[ 18F]-natriumfluoride autoradiografie Beeldvorming van nefrocalcinose in de nieren van de donor en geëxplanteerde niertransplantaten

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan-Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrocalcinoseis aanwezig in maximaal 43 procent vannierallograft-biopten één jaar na transplantatie en wordt geassocieerd met inferieure transplantaatfunctie en slechte transplantaatoverleving. We bestudeerden [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) beeldvorming van microcalcificaties in donornieren (n= 7) ennierallograften (n= 13). Drie µm in paraffine ingebedde seriële coupes werden gebruikt voor histologische evaluatie van verkalking (Alizarin Red; Von Kossa-kleuring) en ex-vivo [18F]-NaF-autoradiografie. De beelden werden samengevoegd om te beoordelen of microcalcificatiegebieden overeenkwamen met [18F]-NaF-opnamegebieden. Op basis van histologische analyses waren tubulo-interstitiële en glomerulaire microcalcificaties aanwezig in respectievelijk 19/20 en 7/20 monsters. Met behulp van autoradiografie werd [18F]-NaF-opname gevonden in 19/20 monsters, met significant meer traceractiviteit innierallograft vergeleken met niermonsters van overleden donoren (p {{0}}.019). Alizarine Red-kleuring van actieve microcalcificaties vertoonde een goede correlatie (Spearman's rho van 0,81, p < 0,001),="" en="" von="" kossa-kleuring="" van="" geconsolideerde="" calcificaties="" vertoonde="" een="" significante="" maar="" zwakke="" correlatie="" (0,62,="" p="0" 0,003)="" met="" [18f]-naf-activiteit.="" deze="" correlatie="" tussen="" ex-vivo="" [18f]-naf-opname="" en="" histologisch="" bewezen="" microcalcificaties,="" is="" de="" eerste="" stap="" naar="" een="" beeldvormingsmethode="" om="" microcalcificaties="" in="">nefrocalcinose. Dit kan leiden tot een beter begrip van de etiologie van microcalcificaties en hun impact op de niertransplantatiefunctie.

Klik om voordelen van cistanche-extract voor nierziekte te bekijken

Nefrocalcinose, gedefinieerd als parenchymale en tubulaire afzetting van calciumoxalaat (CaOx) of calciumfosfaat (CaPhos), is een belangrijke factor in de achteruitgang van de transplantaatfunctie naniertransplantatie1–3. Afzetting van CaOx en CaPhos wordt toegeschreven aan hoge niveaus van serumoxalaat, serumcalcium en serumfosfaat bij patiënten met chronischenierziekte en/of hyperparathyreoïdie4,5. De incidentie vannefrocalcinose, op basis van niertransplantaatbiopten, is 6 procent na 6 maanden, 25-43 procent na één jaar en tot 79 procent na 10-jaar naniertransplantatie5-7. Studies gericht op niertransplantaatbiopten binnen een jaar na transplantatie toonden een verband aan tussen de vroege aanwezigheid van calciumafzettingen en zowel een inferieure transplantaatfunctie als een slechte overleving van het transplantaat4,8,9. Het blijft echter onduidelijk of deze microcalcificaties een actieve rol spelen bij disfunctie van het transplantaat of slechts indicatoren zijn van een gedereguleerd mineraalmetabolisme.

Tot op heden,nierallograft-biopten zijn de enige diagnostische methode om microcalcificaties na de transplantatie te evalueren. Een niet-invasieve en betrouwbare diagnostische benadering zou herhaalde metingen mogelijk maken, het volgen van calcificaties in de loop van de tijd en interventiestudies vergemakkelijken met de mogelijke verbetering van de resultaten voor de transplantaatfunctie en transplantaatoverleving na niertransplantatie10.

Positronemissietomografie/computertomografie (PET/CT) beeldvorming met [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) wordt gebruikt in de klinische praktijk en experimentele studies als skelet- en vasculaire beeldvormingsmodaliteit11-15. Hoewel betrouwbare visualisatie van vasculaire microcalcificaties wordt belemmerd met CT-beeldvorming, correleerden de resultaten van ex-vivo [18F]-NaF microPET-beeldvorming goed met histologisch bewezen microcalcificaties in vasculaire monsters van mens en dier16,17. Bovendien toonden de resultaten van verschillende prospectieve klinische onderzoeken aan dat vroege vasculaire [18F]-NaF-activiteit goed verband houdt met zowel microcalcificaties, gedetecteerd door CT-beeldvorming, als, interessanter, de toename in de grootte van deze calcificaties .

