diethylstilbestrol werd gekocht bij HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 en RPMI1640 zonder fenolrood werden gekocht bij HyClone Company (VS). MTT en DMSO werden allemaal gekocht bij Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, VS). De menselijke borstkanker MCF7-cellijn werd geleverd door het Research Center of the Life Sciences and Environmental Sciences (Harbin University of Commerce). De gebruikte standaarden waren als volgt: acteoside (111530- 200505), echinacoside (111670-200503) en salidroside (110736-200628) werden verkregen van het National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Beijing , China). Acetonitril, methanol en mierenzuur waren van MS-kwaliteit, terwijl water ultrapuur was. Andere reagentia waren van analytische kwaliteit en waren in de handel verkrijgbaar.

EchinacosideinCistanchetubulosa heeft veel effecten

2 Experimentele procedure

2.1 Materialen

Agilent 1290 HPLC-systeem, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF)-systeem en chemische HPLC-3D-werkstations werden gebruikt voor analytische chemische experimenten en gegevensverwerking. Milli-Q ultrapuur water werd gebruikt voor de voorbereiding van monsters en standaarden. Andere instrumenten waren de elektronische Analytical Balance AR1140 (Ohaus International Ltd), de 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation) en de 64R High-Speed ​​Centrifuge (Beckman Coulter Allegra).

Onrijpe vrouwelijke Kunming-muizen (ongeveer 21 dagen na de geboorte, gespeend) met een gewicht van (12 ± 2) g, werden gekocht bij Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, China). De muizen werden gehuisvest in een temperatuurgereguleerde kamer (22 ± 2 graden) met onbeperkte toegang tot voedsel en water. Dierproeven werden gestart na vijf dagen acclimatisatie. De muizen werden 's nachts gevast met vrije toegang tot water voordat de testoplossingen werden toegediend. Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health.

2.2 Bereiding van de monsteroplossing

Cistanche-monsters werden verzameld in tien verschillende habitats, namelijk Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan en de provincie Hubei.

De oplossing (1.0 g/ml) van het Cistanche-monster werd bereid in gedestilleerd water voor orale toediening. De concentratie van diethylstilboestrol was 20ug/ml en werd gebruikt als de positieve controle-oplossing. De oplossing (1.0 g/ml) van het Cistanche-monster werd bereid in 50 procent acetonitril. Acteoside, echinacoside en salidroside (2,0 mg elk) werden opgelost in 10 ml 50 procent acetonitriloplossing. Zowel het monster als de standaardoplossingen werden vóór analyse gefilterd met een 0.45-μm filter.

2.3 LC-MS-omstandigheden

Een Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 15 0 mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, VS) werd gebruikt om de monsters te analyseren. De mobiele fase bestond uit acetonitril (A) en 0,2 procent (v/v) mierenzuuroplossing in water (B) en werd verpompt met een stroomsnelheid van 0,5 ml/min. Het injectievolume van elk monster was 10 L. Het gradiëntelutieprogramma was als volgt: Mobiele fase A werd gestart met 5 procent en lineair verhoogd tot 23 procent na 35 minuten. Oplossing A werd vervolgens verhoogd tot 25 procent (35 tot 65 min). De mobiele fase A werd vervolgens verlaagd tot 5 procent gedurende de laatste 5 min van de run (65 tot 70 min). De kolomtemperatuur werd op 30 graden gehouden. De chromatogrammen werden gevolgd bij 254 nm. De vernevelingsgasdruk was 30 psi en de capillaire spanning was 3,5 kV. Het debiet van het droge gas werd ingesteld op 8 L/min bij een temperatuur van 30 graden. De massaspectra werden opgenomen binnen het scanbereik van 100- 3,000 Da en bevonden zich in de scanmodus voor negatieve ionen.

2.4 Vingerafdrukevaluatie

LC-vingerafdrukken van de monsters verzameld uit 10 verschillende batches werden vastgesteld en automatisch gematcht met behulp van het Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (versie 2012; China Pharmacopoeia Committee, Beijing, China). Verder werd de referentiechromatogramkaart gegenereerd met behulp van de mediaanmethode. Daarnaast is clusteranalyse toegepast om de kwaliteit van de monsters uit tien verschillende habitats te beoordelen.

2.5 Hoofdcomponentenanalyse (PCA)

PCA is een multivariate statistische methode. Het kan voldoende informatie uit de data-acquisitie behouden. In de huidige studie werden karakteristieke pieken van LC-chromatogrammen verder gescreend door PCA en waren bedoeld om actieve verbindingen te identificeren op basis van de spectrum-effectrelatie.

