Herbedrading van glucose- en lipidenmetabolisme geïnduceerd door G-eiwit-gekoppelde receptor 17 Silencing maakt de overgang mogelijk van oligodendrocyt-voorlopers naar myeliniserende cellen Ⅱ

3. Resultaten

3.1. GPR17-silencing bij het differentiëren van OPC's heeft de expressie van genen die betrokken zijn bij het metabolisme van lipiden en glucose aanzienlijk veranderd

Om de biologische processen te benadrukken die aanzienlijk worden beïnvloed door GPR17-expressie tijdens OL-differentiatie, hebben we de expressie ervan verstoord door OPC's van ratten te transfecteren met SMART-pool-siRNA's die specifiek zijn voor GPR17 van ratten. Na een succesvolle GPR17-knockdown te hebben gevalideerd door qRT-PCR (Figuur S1), voerden we een microarray-analyse uit van 30.584 rattentranscripten in de GPR 17-silenced versus controle OPC's en analyseerden we de differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) met verschillende bioinformatica-tools. Ten eerste zijn de 640 DEG's bestudeerd door Meta-Core, om een ​​padverrijkingsanalyse uit te voeren en de processen te identificeren waarvan wordt voorspeld dat ze aanzienlijk worden beïnvloed. Deze analyse suggereerde wijziging van de mTOR-signalering, waarvan al is aangetoond dat deze is gekoppeld aan de GPR17-functie [37], en van andere processen waarvan bekend is dat ze relevant zijn voor OPC-rijping, zoals "remodellering van het cytoskelet" En"regulatie van het vetmetabolisme" (Tafel 1).

plus

Klik hier om Cistanche voor botgroei te kennen

Tabel 1. De software MetaCore is gebruikt om een ​​padverrijkingsanalyse uit te voeren op de DEG's na GPR17-uitschakeling. De tabel toont de meest significante routes die het resultaat zijn van de analyse, het aantal geassocieerde genen en gemeenschappelijke genen in de dataset

Vervolgens werd de Ingenuity Pathway Analysis (IPA)-tool gebruikt om een ​​analyse-match uit te voeren, die automatisch gecureerde IPA-datasets identificeert met significante overeenkomsten en verschillen in vergelijking met een query-dataset. Deze analyse versterkt de voorspelde link tussen GPR17-expressie en lipidenmetabolisme, wat aantoont dat de expressieveranderingen van 38 genen in onze dataset (tabel S1) geassocieerd zijn met veranderde vetzuursynthese (figuur 1). Hiervan veroorzaakte GPR17-uitschakeling opwaartse regulatie van LXR (lever X-receptor alfa, NR1H3 in figuur 2 en tabel S1, een nucleaire receptor die reageert op oxysterolen) en SREBP1 (sterol regulerend element bindend eiwit 1, SREBF1 in figuur 1 en tabel S1), twee hoofdrolspelers in de synthese van vetzuren en cholesterol. In onze dataset hebben we ook waargenomen dat verschillende veranderde genen, waaronder PDH (pyruvaatdehydrogenase), Ldha (lactaatdehydrogenase alfa) en Pdk1 (pyruvaatdehydrogenasekinase 1), verband houden met het glucosemetabolisme en de Krebs-cyclus, wat de mogelijke betrokkenheid van de GPR17-receptor bij de regulatie van deze stofwisselingsprocessen. Volgens dit onthulde een op genontologie gebaseerde verrijkingsanalyse (ToppGene suite) op de DEG's wijziging van het "monocarboxylzuur metabolisch proces" (GO:{{20}}032787, p- waarde: 0,02), naast andere processen die verband houden met de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel en het celmetabolisme, zoals "regulatie van de ontwikkeling van het zenuwstelsel" (GO:0051960, p-waarde: 0,033) en "sfingolipidenmetabolische processen" (GO:0006665, p-waarde : 0,043) (figuur 2; volledige lijst in tabel S2).

Wereldwijd suggereren deze veranderingen dat GPR17-uitschakeling kan werken als een trigger om cellen aan te spreken op myelinisatie, door verschillende genen af ​​te stemmen die betrokken zijn bij de transcriptionele regulatie van lipide- en glucosehomeostase, evenals bij het gebruik van cholesterol en lipiden voor de productie van myeline.