Hier presenteren we de resultaten van een proof-of-concept autoradiografie-onderzoek voor ex-vivo gebruik van [18F]-NaF-beeldvorming vannefrocalcinosein donor'snierenen getransplanteerde niertransplantaten als diagnostische benadering voor de visualisatie van microcalcificaties.

Tafel 1.Nierkenmerken van de ontvanger van een transplantatie. Geen gevallen van hypercalciëmie in dit cohort; *classificatie van Banf-classificatie van allograftpathologie—201828; FSGS=Focale segmentale glomerulosclerose; IFTA=Interstitiële fibrose en tubulaire atrofie; overeenkomstige autoradiografie- en histologieresultaten worden gepresenteerd in aanvullende S1.

Tabel 2. Overledennierkenmerken van de donor. * Hart- en vaatziekten gedefinieerd als een cerebrovasculair voorval, myocardinfarct, vaatziekte die invasieve interventie vereist; **zoals opgemerkt door het inkoopteam; Overeenkomstige autoradiografie- en histologieresultaten worden gepresenteerd in aanvullende S2; geen donoren met diabetes mellitus.

Resultaten

Voorbeeld cohort.

Dertienniermonsters werden verkregen na transplantatie, met een mediaan van 33 [IQR 9–66] maanden na transplantatie, van ontvangers van een transplantatie met een mediane leeftijd van 51 [IQR 30–64] jaar. Transplantectomie werd uitgevoerd voor afstoting van het transplantaat (Banf IIA en IIB) bij zeven patiënten, chronische allograft-arteriopathie bij twee patiënten, allograft-infectie bij twee patiënten, primair niet-functioneren bij één patiënt en interstitiële fibrose en tubulaire atrofie graad III bij één patiënt. Acht van de 13 (61,5 procent) patiënten hadden hyperparathyreoïdie, zeven (53,8 procent) hadden hyperfosfatemie, vijf (38,5 procent) hadden diabetes mellitus en geen van deze patiënten had tekenen vannefrocalcinoseop klinische echografie of een voorgeschiedenis van nierstenen (tabel 1). Er werden zeven niermonsters van overleden donoren afgenomen van donoren met een mediane leeftijd van 65 [IQR 64-71] jaar. Vier van de zeven (57,1 procent) donoren had een voorgeschiedenis van hart- en vaatziekten, geen van hen had diabetes mellitus en zes van de zeven (85,7 procent) had atherosclerose van het niervaatstelsel bij visuele inspectie, wat mogelijke factoren zijn voor het afwijzen van deze donornieren(Tafel 2).

Figuur 1. Autoradiografiebeeld van [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) opname (A), met het overlaybeeld van [18F]-NaF opname met Alizarin rood kleuring van microcalcificaties (B) en Von Kossa kleuring van calcificaties (C).

Autoradiografie en histologie.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 procent in 5 (25 procent) van de 20 monsters (Fig. 1 en Fig. 2A) (Aanvullende S1 en Aanvullende S2, met de autoradiografie en overlay-afbeeldingen voor alle monsters). Het aantal [18F]-NaF-gebieden was significant hoger innierallograft-monsters vergeleken met overleden donorniersteekproeven, met een mediaan van 7.0 [IQR 4.0–15.5] en 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], respectievelijk (p=0.019) (Aanvullende S3).

Tubulo-interstitiële microcalcificaties, gevisualiseerd met Alizarin-roodkleuring, waren aanwezig in 19 van de 20 monsters, met een mediaan van 5,5 [IQR 2–10,3] per monster, en glomerulaire microcalcificaties werden gezien in zeven uit 2 0 monsters, met een mediaan van 1 [IQR 1-3] per monster (Fig. 2B). Een significant hoger aantal microcalcificaties werd waargenomen in niertransplantaatmonsters in vergelijking met niermonsters van overleden donoren, met een mediaan van 9.0 [IQR 5.0-20.5] en 4.0 [IQR 1.0-4.0], respectievelijk (p=0.046) (aanvullende S3). Met Von Kossa-kleuring werden tubulo-interstitiële calcificaties gezien in 18 van de 20 monsters, met een mediaan van 2,5 [IQR 1-5] per monster, en glomerulaire calcificaties werden gezien in zeven van de 20 monsters, met een mediaan van 1 [IQR 0-3 ] per monster (Fig. 2C). Het aantal verkalkingen was niet significant verschillend tussennierallograftmonsters en niermonsters van overleden donoren, met een mediaan van 4.0 [IQR 2.0–6.0] en 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], respectievelijk (p=0.311) (Aanvullende S3). De interobserver-reproduceerbaarheid werd vastgesteld tussen visuele en semi-geautomatiseerde detectie van calcificaties, met een ICC van 0,94 (95 procent CI 0,85-0,98) voor Alizarin-roodkleuring en van 0.77 (95 procent BI 0.42–0.91) voor Von Kossa-kleuring.