2.6 Baarmoedergroeitest

De muizen werden verdeeld in 12 groepen (10 per groep). De monsteroplossingen die uit Cistanche werden bereid, werden verzameld in tien verschillende habitats en werden vier dagen lang tweemaal per dag ('s ochtends en' s avonds) via sondevoeding toegediend in een dosis van 30 g/kg lichaamsgewicht. De blanco en positieve controlegroepen omvatten gelijke volumes gedestilleerd water en diethylstilboestroloplossing en werden gedurende vier dagen tweemaal daags toegediend. Op de vijfde dag werden de geneesmiddelbevattende bloedmonsters uit de verdoofde muizen genomen. De monsters werden gecentrifugeerd (5,000 rpm, 10 min) en de supernatanten (geneesmiddelbevattende serummonsters) werden gescheiden. De geneesmiddelbevattende serummonsters werden geïnactiveerd door gedurende 30 minuten op 56 graden in een waterbad te verwarmen en werden vóór de MTT-test door een 0,{12}}μm-filter gefiltreerd. Gelijktijdig werden de baarmoeders van de muizen onmiddellijk uitgesneden en gewogen om de baarmoedergewichtsindices te berekenen. De dierproeven werden gestart na vijf dagen acclimatisatie. De muizen hebben een nacht gevast met vrije toegang tot water voordat de testoplossingen werden toegediend. De huidige studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen van de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Alle experimentele procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Ethical Committee van de Harbin University of Commerce. Alle potentieel stressvolle procedures werden uitgevoerd onder narcose met natriumpentobarbital.

2.7 MTT-test

MCF7-cellen werden gedurende vier dagen samen gekweekt met RPMI 1640 zonder fenolrood (met 5 procent CDT-FBS). De cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met een dichtheid van 2,000 cellen/putje. Een hechtende kweek werd bereikt en na 72 uur kweken werden de cellen samen gekweekt in RPMI 1640-medium dat serummonsters van met Cistanche behandelde muizen bevatte. De experimenten werden uitgevoerd in zes herhalingen. Vervolgens werd 20 L MTT-oplossing (5 mg/ml in PBS) aan elk putje toegevoegd en werden de cellen 4 uur geïncubeerd. Na verwijdering van het medium werd 150 µl DMSO toegevoegd om het formazan-product te produceren, en de platen werden in het donker geschud om volledig op te lossen. De absorptie werd gemeten bij 570 nm met behulp van een Microplate Reader. De proliferatiesnelheid werd berekend als de gemiddelde absorptiewaarde van de geneesmiddelbevattende serumgroep gedeeld door de gemiddelde absorptiewaarde van de blanco controlegroep (cellen samen gekweekt in RPMI 1640 zonder serum).

2.8 Statistische analyse

De t-test met gepaarde steekproeven (tweezijdig) werd gebruikt om statistisch significante verschillen tussen waarden in de blanco controle- en experimentele groepen te identificeren. De verschillen werden als significant beschouwd bij een betrouwbaarheidsniveau van 95 procent (p <>

PCA werd gebruikt om karakteristieke piekgebieden in de chromatogrammen van de monsters uit tien verschillende habitats te evalueren. Bivariate analyse en Gray-correlatieanalyse werden gebruikt om de correlatie van piekgebieden en hun oestrogene activiteit te beoordelen. De correlatie werd berekend door SPSS-statistiekensoftwarestatistieken (SPSS voor Windows 21.0, SPSS Inc., VS). De verschillen werden als significant beschouwd bij een betrouwbaarheidsniveau van 95 procent (tweezijdig).

Ethische goedkeuring: Het uitgevoerde onderzoek is niet gerelateerd aan menselijk of dierlijk gebruik.