Figuur 1. Ingenuity Pathway Analysis Tool (IPA, Qiagen) werd gebruikt om de dataset te analyseren en de ziekten en biologische processen te onderzoeken waarvan wordt voorspeld dat ze toenemen of afnemen op basis van het patroon van differentieel tot expressie gebrachte genen in de dataset. Uit deze analyse hebben we het schema in de figuur geëxtrapoleerd dat de genen omvat die verband houden met de synthese van lipiden die differentieel worden uitgedrukt in onze dataset (p-waarde=9.67 × 10−4). De volledige namen van deze genen, samen met de relatieve vouwverandering (log2-ratio) worden vermeld in tabel S1. In rode, opgereguleerde genen; in groene, neerwaarts gereguleerde genen

Figuur 2. De Toppgene-suite is gebruikt voor GO-gebaseerde verrijkingsanalyse op de DEG's. De afbeelding toont enkele van de significante biologische processen die verband houden met het centrale zenuwstelsel en het celmetabolisme, mogelijk veranderd door GPR17-uitschakeling. Blauwe balken geven het totale aantal genen aan dat aan elke term is gekoppeld; rode balken geven voor elke term de genen aan die overeenkomen met onze dataset. De volledige lijst van biologische processen die het resultaat zijn van deze analyse en de relatieve p-waarden worden weergegeven in Tabel S2.

3.2. Metabolomische analyse tijdens OPC-differentiatie in vitro

Om de correlatie tussen GPR17-expressie en de activering van specifieke metabolische routes te beoordelen, hebben we een metabolomische analyse uitgevoerd van gekweekte OPC's tijdens hun fysiologische rijping. OPC's werden bewaard in een differentiatiemedium en vervolgens gelyseerd op vier verschillende tijdstippen (na 0, 1, 3 en 5 dagen in differentiatie, DID), die overeenkomen met verschillende stadia van OL-rijping. Tegelijkertijd, om te beoordelen dat in alle experimenten rijping plaatsvond met de verwachte timing, werden OPC's gekweekt en gekleurd voor GPR17 en MBP. De resultaten toonden aan dat het aantal cellen die GPR17-tot expressie brengen zijn maximum bereikte bij 3 DID en vervolgens terugkeerde naar basale niveaus bij 5 DID, terwijl het aantal MBP-positieve cellen progressief toenam tijdens rijping (Afbeelding 3a), consistent met eerdere resultaten [37]. OPC metabolomische evaluatie werd uitgevoerd door middel van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) zoals eerder beschreven [38], gericht op energetische metabolieten die betrokken zijn bij glycolyse, de pentosefosfaatroute, de Krebs-cyclus, vetzuuroxidatie, hun cofactoren NADH, NAD plus, NADPH, NADP plus, ATP, ADP, AMP, aminozuren en sommige van hun derivaten. De metabolomische profielen van de vier geanalyseerde tijdstippen worden weergegeven in figuur 3b. Op dag 0 waren de niveaus van verschillende metabolieten die behoren tot en/of gekoppeld zijn aan de Krebs-cyclus (bijv. succinaat, malaat, alfa-ketoglutaraat, glutamaat, aspartaat, alanine en proline) hoger, zoals verwacht van cellen die vanuit een sterk prolifererende staat (Figuur 3c). In tussenliggende stadia (van DID 1 tot 3) vertoonden OPC's een duidelijke toename van moleculen die betrokken zijn bij de synthese van vetzuren en cholesterol. Dienovereenkomstig hebben we verhoogde niveaus van acetyl-CoA waargenomen (Figuur 3c), die de voorloper van cholesterol en vetzuren vertegenwoordigt, en van malonyl-CoA, een specifiek tussenproduct van vetzuursynthese. Bij DID 5 zagen we verhoogde niveaus van verschillende acyl-carnitines en aminozuren parallel aan een significante toename van vrije intracellulaire glucose (Figuur 3c). We hebben ook verlaagde niveaus van AMP en ADP waargenomen van dag 0 tot DID 5 en een voorbijgaande toename van ATP tussen DID 1 en DID 3. Deze gegevens geven aan dat vanaf dag 0 tot DID 3, overeenkomend met het tijdelijke venster waarin GPR17 zijn maximale expressie bereikt, gebruikten OPC's voornamelijk glucose en aminozuren om de biosynthese van cholesterol en vetzuren te ondersteunen. Bij DID 5, zoals benadrukt door verhoogde acyl-carnitine-niveaus, vertrouwen OPC's waarschijnlijk op het gebruik van vetzuren. Samen geven deze gegevens aan dat OPC's tijdens fysiologische differentiatie hun energetische metabolisme geleidelijk herbedraden om volwassen myeliniserende OL's te worden.