Overlay-beelden van autoradiografie en histologieresultaten toonden co-lokalisatie van [18F]-NaF-opname met Alizarin-roodkleuring voor microcalcificatie (Fig. 1B). Ter vergelijking: overlay-beelden van [18F]-NaF-opname en Von Kossa-kleuring van calcificaties toonden opname in gebieden zonder histologisch bewezen calcificaties (Fig. 1C). De vals-negatieve [18F]-NaF-opname, als het percentage histologisch bewezen (micro)calcificatiegebieden buiten de overlay, was mediaan 0 procent [IQR 0–25 procent ] voor Alizarine rode gebieden en mediaan 100 procent [65–100 procent ] voor Von Kossa-gebieden. Alizarine Red-kleuring van microcalcificaties toonde een goede correlatie met [18F]-NaF-opname (Spearman's rho van 0,81 (95 procent BI 0,57-0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 procent [18F]-NaF-opname (Fig. 4).

Figuur 2. Overlay afbeelding van [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) opname en (Alizarine rood) microcalcificaties (A), met Alizarin rood kleuring voor microcalcificaties (B) en Von Kossa kleuring voor calcificaties (C).

Kenmerken van de ontvanger op het moment van transplantectomie.

Er werden geen verschillen waargenomen tussennierallografmonsters van patiënten met (n{{0}}) of zonder hyperfosfatemie (n=6), voor het aantal [18F]-NaF-gebieden (mediaan 5.0 [IQR 2.0–11.8] versus 7.0 [7.0–23.0], p=0.170) , Alizarine rood (mediaan 7,5 [IQR 5.0–14.0] versus 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390), en Von Kossa (mediaan 5.0 [IQR 3.5–6.3] versus 3.0 [2.{ {59}}–5.0], p=0.247). Vergelijking van niertransplantaatmonsters van patiënten met (n=8) of zonder (n=5) hyperparathyreoïdie liet geen verschillen zien voor het aantal [18F]-NaF-gebieden (mediaan 7.0 [IQR 4.0–7,5] versus 7,5 [4.0}–23.0], p=0.459), alizarine rood (mediaan 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] versus 1{{10}3}}.0 [3.5–32.8], p{{76 }},769) en Von Kossa (mediaan 4.0 [IQR 1,5-5.0] versus 4,5 [2.0-6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). Er werden geen significante verschillen vastgesteld tussen niertransplantaatmonsters van patiënten met (n=5) of zonder (n=8) diabetes mellitus, voor het aantal [18F]-NaF-gebieden (mediaan 5,5 [IQR 2,5– 19,3] versus 7,0 [6,5-15,5], p=0,524), alizarine rood (mediaan 10,0 [IQR 5,5–24,8] versus 9,0 [4,0–8,5], p=0,833), en Von Kossa (mediaan 3,0 [IQR 2,0-5,8] versus 4,0 [3,5-8,5], p=0,284). Voor de tijd tussen transplantatie en transplantectomie (maanden) werden geen significante correlaties waargenomen met het aantal [18F]-NaF-gebieden (p=0.586), Alizarine rood (p=0.667) en Von Kossa (p=0.459). Voor de leeftijd op het moment van transplantatie werden geen significante correlaties gevonden met het aantal [18F]-NaF-gebieden (p=0.902), Alizarine rood (p=0.798) en Von Kossa (p =0.334). Evenzo werden er geen significante correlaties waargenomen tussen de duur van de kiesperiode (maanden) nanierallograffalen en aantal [18F]-NaF-gebieden (p=0.481), Alizarine rood (p=0.565) en Von Kossa (p=0.174).

Figuur 3. Correlatie van het aantal [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) gebieden met Alizarin roodgekleurde microcalcificaties (A) en von Kossa gekleurde calcificaties (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 procent [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) traceroppervlak, voor het aantal met Alizarin roodgekleurde microcalcificaties (A) en von Kossa, gekleurde calcificaties (B) (mediaan, interkwartielbereik).