cistanche acteoside heeft veel functies

3. Resultaten en discussie

3.1 Clusteranalyse en gelijkenisbeoordeling

De relatieve standaarddeviatie van de retentietijd en het piekoppervlak van karakteristieke pieken waren {{0}},58 en 0,34 procent voor precisie, 0,52 en {{8} },31 procent voor reproduceerbaarheid en {{10}},19 en 0,13 procent voor stabiliteit, respectievelijk. Deze bevindingen gaven aan dat onze LC-methode voor het vaststellen van vingerafdrukken redelijk en betrouwbaar was. De overeenkomsten van de chromatogrammen van tien monsters waren groter dan 0,9. De gemeenschappelijke pieken voor alle monsters konden de karakteristieke bestanddelen van Cistanche niet volledig vertegenwoordigen, omdat de piek verloren zou kunnen zijn gegaan. Daarom werd het monsterovereenkomstnummer aangepast van 26 naar 20 om een ​​nauwkeuriger chromatogramkaart te verkrijgen. Er werden in totaal 26 pieken verkregen en de som van hun gebieden was groter dan 0,8 vergeleken met die van het totale piekgebied in het monster. Daarom concludeerden we dat deze chromatografische pieken de belangrijkste chemische bestanddelen van Cistanche effectief zouden kunnen weerspiegelen. De resultaten van clusteranalyse zijn weergegeven in figuur 1. In totaal werden tien verschillende habitats als volgt onderverdeeld in drie categorieën: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang en 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia en 5, Alashan. (C) 9, Hubei. De trend van clusteranalyse toonde aan dat de leefgebieden van de geneeskrachtige kruiden vergelijkbaar zijn wanneer ze zich onderaan de drempel bevinden. Maar met het verhogen van de drempel komen de klimaat- en groeiomstandigheden van habitats dichtbij. Het laat zien dat de clusteranalyse niet alleen de diverse habitats goed kan onderscheiden, maar ook de affiniteiten ertussen weergeeft.

3.2 Identificatie van chemische bestanddelen

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Hoe hoger, de absolute waarde van de Eigen load, hoe groter de invloed van de verbindingen op de oestrogene indices.

De chromatogrammen van Cistanche en de standaardmonsters werden vergeleken om individuele componenten te identificeren onder dezelfde LC-MS-omstandigheden. Zoals weergegeven in tabel 1 werden in totaal 26 bestanddelen geïdentificeerd op basis van de retentietijd en MS-gegevens [24-26]. Actieve ingrediënten worden oraal toegediend in de vorm van mengsels in plaats van monomeren, aangezien de traditionele Chinese geneeskunde in de vorm van een mengsel een therapeutische rol speelt. Een enkele verbinding bleek na afzonderlijk te zijn gescheiden geen rol te spelen. Ons doel is om verbindingen te onthullen die oestrogene activiteit hebben in de bekende componenten van Cistanche [23-30], en hebben daarom geen NMR en andere technische middelen geselecteerd om hun identiteit te valideren. Piek 1 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 373 (C16H22O10), die identiek was aan de elementaire samenstelling van geniposidinezuur. Dit werd ondersteund door het verlies van een glucosegroep die een fragmention opleverde met een m/z-verhouding van 211. Piek 2 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 461 (C20H30O12), die identiek was aan de elementaire samenstelling van decaffeoylacteoside, en werd ondersteund door het verlies van een rhamnosylgroep, waardoor een fragmentatie werd gevormd met een m/z-verhouding van 315. Piek 4 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 375 (C16H24O10), die identiek was aan de elementaire samenstelling van 8-epilogaanzuur. Het verlies van een glucosegroep, die een fragmentatie vormde met een m/z-verhouding van 213, ondersteunde de gevolgtrekking verder. Piek 6 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 607 (C29H36O14), die identiek was aan de elementaire samenstelling van syringalide A3'- - l-rhamnopyranoside.

Het verlies van een caff-eenheid, vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 445, ondersteunde de gevolgtrekking verder. Piek 8 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 799 (C36H48O20), die identiek was aan de elementaire samenstelling van cistanoside A. Het verlies van een caff-eenheid vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 637, ondersteunde de conclusie verder. Piek 11 gaf een overheersend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 487 (C21H28O13), die identiek was aan de elementaire samenstelling van cistanoside F. Dit werd ondersteund door het verlies van een rhamnosylgroep die een fragmention opleverde met een m/z verhouding van 341, en het verlies van een andere caff-eenheid vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 179, ondersteunde de gevolgtrekking verder. Piek 12 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 813 (C37H50O20), die identiek was aan de elementaire samenstelling van cistanoside B. Het verlies van een glucosegroep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 651, ondersteunde de conclusie verder. Piek 13 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 827 (C37H48O21), die identiek was aan de elementaire samenstelling van tubuloside A. Het verlies van een rhamnosylgroep vormde een fragmentatie met een m/z-verhouding van 681, verder steunde de gevolgtrekking. Piek 14 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 637 (C30H38O15), die identiek was aan de elementaire samenstelling van cistanoside C. Het verlies van een rhamnosylgroep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 491, ondersteunde de conclusie verder.

