Hoe remt de kruidensubstantie Acteoside tumorcellen?

Contact: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ABSTRACT

Natuurlijke producten worden gekenmerkt door extreme structurele diversiteit en bieden daarom een unieke bron voor de identificatie van nieuwe anti-tumormiddelen. Hierin melden we dat de kruidensubstantieacteosidegeïsoleerd worden door geavanceerde fytochemische methoden van Lippia citriodora bladeren vertoonde verhoogde cytotoxiciteit tegen gemetastaseerde tumorcellen; werkte in synergie met verschillende cytotoxische middelen en gesensibiliseerde chemoresistante kankercellen.Acteosidevan herba cistanchcewas niet toxisch in fysiologische cellulaire contexten, terwijl het de oxidatieve belasting verhoogde, de activiteit van proteostatische modules beïnvloedde en matrixmetalloproteinasen in tumorcellijnen onderdrukte. Intraperitoneale of orale (via drinkwater) toediening vanCistancheacteoside in een melanoom muis model upregulated antioxidant reacties in de tumoren; toch onderdrukte alleen intraperitoneale toediening de tumorgroei en geïnduceerde antitumor-reactieve immuunresponsen. Massaspectrometrie-identificatie-/kwantificeringsanalyses toonden aan dat intraperitoneale toediening vanacteosideresulteerde in significant hogere, versus orale toediening, de concentratie van de verbinding in het plasma en tumoren van behandelde muizen, wat suggereert dat het in vivo antitumoreffect afhankelijk is van de toedieningsweg en de bereikte concentratie in de tumor. Ten slotte toonden moleculaire modelleringsstudies en enzymatische activiteitstests aan dat acteoside eiwitkinase C remt.

Zoekwoorden:Acteoside, Kanker, Natuurlijke verbinding, Oxidatieve stress, Proteostase, Immunomodulatie

Cistanche anti-tumor, klik hier om het monster te krijgen

1. Inleiding

Carcinogenese wordt gekenmerkt door de deregulering van verschillende celsignaleringsroutes en wordt geassocieerd met verhoogde cellulaire oxidatieve, replicerende, metabole, genotoxische en proteotoxische stress [1]. Om deze stressfenotypen aan te passen en te overwinnen, upreguleren kwaadaardige cellen (afgezien van oncogenen) verschillende niet-oncogene routes met als doel om aanhoudende stress te onderdrukken of (op zijn minst) te verlichten. Onder de verschillende niet-oncogene routes die vaak worden geupreguleerd tijdens tumorigenese zijn de modules van het proteostasenetwerk (PN) samen met cellulaire antioxidantresponsen [2,3].

Belangrijke componenten van het PN zijn de twee belangrijkste afbraakmachines, namelijk de Autofagie-Lysosoomroute (ALP) en de Ubiquitine-Proteasoomroute (UPP), samen met het netwerk van de cellulaire moleculaire chaperones. ALP is voornamelijk betrokken bij de afbraak van eiwitaggregaten en beschadigde organellen [4], terwijl UPP normale kortlevende eiwitten en niet-herstelbare verkeerd gevouwen of ontvouwde eiwitten afbreekt [5-8]. Het 26Seukaryote proteasoom bestaat uit de 19S regulerende deeltjes (RP) en het 20 Score deeltje (CP); de laatste bestaat uit vier gestapelde heptamerische ringen (twee van α-type rond twee van β-type) die een vatachtige structuur vormen. De chymotrypsine-achtige (CT-L), trypsine-achtige (T-L) en caspase-achtige (C-L) proteasoom peptidase-activiteiten bevinden zich respectievelijk in de β5-, β2- en β1 proteasomale subeenheden [6]. De aangetoonde klinische werkzaamheid van de proteasoomremmers Bortezomib (Velcade®; ook ps-341 genoemd) en carfifilzomib tegen verschillende hematologische maligniteiten [9] heeft de "proof-of-concept" opgeleverd om UPP te richten als een veelbelovende strategie voor de behandeling van kanker. Het complexe netwerk van cellulaire antioxidantafweerroutes die vaak worden upreguleerd tijdens carcinogenese [3,10] omvat antioxiderende enzymen, evenals verschillende transcriptiefactoren die cytoprotectieve genomische reacties mobiliseren; deze omvatten vorkkopdoos O (Foxo) en de nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor (Nrf-2). Nrf-2 staat centraal in de bescherming van cellen tegen oxidatieve en/of xenobiotische schade omdat het de expressie van antioxidant- en fase II-genen stimuleert [11-13].