Discussie

In deze proof-of-concept-studie, ex-vivo [18F]-NaF-opname in de mensnierparenchymmonsters vertoonden een goede correlatie met histologisch bewezen microcalcificaties. Opname van [18F]-NaF correleerde sterker met Alizarine-roodkleuring voor actieve microcalcificaties in vergelijking met Von Kossa-kleuring van geconsolideerde calcificaties, wat een rol suggereert voor [18F]-NaF-beeldvorming bij de identificatie van vroege stadia van nefrocalcinose.

De gepresenteerde monsters vertegenwoordigen een casusmix van donornieren en geëxplanteerde niertransplantaten. Deze twee monstertypes verschilden met betrekking tot tracerbinding, waarbij meer [18F]-NaF-opname werd waargenomen in geëxplanteerde niertransplantaatmonsters. Dit is in lijn met eerdere publicaties, waarin melding wordt gemaakt van een toename van microcalcificaties na niertransplantatie5-7. de vereniging vannefrocalcinosemet een inferieure transplantaatfunctie op het moment van biopsie en één jaar na transplantatie is gerapporteerd in twee niertransplantaatbioptenstudies, met 258 en 149nierrespectievelijk ontvangers van transplantaties8,9. Bovendien wordt in een longitudinaal cohort met 97 niertransplantatiepatiënten een significant slechtere 1-jaars en 12-jaars transplantaatoverleving aangetoond bij patiënten met calciumoxalaatafzettingen (dwz een grafoverleving van 98,6 procent versus 72,5 procent). en 79,3 procent versus 49,7 procent, respectievelijk). In multivariate logistische regressieanalyse was de aanwezigheid van calcium-oxalaatafzettingen onafhankelijk geassocieerd met grafverlies, in een model met oa creatinine op het moment van biopsie en donortype4. De specifieke rol van microcalcificaties in deze cascade vannierachteruitgang van de allograftfunctie blijft onduidelijk. In de klinische setting vóór transplantatie worden CaOx-afzettingen toegeschreven aan hoge niveaus van serumoxalaat, een molecuul dat niet efficiënt wordt verwijderd tijdens dialyse4. Terwijl CaPhos-afzettingen het vaakst worden gezien bij patiënten met hyperparathyreoïdie en hoge serumcalciumspiegels, als gevolg van een verstoord mineraalmetabolisme voor en na transplantatie5. We vonden geen verschillen in histologie en autoradiografische resultaten voor hyperfosfatemie, hyperparathyreoïdie, diabetes mellitus, de tijd tussen transplantatie en transplantectomie, en de dialyseduur na niertransplantaatfalen.

Voor de ontwikkeling van nieuwe behandelstrategieën voor actieve microcalcificaties bijnefrocalcinose, moet de klinische relevantie ervan met betrekking tot (chronisch) transplantatiefalen beter worden begrepen. Met de identificatie van een doelgroep met een hoog risiconierontvangers van transplantaties, kunnen klinische studies worden opgezet om behandelstrategieën te onderzoeken21. Een mogelijke focus zou kunnen liggen in de opregulatie van endogene calcificatieremmers, met een specifieke nadruk op osteopontine3.

Gezien de hoge incidentie vannefrocalcinoseen de associatie met de functie van niertransplantaten, is een beter begrip van de etiologie van microcalcificaties gerechtvaardigd. Een niet-invasieve en betrouwbare diagnostische benadering om microcalcificaties bij vroege nefrocalcinose te identificeren en te kwantificeren, zou studies mogelijk kunnen maken naar de impact van nefrocalcinose op de niertransplantatiefunctie. [18F]-NaF-beeldvorming is van belang, aangezien [18F]-NaF-opname in menselijke en dierlijke vasculaire monsters wordt verhoogd in biologisch actieve verkalkingsgebieden voordat deze gebieden kunnen worden gevisualiseerd door microcomputertomografie16,17,22. In recente klinische PET/CT-onderzoeken is aangetoond dat de opname van [18F]-NaF verband houdt met de progressie van vasculaire calcificatie, wat klinisch bewijs levert voor het gebruik van [18F]-NaF voor het detecteren van gebieden met biologisch actieve calcificatie18–20. De waarnemingen in deze studie zijn in lijn met deze eerdere bevindingen op het gebied van vasculaire beeldvorming. Een goede correlatie tussen [18F]-NaF opname en de histologisch bewezen microcalcificaties werd aangetoond, terwijl de correlatie met geconsolideerde calcificaties duidelijk zwakker was.