3.3. Metabolomische analyse na GPR17-uitschakeling tijdens OPC-rijping in vitro

Om de bijdrage van de GPR17-receptor aan het aansturen van de energiemetabolische veranderingen die optreden tijdens celdifferentiatie te onthullen, hebben we metabolomics uitgevoerd op GPR17- tot zwijgen gebrachte OPC's, in vergelijking met controle-OPC's die een gecodeerd RNA ontvangen. We onderzochten eerst de impact van GPR17-uitschakeling op OPC-rijping door immunofluorescentiekleuring voor GPR17 en MBP. Zoals verwacht vonden we na receptoruitschakeling een vermindering van GPR17-kleuring, duidelijk zichtbaar bij 3 DID. We zagen ook een duidelijke toename van het aantal volwassen MBP-positieve OL's bij zowel 3 DID (niet getoond) als 5 DID (Figuur S2). Tegelijkertijd werd een gedetailleerde qPCR-analyse uitgevoerd op vijf tijdstippen (0, 1, 2, 3 en 5 dagen in differentiatie, DID), waarbij in controle-OPC's een sterke toename in GPR17-expressie werd onthuld na 1 DID, dat significante niveaus bereikt vanaf 2 DID, een progressieve toename van MBP-expressie tot 5 DID en een significante afname van de vroege marker NG2 (Figuur 4a). Omgekeerd bereikte GPR17-mRNA na GPR17-uitschakeling (Figuur 4b) lagere niveaus bij DID1 en bleef daarna stabiel laag, de MBP-expressie nam verder toe en NG2 nam verder af. Een directe vergelijking van NG2- en MBP-expressie in GPR17-gedempte versus controle-OPC's op elk tijdstip wordt weergegeven in afbeelding 4c. Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat, onder deze experimentele omstandigheden, GPR17-uitschakeling in OPC's hun differentiatieproces versnelde. Vervolgens werd OPC-metabolomics uitgevoerd door LC-MS/MS op de vijf geselecteerde tijdstippen. Vergelijking van metabolomische gegevens verkregen van GPR17-silenced en controle-OPC's op elk tijdstip stelde ons in staat de metabolieten te identificeren die significant worden beïnvloed door GPR17-silencing

Afbeelding 3. (a) De grafiek toont veranderingen in het percentage GPR17 plus- en MBP plus-cellen tijdens differentiatie. n=3 per groep; one-way ANOVA met Tukey's test. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) De heatmap toont de overvloed aan metabolieten in elk afzonderlijk monster gestopt bij 0, 1 , 3 of 5 DIS. De abundantie van de geanalyseerde metabolieten wordt weergegeven door een chromatische schaal variërend van donkerblauw (zeer lage abundantie) tot donkerbruin (zeer hoge abundantie). n=4–5 per groep. (c) Metabolieten met een overvloed die significant verschilt tussen de omstandigheden (0, 1, 3 en 5 dagen in differentiatie, DID; one-way ANOVA met Fisher's LSD-test).