Wij en anderen hebben onlangs voorgesteld dat het richten op deze tumorafhankelijkheden (d.w.z. proteostatische modules en / of antioxidantresponsroutes) of het verhogen van cellulaire niveaus van ROS in de context van een getransformeerd genotype een potentieel therapeutisch venster bieden voor het selectief doden van tumorcellen [3,14]; ter ondersteuning is selectief doden van kankercellen door een klein molecuul gemeld dat cellulaire ROS-niveaus upreguleerde [2]. Er wordt verwacht dat combinatorische benaderingen, waaronder ook de activering van anti-tumor-reactieve immuunresponsen [15] waarschijnlijk het therapeutische venster zullen maximaliseren dat wordt geboden door PN- en antioxidantresponsen te remmen en / of door cellulaire ROS-niveaus te verhogen.

Natuurlijke producten (extracten of zuivere verbindingen) (NP's) uit verschillende bronnen (planten, mariene organismen, micro-organismen, enz.) worden gescreend op hun vermogen om als antitumormiddelen te fungeren vanwege hun extreme structurele diversiteit en chemische complexiteit, evenals omdat ze pleiotroop verschillende cellulaire signaalroutes moduleren [16]. Naar verluidt activeren NP's anti-inflfmmatory, anti-tumor en /of anti-gemetastaseerde responsen [16,17] en ontwijken ze ook multidrugresistentie [18,19]. Onder deze, fenolverbindingen (met inbegrip van fenylethanoïde glycosiden) hebben aanzienlijke belangstelling getrokken vanwege hun gerapporteerde rol in de preventie en / of behandeling van verschillende menselijke ziekten.

Acteoside, ook wel kusagin of verbascoside [20] genoemd, is een fenylethaanglycosside geïsoleerd uit vele tweezaadlobbigen. Naar verluidt oefent acteoside een aantal interessante biologische activiteiten uit, waaronder antioxiderende, ontstekingsremmende en celapoptose regulerende eigenschappen [21,22]. Niettemin is de potentiële antitumoractiviteit niet aangepakt. We melden hier dat acteoside verhoogde cytotoxiciteit vertoonde tegen zoogdierkankercellen zonder duidelijke toxische effecten in fysiologische cellulaire contexten. Verder onderdrukte acteoside de groei van melanoomtumoren in een in-a vivo muismodel, door (onder andere) antitumor-reactieve immuunresponsen te activeren.

anti-tumor cistanche extract

2. Materialen en methoden

2.1. Plantaardig materiaal en extractie

Gedroogde Lippia citriodora (Lamiaceae) bladeren (4,5 kg) werden gekocht van de lokale markt in Athene, Griekenland. De bladeren werden verpulverd en geëxtraheerd door mechanisch roeren gedurende 12 uur met methanol (2 × 20 L). Het methanolische extract werd verdampt tot droogheid en gewassen met een mengsel van CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). Het onoplosbare residu werd gescheiden en gedroogd, waardoor een groengeel poeder (450 g) ontstond.