Zoals vermeld, werd co-lokalisatie tussen [18F]-NaF-opname en Alizarinerood-positieve microcalcificaties geïdentificeerd, terwijl [18F]-NaF-opnamegebieden niet co-lokaliseren met Von Kossa-kleuring van geconsolideerde calcificaties. Deze verkalkte gebieden, met geconsolideerde verkalkingen en geen overeenkomstige [18F]-NaF-opname, kunnen worden beschouwd als gebieden met inactieve verkalking, waar er geen lopend proces van mineralisatie is, zoals eerder beschreven door Irkle et al. in een ex-vivo-studie van carotiscalcificatie16. Hoewel alleen gevalideerd voor vasculaire calcificaties en niet voornierparenchymverkalkingen, wordt het ondersteund door de bindingseigenschappen van [18F]-NaF aan het buitenoppervlak van verkalkingen en beperkte penetratie in vaste verkalkingen. Daarom zal de opname van [18F]-NaF hoger zijn in microcalcificaties, met een groot oppervlak, in vergelijking met microcalcificaties, met een hoog volume maar een relatief klein oppervlak13,16.

Deze proof of concept-studie heeft ook enkele beperkingen. Ten eerste vertegenwoordigen de resultaten, inherent aan het onderzoeksontwerp, een enkel tijdstip, zonder klinische follow-up van de progressie van verkalking. Ten tweede bestaat deze proof-of-concept-studie uit een relatief laag aantal niermonsters, aangezien transplantatie na laat transplantatiefalen alleen wordt uitgevoerd op klinische indicatie en de beschikbaarheid van geweigerde donorennierenvoor onderzoeksdoeleinden is beperkt23. Daarom zou een uitgebreide analyse van de etiologie van calciumafzettingen buiten het bestek van dit project moeten worden overwogen. Ten derde wordt de klinische vertaling van de resultaten belemmerd door het gebrek aan kennis over in-vivo [18F]-NaF-distributie in nieren en het effect van niertracerklaring, dwz een lage activiteit van doelwit naar achtergrond zou de visualisatie van calcificaties kunnen beperken. Om dit probleem aan te pakken, moet het optimale moment van [18F]-NaF PET-beeldvorming worden bepaald, dat wil zeggen waarop [18F]-NaF echt wordt uitgescheiden en de resterende activiteit afkomstig is van binding aan verkalkte gebieden. Mogelijk kan dit worden bereikt met een vertraagde beeldvorming van meer dan drie uur, zoals uitgevoerd voor de beoordeling van coronaire calcificaties24. De verminderde glomerulaire filtratiesnelheid die wordt gevonden bij ontvangers van een transplantaat kan resulteren in een verlengde excretiefase, waardoor een langere periode tussen tracerinjectie en PET-beeldvorming nodig is, maar de huidige richtlijnen wijzen niet op mogelijke nefrotoxiciteit van de [18F]-NaF-tracer11,25. Een mogelijke stap tussen de hier gepresenteerde proof of concept-studie en in-vivo beeldvorming kan ex-vivo [18F]-NaF PET-beeldvorming van normotherme geperfuseerde nieren of in-vivo [18F]-NaF microPET-dierstudies zijn26,27. Ten vierde kan de klinische toepassing van deze techniek worden gehinderd door de kosten voor het uitvoeren van een [18F]-NaF PET/CT-procedure en de inherente stralingsblootstelling. De nieuwe digitale PET-camerasystemen met een hogere gevoeligheid kunnen beide echter verminderen, vanwege een kortere scantijd en een lagere geïnjecteerde activiteitsdosis.

De kracht van deze proof-of-concept-studie ligt in de gedetailleerde één-op-één vergelijking van microcalcificaties geïdentificeerd door [18F]-NaF autoradiografie en histologie. De [18F]-NaF-opname in verschillende monsters kon worden vergeleken zonder dat verdere aanpassingen nodig waren, aangezien alle monsters in dezelfde [18F]-NaF-oplossing werden geïncubeerd. Bovendien levert deze studie de eerste gegevens op die een visuele en statistische overeenkomst aantonen tussen [18F]-NaF-opname en histologisch bewezen microcalcificaties in niermonsters.

Cistanche-nierfunctie

Tot slot bieden we de eerste gegevens voor het gebruik van [18F]-NaF in een autoradiografieonderzoek om microcalcificaties in actievenefrocalcinosenaniertransplantatie. Deze ex-vivo [18F]-NaF proof of concept studie is de eerste stap naar de mogelijke toepassing van klinische [18F]-NaF PET/CT bij niertransplantatiepatiënten.

Methoden:

Menselijkniermonsters.