Bij DID 1 (Figuur 5a) vonden we geen significante veranderingen. Bij DID 2 (figuur 5b) vonden we een significante toename van sommige metabolieten van de Krebs-cyclus (malaat, fumaraatcitraat), een bescheiden toename van vrij carnitine (CO), acetyl-carnitine (C2), propionyl-carnitine (C3: 0), butyryl-carnitine (C4:0), valeryl-carnitine (C5:0), hexadecanoyl-carnitine (C16:0en een aanzienlijke vermindering van glucose , lactaat, creatine en ornithine. De reductie oilactate en creatine en de toename van propionyl-carnitine (C3) werd ook waargenomen bij DID3 (Figuur 5c). Bij DID 5 (Figuur 5d) vonden we nog steeds een toename van vrij carnitine ( CO), acetylcarnitine (C2), propionyl-carnitine (C3:0), butyryl-carnitine (C4:{{30}}), valeryl-carnitine (C5:0 )tetradecanoyl-carnitine (C14:0), hexadecanoyl-carnitine (C16:0), octadecanoyl-carnitineC18:0), octadecenoyl-carnitine (C18:1), vergelijkbaar met wat oorspronkelijk werd waargenomen in meer gedifferentieerde cellen (zie afbeelding 3), een toename van dihydroxyaceton-3-fosfaat/glyceraldehyde3-fosfaat (DHAP/GAP), fumaraat en citraat, en een afname van acetyl-CoA, Met-SOcreatine, taurine en carnosine.

Figuur 4. Effect van GPR17-uitschakeling op OPC-rijping. De expressieniveaus van GPR17 (groen), NG2blue) en MBP (rood) werden geëvalueerd door middel van real-time PCR tijdens differentiatie in controleomstandigheden (cellen getransfecteerd met scramble-RNA en na GPR17-silencing (b), en genormaliseerd versus expressie op T{{ 6}} (ingesteld op 0). n=6 per elk tijdstip. One-way ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstests (a): ** p < {{10} }.001 versus DID 0-2-3-5, @ p < 0.05 versus DID 3-5; ## p < 0.01 vs. dag 0; SSS p < {{30}}.001 vs. DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 versus DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 vs. dag 0, #p < 0,05, ### p < 0,001 vs. dag 0.S p < 0,05, SS p < 0,01, SSS p < 0,001 V. DID 5. (C) NG2- en MBP-expressie in GPR17-gedempte OPC's versus controle-OPC's (ingesteld op 0) op elk tijdstip. Fold change (FC) is gerapporteerd als LOG,(FC). One sample t-test, * p < 0,05, * p < 0,01, *** p < 0,001 vs. relatieve DID in controle-OPC's.

Figuur 5. Metabolomische veranderingen veroorzaakt door GPR17-uitschakeling in OPC's. ( a - d ) De overvloed van elke metaboliet na GPR17-uitschakeling is genormaliseerd naar die in het relatieve controlemonster. De resulterende vouwveranderingen werden gebruikt om een ​​vulkaanplot te genereren voor elk tijdspunt (1, 2, 3, 5 dagen in differentiatie). De punten boven de horizontale stippellijn vertegenwoordigen de metabolieten die een statistisch significante verandering hebben vertoond (Fisher's LSD gecorrigeerd door FDR; p.adj < 0.1). In groen, metabolieten met lagere expressie, in rood, die met hogere expressie, na GPR17-uitschakeling. n=7–9 per groep. DID: dagen in differentiatie.

3.4. GPR17 moduleert lactaatafgifte tijdens OPC-rijping

Op basis van de hierboven beschreven metabolomics-resultaten bleek GPR17-uitschakeling de intracellulaire niveaus van lactaat te verlagen. Om te beoordelen of deze verlaging een algemene afname van het lactaatmetabolisme of een verhoogde afgifte van deze metaboliet weerspiegelt, hebben we de niveaus ervan in cellysaten en in de overeenkomstige media op verschillende tijdstippen gemeten. Zoals getoond in Figuur 6, bereikte intracellulair lactaat onder controleomstandigheden de hoogste hoeveelheid bij DID 2 (Figuur 6a) (wanneer GPR17-receptorexpressie ook maximaal is), en toen nam het af toen de cellen volwassen werden. In plaats daarvan werd na het uitschakelen van GPR17 de stijging van intracellulair lactaat afgeschaft en daalden de niveaus verder in de richting van differentiatie. Inderdaad, een vergelijking van lactaatniveaus in GPR17-gedempte OPC's versus controle-OPC's op elk tijdstip toonde een verlaging van de niveaus ervan bij DID 2 en 3 (Afbeelding 6b). Het extracellulaire lactaat volgde een andere kinetiek en vertoonde een significante reductie in vergelijking met DID 1 bij DID 2-3-5 onder controleomstandigheden, terwijl het in GPR17-gedempte OPC's stabiel hoger bleef en vervolgens aanzienlijk afnam bij DID 5 (Afbeelding 6c ). Bij het vergelijken van lactaatniveaus op de verschillende tijdstippen tussen de twee experimentele omstandigheden, belemmerde GPR17-uitschakeling de fysiologische reductie,toenemende aanwezigheid van lactaatin het medium bij DID 2 en 3 (Figuur 6d),suggereert een verhoogde release.