Piek 15 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 591 (C29H36O13), die identiek was aan de elementaire samenstelling van osmanthuside B. Het verlies van een rhamnosylgroep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 445, ondersteunde de conclusie verder. Piek 16 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 623 (C29H36O15), die identiek was aan de elementaire samenstelling van acteoside. Het verlies van een caff-deel, vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 461,ondersteunde de conclusie verder. Piek 18 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 623 (C29H36O15), die identiek was aan de elementaire samenstelling van isoacteoside. Het verlies van een caff-deel, voorpiek15 duidde op een overwegend gedeprotoneerd ion met een m/z-verhouding van 591 (C29H36O13), die identiek was aan de elementaire samenstelling van osmanthuside B. Het verlies van een rhamnosylgroep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 445, verder steunde de gevolgtrekking. Piek 16 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 623 (C29H36O15), die identiek was aan de elementaire samenstelling van acteoside. Het verlies van een caff-eenheid, vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 461, ondersteunde de gevolgtrekking verder. Piek 17 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 623 (C29H36O15), die identiek was aan de elementaire samenstelling van cis-acteoside. Het verlies van een caff-deel, vormde een fragment ioda fragmention met een m/z-verhouding van 461, ondersteunde de gevolgtrekking verder. Piek 21 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 653 (C30H38O16), die identiek was aan de elementaire samenstelling van campneoside .

Het verlies van een caff-eenheid vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 491, en het verlies van een andere rhamnosyl-eenheid vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 345, wat de gevolgtrekking verder ondersteunt. Piek 22 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 665 (C31H38O16), die identiek was aan de elementaire samenstelling van tubuloside B. Het verlies van een CH3CO-groep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 623, en het verlies van een ander caff-deel vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 461, wat de gevolgtrekking verder ondersteunde. Piek 23 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 639 (C29H36O16), die identiek was aan de elementaire samenstelling van campneoside. Het verlies van een rhamnosylgroep, vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 493, ondersteunde de gevolgtrekking verder. Piek 24 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 665 (C31H38O16), die identiek was aan de elementaire samenstelling van 2'-acetylacteoside. Het verlies van een Ac-groep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 623, en het verlies van een andere caff-groep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 461, wat de gevolgtrekking verder ondersteunt. Piek 25 gaf een overwegend gedeprotoneerd ion aan met een m/z-verhouding van 445 (C20H30O11), die identiek was aan de elementaire samenstelling van cistanoside G. Het verlies van een rhamnosylgroep vormde een fragmention met een m/z-verhouding van 299, ondersteunde de conclusie verder. De structuren van verbindingen zijn weergegeven in figuur 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Deze pieken waren de volgende: 9, 12, 14 en 15. Bijgevolg werden echinacoside, cistanoside B, osmanthuside B en acteoside, overeenkomend met in totaal 4 pieken, geselecteerd als representatieve variabelen voor oestrogene activiteit (Figuur 3).

.

3.4 Bepaling van de oestrogene activiteit

De verhouding van het natte gewicht van de baarmoeder tot het lichaamsgewicht van elke muis werd berekend (Figuur 4). De dieren die werden blootgesteld aan Cistanche uit negen habitats vertoonden significante oestrogene activiteiten door hun baarmoedergewicht te verhogen in vergelijking met muizen in de blanco controlegroep. Figuur 4 toont verder de proliferatiesnelheid van MCF7-cellen die zijn behandeld met het serum van met Cistanche behandelde muizen. De cellen die werden behandeld met de sera van muizen die Cistanche uit tien leefgebieden kregen toegediend, vertoonden een significant hogere groei in vergelijking met cellen zonder behandeling.