Nierweefsel werd verkregen na transplantatie (n=13) en van afgedankte nieren van overleden donoren (n=7) in geval van achteruitgang van de nier van de donor door aangesloten transplantatiecentra. Klinische gegevens van ontvangers en donoren van niertransplantaties werden opgehaald uit de medische dossiers van de patiënten, waaronder de aanwezigheid van hyperparathyreoïdie, hyperfosfatemie en diabetes mellitus voorafgaand aan transplantatie, en klinische pathologiebeoordeling van niertransplantaatmonsters gerapporteerd met behulp van de Banf Classification of Renal Allograft Pathology28. Onderzoeksactiviteiten werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki Ethische principes voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen en de Institutionele beoordelingsraad gaf goedkeuring voor deze studie (Medisch Ethische Commissie Universitair Medisch Centrum Groningen 2015/501). Er werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle ontvangers van een transplantatie en goedkeuring voorafgaand aan de donatie werd gegeven voor het gebruik van afgedankte nieren van overleden donoren voor onderzoeksdoeleinden. De klinische en onderzoeksactiviteiten waren in overeenstemming met de Principes van de Verklaring van Istanbul zoals uiteengezet in de 'Verklaring van Istanbul inzake Orgaanhandel en Transplantatietoerisme.

De Standard Operating Procedure (SOP) voor weefselafname was als volgt: Monsters werden verkregen in de operatiekamer, onmiddellijk na nierextractie (voor transplantectomie), of bij aankomst van de afgedankte donornierin ons transplantatiecentrum. De monsters die voor dit experiment werden gebruikt, werden genomen in het transversale vlak van de bovenste pool, inclusief corticale en medullair nierweefsel, met een grootte tussen 25 mm x 15 mm en 20 mm x 40 mm. Deze monsters waren in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed. Met behulp van een microtoom precisie snij-instrument werden drie µm paraffine-ingebedde coupes gemaakt. Deze secties werden gemonteerd op adhesiemicroscoopglas (TOMO, Matsunami Glass, VS). Seriële secties, dwz aangrenzende secties die opeenvolgende lagen van denierweefselmonsters, werden gebruikt voor autoradiografie en histologische analyse. Voorafgaand aan tracerincubatie en histologische kleuring werden coupes gedeparafniseerd, gerehydrateerd in gedemineraliseerd water en tijdelijk opgeslagen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

[18F]‑NaF incubatie en autoradiografie.

Het ex-vivo-experiment was gebaseerd op het protocol dat in de eerdere onderzoeken van Hop et al. werd gebruikt. en Reijrink et al. 22,29. De eerste studie is een autoradiografische studie naar de opname van [18F]-NaF in carotisplaques van patiënten met een beroerte die een operatie ondergaan, met CT-gebaseerde indicatie van verkalking als vergelijking. Het tweede onderzoek is een autoradiografieonderzoek naar [18F]-FDG-opname in vetweefselmonsters, met immunohistochemie van seriële coupes als vergelijking. Een van elke drie seriële secties werd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur gebaad in een oplossing van [18F]-NaF, in een concentratie van 618 millibecquerel (MBq) in 300 ml PBS. Het wassen werd uitgevoerd door driemaal te spoelen met koud PBS en tweemaal met koud water. Monsters werden in de open lucht gedroogd en een blanco fosforscherm werd over de monsters geplaatst. Blootstelling werd gedurende de nacht uitgevoerd, gedurende een periode van 24 uur en 30 minuten. Het bepalen van de verdeling en intensiteit van weefselactiviteit werd uitgevoerd op een fosforscherm met behulp van de Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, VS).

Alizarine rood en von Kossa kleuring.

Alizarineroodkleuring werd uitgevoerd om calciumaccumulatie in een vroeg stadium van verkalking zichtbaar te maken. Monsters werden gedurende 5 minuten 30 geïncubeerd in 2 procent w/v alizarinerood (opgelost in gedemineraliseerd water), pH 4,2. Het wassen werd uitgevoerd door 20 keer spoelen in 1:1 aceton/xyleen en 20 keer spoelen in 100 procent xyleen. Von Kossa-kleuring werd uitgevoerd om de aanwezigheid van anorganische fosfaatmoleculen in geconsolideerde calcificaties zichtbaar te maken. In het kort werden monsters gedurende 1 uur geïncubeerd in 1 procent zilvernitraat (AgNO3) -oplossing, terwijl ze werden blootgesteld aan zonlicht . Afgewisseld door driemaal spoelen in gedemineraliseerd water, werd incubatie uitgevoerd met natriumthiosulfaat gedurende 5 minuten, gevolgd door incubatie in nucleair snel rood gedurende 3 minuten.