2.2. Zuivering van acteoside en UPLC-HRMS-analyse

Een deel (10 g) van het bovengenoemde residu werd onderworpen aan tegenstroomchromatografie met behulp van een apparaat voor snelle centrifugale partitiechromatografie (FCPC) (Kromaton, Frankrijk); een mengsel van EtOAc/EtOH/H2O in verhouding 5/0,5/4,5 werd gebruikt als bifasisch oplosmiddelsysteem. Verzamelde fracties werden onderworpen aan Thin Layer Chromatography; vervolgens werden de chromatogrammen waargenomen onder een UV-lamp (254 en 365 nm) en gevisualiseerd door te spuiten met methanol vanillinesulfaat gevolgd door verhitting gedurende twee minuten. Een totaal van 2,1 g acteoside (zuiverheid ≥ 90%) werd geïsoleerd door het bovengenoemde proces. De identificatie van acteoside werd uitgevoerd door nucleaire magnetische resonantie (NMR) en massaspectrometrie (MS) spectra, terwijl de zuiverheid ervan werd vastgesteld door UPLC-MS en NMR-analyse; voor details zie Suppl. Materialen en methoden.

2.3. Cellijnen

Menselijke longembryonale fibroblasten (IMR90-cellen) samen met de B16. F1, B16. F10, YAC-1 en WEHI-164 muiscellijnen werden verkregen uit de American Tissue Culture Collection (ATCC). De U2 OS en Sa OS menselijke osteosarcoom cellijnen werden vriendelijk gedoneerd door Prof. V. Gorgoulis (School of Medicine, National and Kapodistrian University of Athens, Griekenland), terwijl de KH OS osteosarcoom cellen en de chemoresistante osteosarcoom cellijnen [23] een donatie waren van Dr. E. Gonos (National Hellenic Research Foundation, Griekenland). De muiskankercellijnen C5N en A5 behoren tot een meertraps muizenhuidcarcinogenesemodel [24,25] en werden gedoneerd door Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA). Kweekomstandigheden van de gebruikte cellijnen worden gerapporteerd in Suppl. Materials and Methods.

voordeel van cistanche extract: anti-kanker

2.4. Melanoom muis model

Mannelijke C57BL/6-muizen (25-30 g gewicht, 6-8 weken oud) werden verkregen van het Hellenic Pasteur Institute en gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur (22 °C) en fotoperiode (12 uur licht: 12 uur donker) met vrije toegang tot water en voedsel. Muizen werden subcutaan geïnoculeerd met 105 B16. F1 melanoomcellen (in 100 μL PBS) en werden willekeurig toegewezen aan 3 groepen (n = 5/groep). Toen tumoren palpabel werden (dag 11) kregen muizen acteoside via twee routes; ofwel intraperitoneaal (IP) (1 mg/muis verdund in 200 μL PBS; in totaal 6 doses om de andere dag toegediend) of oraal via drinkwater (OR)(2,5 mg/muis; in totaal 13 doses gedurende 13 opeenvolgende dagen). Controlemuizen kregen PBS toegediend. Tumorgroei werd elke 2 dagen geregistreerd door de grote en kleine assen van de gevormde tumoren te meten met een digitale remklauw. Metingen werden omgezet in tumorvolume met behulp van de formule: tumorvolume (cm3) = grote as × kleine as2 × 0,5. Op dag 28 werden dieren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie en milten werden aseptisch verwijderd. Het experiment werd drie keer herhaald met vergelijkbare bevindingen.

Splenocyten werden geïsoleerd uit individueel gehomogeniseerde milten en onmiddellijk getest op hun cytotoxiciteit versus B16. F1,YAC-1 en WEHI-164 celdoelen. Cytotoxiciteit werd geëvalueerd op basis van de detectie van CD107-blootstelling op het celoppervlak, als gevolg van effectorceldegranulatie. Splenocyten (105 cellen/put) werden samen gekweekt met doelwitten in 96-well U bodemmicroplaten bij een effector tot target (E: T) verhouding van 100:1, bij 37 °C in 5% CO2. FITC-geconjugeerde anti-CD107a en anti-CD107 b monoklonale antilichamen (25 μL / ml) en monensin (6 μL / ml; allemaal van BD Biosciences) werden toegevoegd in elke put. Cellen werden 6 uur later geoogst en geanalyseerd met behulp van een FACSCanto II flflowcytometer. Tegelijkertijd werden tumoren weggesneden en verwerkt voor downstream assays zoals beschreven in Suppl. Materials and Methods.

cistanche extract effecten: anti-tumor en kanker