3.5 Bivariate analyse

In de huidige studie hebben we waargenomen dat het baarmoedergewicht van onvolgroeide vrouwelijke Kunming-muizen toenam en dat de proliferatie van MCF7 menselijke borstkankercellen werd bevorderd. Deze bevindingen bevestigden de oestrogene activiteit van Cistanche. Figuur 5 gaf de baarmoederindices en MCF7-celproliferatiesnelheden van deze bestanddelen aan. De correlatiecoëfficiënt van Pearson werd gebruikt om de relatieve piekoppervlakken te berekenen, die overeenkwamen met de oestrogene activiteit van de monsters. De correlatiecoëfficiënten hoger dan 0.3 werden als significant beschouwd (p < 0.05),="" terwijl="" correlatiecoëfficiënten="" hoger="" dan="" 0.5="" als="" zeer="" significant="" werden="" beschouwd="" (p="">< 0,01).="" op="" basis="" van="" de="" resultaten="" werd="" aangetoond="" dat="" cistanche="" oestrogene="" activiteit="">

Een totaal van negen verbindingen correleerde significant met de toename van het baarmoedergewicht (p < {{0}},05),="" terwijl="" tien="" verbindingen="" significant="" correleerden="" met="" mcf7-cellulaire="" proliferatie="" (p=""><0,05). verbindingen="" die="" significant="" correleerden="" met="" baarmoedergewicht="" en="" celproliferatie="" waren="" 8-epilogaanzuur,="" salidroside,="" syringalide="" a3'-="" -="" l-rhamnopyranoside,="" cistanoside="" a,="" cistanoside="" b,="" cistanoside="" c,="" osmanthuside="" b,="" acteoside,="" isoacteoside,="" tubuloside="" b,="" 2'-acetylacteoside="" en="" twee="" onbekende="" verbindingen="" (figuur="" 5).="" deze="" dertien="" verbindingen="" oefenden="" oestrogene="" activiteiten="">

3.6 Grijze correlatieanalysemethode

Figuur 6 toont de relatieve correlatie van de karakteristieke pieken van 26 verbindingen met de baarmoederindices, en Figuur 7 toont de relatieve correlatie van karakteristieke pieken van de 26 verbindingen met hun celproliferatiesnelheden. Een totaal van drie verbindingen vertoonden de hoogste correlatie met de baarmoederindexen, namelijk 8-epilogaanzuur, cistanoside F en acteoside (Figuur 6, in afnemende volgorde); terwijl de zes verbindingen die de hoogste correlatie vertoonden met de MCF7-celproliferatie echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, osmanthuside B, isoacteoside en tubuloside B waren (Figuur 7, in aflopende volgorde). De relatieve correlaties van echinacoside, osmanthuside B, acteoside en isoacteoside waren hoger dan 0.5.

3.7 Optimalisatie van LC-MS-condities

Om een ​​betere chromatogramkaart te verkrijgen, werden methanol en acetonitril vergeleken. Uiteindelijk was de combinatie van waterig mierenzuur (0,2 procent, v/v) - acetonitril de beste mobiele fase voor scheiding. Door in het bereik van 200-400nm volledige golflengte scanning, werd 254nm als optimaal gekozen. Bovendien werden ook de MS-parameters verbeterd. De scanmodus met negatieve ionen is geselecteerd omdat deze de responswaarden van de meeste ingrediënten in Cistanche verbeterde.

4. Conclusie

LC-Q-TOF-MS-technologie werd gebruikt om oestrogene actieve bestanddelen van Cistanche te identificeren. De huidige studie illustreerde dat 8-epilogaanzuur, salidroside, syringalideA3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2'-acetylacteoside en twee onbekende verbindingen waren de belangrijkste actieve bestanddelen van Cistanche. Deze bevindingen vereisen echter verdere studies om de in vivo effecten en het werkingsmechanisme van de bestanddelen te onderzoeken.

cistancheacteoside heeft veel functies, zoals het stimuleren van het immuunsysteem

Dankbetuigingen:

Dit project werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81073015), de Nature Scientific Foundation van de provincie Heilongjiang (ZD2017014) en het opleidingsplan voor jong innovatief talent van het College in de provincie Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Referenties