Beeldverwerking en analyses.

Gekleurde weefselcoupes werden gedigitaliseerd met de Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) en beelden werden geïnspecteerd met behulp van Aperio ImageScope-softwareversie 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Duitsland). Autoradiografie en kwantitatieve geautomatiseerde beeldanalyses werden uitgevoerd met ImageJ-software, versie 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, //fji.sc).

Achtergrondaftrekking werd toegepast voor alle histologiebeelden, waarbij een omtrek aan de rand van het histologiemonster werd ingevoegd. Semi-geautomatiseerde detectie van calcificaties in de Alizarin-rood en Von Kossa-kleuring werd uitgevoerd met de ImageJ-BioVoxxel Toolbox31. Er werden drempels toegepast voor alle monsters en gedetecteerde verkalkingsgebieden werden verwijd met 6 iteraties om de visualisatie te optimaliseren. Voor de autoradiografiebeelden werden rotatie en re-sizing uitgevoerd op basis van de originele histologiemonsters. Drempels werden toegepast voor alle monsters, resulterend in gebieden met traceropname, volgens de benadering beschreven door Irkle et al.: afbeeldingen werden gedrempeld met behulp van de Otsu-methode, gevolgd door Gaussiaanse vervaging en drempelwaarde met de Li-methode . Overlay-afbeeldingen werden verkregen door de contouren van de aangrenzende histologiebeelden te matchen, met de daaropvolgende matching van de histologie- en autoradiografieresultaten (Fig. 1). Op pixels gebaseerde kwantificering van verkalking en tracergebied (als percentage van het monstergebied) werd uitgevoerd met de ImageJ-Analyze Particles-tool.

Cistanche-nierziekte symptomen

Statistische analyse.

Statistieken werden uitgevoerd met het Statistical Package for the Social Sciences versie 23 (IBM Corporation, Armonk NY, VS), grafieken werden gemaakt met GraphPad Prism 7.02 voor Windows (Graph Pad Software, San Diego, VS) en cijfers werden geproduceerd met Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San José, VS). De resultaten werden gepresenteerd als de mediaan en interkwartielafstand (IQR) voor scheve gegevens, en als frequentie en percentage wanneer de gegevens categorisch waren. We vergeleken groepen met behulp van Mann-Whitney U-tests (tweezijdige p-waarde<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Beschikbaarheid van data

Overleden donornier ennierautoradiografiebeelden van de ontvanger van een transplantaat van [18F]-natriumfluoride ([18F]-NaF) opname, met de overlay-beelden van [18F]-NaF-opname met Alizarin-roodkleuring van microcalcificaties en Von Kossa-kleuring van calcificaties zijn online beschikbaar als aanvullende informatie. Alle aanvullende gegevens worden op verzoek ter beschikking gesteld, in lijn met het IRB-reglement van het Universitair Medisch Centrum Groningen.

Referenties

1. Gwinner, W. et al. Vroege verkalking van niertransplantaten gedetecteerd door protocolbiopten: oorzaken en klinische implicaties. Ben. J. Transplantatie. 5, 1934-1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Wat is?nefrocalcinose?. Nier Int. 88, 35-43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontin beschermt tegen hoge fosfaat-geïnduceerdenefrocalcinoseen vasculaire calcificatie. Nier Int. 89, 1027-1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. De vroege aanwezigheid van calciumoxalaatafzetting inniertransplantaatbiopten worden geassocieerd met een slechte overleving van het transplantaat op de lange termijn. Ben. J. Transplantatie. 5, 323-329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Lokalisatie, etiologie en impact van calciumfosfaatafzettingen in niertransplantaten. Ben. J. Transplantatie. 9, 2470-2478 (2009).