Figuur 6. GPR17-uitschakeling in OPC's verandert het lactaatmetabolisme. ( a ) Lactaatovervloed tijdens OPC-rijping in controleomstandigheden (groene lijn) en na GPR17-uitschakeling (oranje lijn). n=7–9 per groep. One-way ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. * p < 0.05, ** p < 0.01 versus DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 vs. DID1 siGPR17 (b ) Lactaatniveaus na GPR17-uitschakeling waren genormaliseerd versus controlemonsters (ingesteld op 1) op elk tijdstip (n=7–9). ** p < 0,01; één steekproef t-toets. Geconditioneerde media van GPR17-silenced en controle-OPC's werden verzameld uit dezelfde kweek die werd gebruikt voor metabolomische analyse. Lactaatniveaus in de media werden beoordeeld met LC-MS/MS. ( c ) De overvloed aan lactaat in de extracellulaire ruimte tijdens OPC-rijping in controleomstandigheden (groene lijn) en na GPR17-uitschakeling (oranje lijn). One-way ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus DID1 CTL; § p < 0,05 versus DID5 siGPR17. ( d ) Extracellulaire lactaatniveaus na GPR17-uitschakeling werden op elk tijdstip genormaliseerd versus controlemonsters (ingesteld op 1). * p < 0,05; ** p < 0,01; één steekproef t-toets. Het effect van MCT1-remming in controle (e,g) en GPR17-silenced (f,h) OPC's is geëvalueerd door analyse van de expressie van MBP, in met remmer behandelde monsters vs. relatieve controles (met voertuig behandeld) , op 3 en 5 dagen differentiatie. n=6 per groep.

Een van de mechanismen waardoorOPC's kunnen lactaat afgevenis via de monocarboxylaattransporter MCT1. Bovendien meldden recente studies dat OPC's zelf extracellulair lactaat kunnen verwerven via MCT-receptoren die hun celcyclus en differentiatie bevorderen [39]. Daarom vroegen we ons af of de verhoogde afgifte van lactaat geïnduceerd door GPR17-uitschakeling kan worden gemedieerd door MCT1 en of dit gedeeltelijk verantwoordelijk kan zijn voor het waargenomen effect op OPC-rijping onder dezelfde omstandigheden (Figuur 4). Hiertoe hebben we OPC's behandeld met AR-C155858, een selectieve remmer van MCT1, tijdens normale differentiatie en na GPR17-uitschakeling. Zoals verwacht werd de lactaatafgifte in beide omstandigheden met succes geremd (Figuur S3). Het effect van MCT1-remming op OPC-rijping in de verschillende experimentele omstandigheden werd geëvalueerd door de expressieniveaus van MBP te analyseren. Een bescheiden vermindering van de genexpressie van MBP, die dicht bij de statistische significantie ligt (p=0.07), is alleen gevonden in monsters die zijn getransfecteerd met specifiek siRNA voor GPR17 (Figuur 6e-h); er ontstond echter geen significante variatie in de monsters die waren getransfecteerd met controle-RNA (siNEG). Deze resultaten suggereren dat de toename van extracellulair lactaat gemedieerd door GPR17-downregulatie de rijping van OPC's bevordert; de kleine mate van MBP-reductie geeft echter aan dat deze metaboliet niet de enige factor is die bij het proces betrokken is.