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fytochemie, farmacologie , kwaliteitscontrole en toekomstig onderzoek van Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: A review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Geïntegreerde en wereldwijde pseudotargeted metabolomics-strategie toegepast tot screening op kwaliteitscontrolemarkers van Citrus TCM's, Anal. Bio-anaal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., een roman en praktische chromatografische "Fingerprint-ROC-SVM " Strategie toegepast op kwaliteitsanalyse van traditionele Chinese geneeskunde-injecties: KuDieZi-injectie gebruiken als een casestudy, Molecules., 2017, 22 (7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Screening van bioactieve kwaliteitscontrolemarkers van QiShenYiQi-druppelpillen op basis van de relatie tussen de ultrahoge prestaties vloeistofchromatografie vingerafdruk en vasculaire beschermende activiteit, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Toepassing van multivariate statistische analyse en denken bij kwaliteitscontrole van Chinese geneeskunde, Zhongguo. Zhong. Ja. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS-georiënteerde karakteristieke componentengegevens set en chemometrische analyse voor de holistische kwaliteitscontrole van complexe TCM-preparaten: Niuhuang Shangqing-pil als voorbeeld, J. Pharm. biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, hoge negatieve voorspellende waarde, lage prevalentie en spectrumeffect: voorzichtigheid bij de interpretatie, Clin. Gastro-enterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening van hepatotoxische componenten in Euodia rutaecarpa door UHPLC-QTOF/MS Gebaseerd op de relatie tussen spectrum en toxiciteit, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Screening en identificatie van hepatotoxische component in Evodia rutaecarpa op basis van spectrum-effectrelatie en UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrumeffect en Spectrumbias in de screeningtestprestaties voor Amnestische milde cognitieve stoornis: wat zijn de klinische implicaties?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Spectrum-effectrelaties als een systematische benadering van onderzoek naar traditionele Chinese geneeskunde: huidige status en toekomstperspectieven, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Spectrum-effectrelaties tussen UPLC-vingerafdrukken en bioactiviteiten van ruwe secundaire wortels van Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) en zijn drie verwerkte producten op mitochondriale groei in combinatie met canonieke correlatieanalyse, J. Ethnopharmacol., 2014,153 (3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., spectrum-effectrelaties tussen chemische vingerafdrukken en antibacteriële effecten van Lonicerae Japonicae Flos en Lonicerae Flos Base op UPLC en microcalorimetrie, Front. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Het spectrumeffect in tests voor risicovoorspelling, screening en diagnose, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Nieuwe hemostatische verbindingen opsporen van verwarmingsproducten van totale flavonoïden in Flos Sophorae per spectrum -effectrelaties en kolomchromatografie, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Onderzoek naar de spectrum-effectrelaties van Da-Huang-Fu- Zi-Tang bij ratten volgens de UHPLC-ESI-Q-TOF-MS-methode, J. Ethnopharmacol., 2014, 154 (3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, onderzoek naar spectrumeffectrelatie van rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus en hun formule, J. Chromatogr. Wetenschap, 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotische activiteit van echinacoside bij ratten waarvan de eierstokken zijn verwijderd, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Anti-hyperglycemische en hypolipidemische effecten van Cistanche tubulosa in type 2 diabetische DB/DB-muizen, J. Ethnopharmacol., 2013, 150 (3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., geacyleerde fenylethanoïde glycosiden , echinacoside en acteoside van Cistanche tubulosa, verbeteren de glucosetolerantie bij muizen, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Fenylethanoïde glycosiden met ontstekingsremmende activiteiten van de stengels van Cistanche deserticola gekweekt in Tarim-woestijn, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Kwantitatieve analyse van Cistanches Herba met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie in combinatie met diodearraydetectie en hoge resolutie massaspectrometrie gecombineerd met chemometrische methoden, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Structurele karakterisering en identificatie van fenylethanoïde glycosiden van Cistanches deserticola YC Ma door UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferatieve activiteit van fenylpropanoïden geïsoleerd uit Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Gelijktijdige bepaling van componenten met brede polariteit en inhoudsbereiken in Cistanche tubulosa met behulp van serieel gekoppelde omgekeerde fase-hydrofiele interactiechromatografie-tandem massaspectrometrie, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Toepassing van 1H NMR-gebaseerde metabolomics voor het onderscheiden van verschillende onderdelen en ontwikkeling van een nieuwe verwerkingsworkflow voor Cistanche deserticola, Acta. apotheek Zonde. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Studies over de bestanddelen en bioactiviteit van verse Cistanche tubulosa, Ph.D. proefschrift, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, China, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Het metabolische profiel van acteoside geproduceerd door menselijke of ratten darmbacteriën of darmenzym in vitro gebruikt UPLC Q-TOF-MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Systematische karakterisering van de metabolieten van echinacoside en acteoside van Cistanche tubulosa in rattenplasma, gal, urine en feces op basis van UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Een metabolische manier om gerelateerde hindernissen te onderzoeken die een slechte biologische beschikbaarheid veroorzaken bij orale toediening van isoacteoside bij ratten met behulp van ultrahoge prestatievloeistofchromatografie / quadrupool time-of-flight tandem massaspectrometrie, Rapid. gemeenschappelijk. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.