6. Nankivell, BJ et al. Het natuurlijke beloop van chronische allograft-nefropathie. N. Engl. J. Med. 349, 2326-2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Risicofactoren voor chronische allograft-nefropathie na niertransplantatie: een protocolbiopsiestudie. Nier Int.67, 341-348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Oxalaatafzettingen in biopsieën van inheemse en getransplanteerde nieren en impact op de transplantaatfunctie. Nefrol. Kies. Transplantatie. 24, 1319-1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Oxalaatafzetting in niertransplantaatbiopten binnen 3 maanden na transplantatie is geassocieerd met allotransplantaatdisfunctie. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Zijn we beeldvorming voor en na niertransplantatie vergeten?. EUR. Radiol. 28, 3263-3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: EANM-procedurerichtlijnen voor botbeeldvorming. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Beeldvorming 42, 1767-1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Coronaire arteriële opname van 18F-natriumfluoride. J. Ben. Coll. Cardiolen. 59, 1539-1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. De opname van 18F-natriumfluoride is een marker van actieve verkalking en ziekteprogressie bij patiënten met aortastenose. Circa. Cardiovasculair. Beeldvorming 7, 371-378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Haalbaarheid van 18F-natriumfluoride PET/CT voor beeldvorming van atherosclerotische plaque. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Doelidentificatie voor de diagnose en interventie van kwetsbare atherosclerotische plaques voorbij 18F-fluorodeoxyglucose-positronemissietomografiebeeldvorming: veelbelovende tracers aan de horizon. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Beeldvorming 46, 251-265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Identificatie van actieve vasculaire microcalcificatie door 18F-natriumfluoride-positronemissietomografie. nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. 18 F-fluoride signaalversterking identificeert microcalcificaties geassocieerd met atherosclerotische plaque-instabiliteit in positronemissietomografie/computertomografiebeelden. Circa. Cardiovasculair. Beeldvorming 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Vasculaire opname op 18F-natriumfluoride-positronemissietomografie: voorloper van vasculaire calcificatie? J. Nucl. Cardiolen. (2020).

19. Derlin, T. et al. Correlatie van ontsteking beoordeeld door 18F-FDG PET, actieve minerale afzetting beoordeeld door 18F-fluoride PET en vasculaire calcificatie in atherosclerotische plaque: een dual-tracer PET/CT-onderzoek. J. Nucl. Med. 52, 1020-1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. Voorspellende waarde van 18F-natriumfluoride-positronemissietomografie bij het detecteren van hoogrisico coronaire hartziekte in combinatie met computertomografie. J. Ben. Hart Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Endogene calcificatieremmers bij de preventie van vasculaire calcificatie: een consensusverklaring van de COST-actie EuroSofCalcNet. Voorkant. Cardiovasculair. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. 18F-natriumfluoride-positronemissietomografie beoordeelde microcalcificaties in schuldige en niet-veroorzakers van menselijke halsslagaderplaques. J. Nucl. Cardiolen. 26, 1064-1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrectomie na transplantatiefalen: huidige praktijk en resultaten. Ben. J. Transplantatie. 7, 1961-1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Drie uur vertraagde beeldvorming verbetert de beoordeling van coronaire 18F-natriumfluoride-PET. J. Nucl. Med. 60, 530-535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Position paper van het Cardiovascular Committee van de European Association of Nuclear Medicine (EANM) over PET-beeldvorming van atherosclerose. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Beeldvorming 43, 780-792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. Nieren van DCD-varkens geanalyseerd met MRI om ex vivo hun levensvatbaarheid te beoordelen. Transplantatie 97, 148-153 (2014).

27. Pool, M. et al. Mesenchymale stromale cellen inbrengen in varkensnierentijdens normothermische machinale perfusie: intacte MSC's kunnen worden getraceerd en gelokaliseerd tot glomeruli. Int. J. Mol. Wetenschap. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. Een referentiegids uit 2018 voor de Banf-classificatie van niertransplantaatpathologie. Transplantatie 102, 1795-1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F]FDG-opname in vetweefsel is niet gerelateerd aan ontsteking bij type 2 diabetes mellitus. Mol. Beeldvorming Biol.23, 117-126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. Vasculaire calcificatie en aortafibrose een bifunctionele rol voor osteopontine bij diabetische arteriosclerose. Arter. TrombVascBiol 31, 1821-1833 (2011).

31. Brocher, J. Kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van twee nieuwe histogrambeperkende binarisatie-algoritmen. Int. J. Beeldproces. 8, 30-48 (2014).

Dankbetuigingen

Dit onderzoeksproject wordt ondersteund door een subsidie ​​van Stichting De Cock-Hadders (projectcode 2018-03).

Bijdragen van auteurs

SB droeg bij aan het ontwerp, de acquisitie en de analyse en stelde het manuscript op. IFA, MR en MLCB hebben bijgedragen aan het ontwerp, de acquisitie en de analyse en hebben het manuscript inhoudelijk herzien. SPB, CM en MHdB hebben bijgedragen aan de conceptie en hebben het manuscript inhoudelijk herzien. JLH, RHJAS en RAP hebben bijgedragen aan de conceptie, het ontwerp en de analyse en hebben het manuscript inhoudelijk herzien.

Concurrerende belangen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.