3.5. Lipidomische analyse na GPR17-uitschakeling tijdens OPC-rijping

De resultaten van de transcriptomische analyse na GPR17-uitschakeling benadrukten ook een mogelijk verband tussen de functie ervan en de synthetische routes van lipiden en cholesterol, de belangrijkste componenten van myeline. Om de rol van GPR17 in het lipidenmetabolisme verder te onderzoeken, hebben we LC-MS/MS toegepast op de lipidomische analyse van GPR17-silenced OPC's na 2, 3 en 5 dagen in differentiatie, in vergelijking met dag 0. De lijst met de geanalyseerde lipiden, relatieve vouwveranderingen en p-waarden worden vermeld in tabel S4. De twee meest voorkomende lipidenklassen in de experimentele groepen waren vetzuren en de diacyl-fosfatidylcholine (PCaa) familie. Tijdens de differentiatie van controle-OPC's vonden we geen significante veranderingen in de overvloed van een lipideklasse. In plaats daarvan vertoonden GPR{11}}gedempte OPC's een trend in de richting van een veranderde overvloed aan vrije vetzuren, ceramiden, acyl-alkyl-fosfatidylcholine (PCae) en fosfatidylinositol (PI) in vergelijking met controle-OPC's, vooral bij DID 3 en 5, maar alleen diacyl-fosfatidylethanolamine (PEaa) en sfingomyeline (SM) vertoonden een statistisch significante verandering (Figuur 7).

Figuur 7. Veranderingen in overvloed aan lipidenklassen veroorzaakt door GPR17-uitschakeling tijdens OPC-differentiatie. De overvloed van elke lipideklasse in controleomstandigheden op verschillende tijdstippen wordt gerapporteerd (a) De kinetiek van elke lipideklasse nadat GPR17-uitschakeling werd geanalyseerd: (b) vetzuren, (C) ceramiden (d) LysoPC (lysofosfatidyl-cholines), (e) LysoPE (lysofosfatidylethanolamines), (f) PCaa (diacyl-fosfatidyl-cholines), (g) PCae (acyl-alkyl-fosfatidyl-cholines), (h) PEaa (di-acylfosfatidyl-ethanolamines), (i) PEae (acyl-alkyl-fosfatidyl-ethanolaminen), (i) PI (fosfatidylinositolen), (k) PS (fosfatidyl-serines), (D SM (sfingomyelinen). n=5 voor elke groep. Kinetiek: tweerichtingsverkeer ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. siGPR17: Tweezijdige ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Sidak. * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0,01.

Vergelijking van lipidomische gegevens verkregen van GPR17-silenced en controles op elk tijdstip stelde ons in staat de lipiden te identificeren die significant werden beïnvloed door GPR17-silencing. Na 2 DID werden geen significante veranderingen gevonden (gegevens niet getoond). Na 3 DID was diacylfosfatidylcholine (PCaa) C40:4 minder overvloedig en diacyl-fosfatidylethanolaminePEaa) C34:3 meer overvloedig aanwezig in GPR 17-gedempte OPC's (Figuur 8a). Na 5 dagen differentiatie leidde GPR17-uitschakeling tot verschillende veranderingen in de hoeveelheid lipiden: vermindering van verschillende diacyl-PC's en diacyl-PE en een gelijktijdige toename van verschillende plasmalogenen (acylalkyl-PC) samen met sfingomyeline (SM) C18:1 en SM (OH) C16:1 (Afbeelding 8b). Deze gegevens geven aan dat de neerwaartse regulatie van GPR17 het lipidenprofiel van het hoofdbestanddeel van myeline als PC en PE verandert.

Figuur 8.Lipidomische veranderingen geïnduceerd door GPR17-uitschakeling in OPC's. ( a, b ) De overvloed van elk lipide na GPR17-uitschakeling is genormaliseerd naar die in het relatieve controlemonster. De resulterende vouwveranderingen werden gebruikt om een ​​vulkaanplot te genereren voor elk tijdspunt (3, 5 dagen in differentiatie). De punten boven de horizontale stippellijn vertegenwoordigen de metabolieten die een statistisch significante verandering hebben laten zien (Fisher's LSD gecorrigeerd door FDR; p.adj < 0.1). In groen, lipiden met lagere expressie, in rood, die met hogere expressie, na GPR17-uitschakeling. n=5 per groep.

Vraag voor meer:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp% 2fTel% 3a plus % 7b% 7b0% 7d% 7d

WINKEL:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop