Natriumthiosulfaat-aangevulde UW-oplossing beschermt niertransplantaten tegen langdurige koude ischemie-reperfusieverwonding in een muizenmodel van syngene niertransplantatie

Contactpersoon: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Cistanche tubulosa voorkomtnierziekte, klik hier om deproducten en Cistanche Nz

ABSTRACT

Invoering:Koude ischemie-reperfusieschade (IRI) is een onvermijdelijke gebeurtenis die complicaties na de transplantatie verhoogt. We hebben eerder aangetoond dat suppletie van de oplossing van de University of Wisconsin (UW) met niet-FDA-goedgekeurde waterstofsulfide (H2S) donormoleculen koude IRI minimaliseert en de niertransplantaatfunctie na transplantatie verbetert. De huidige studie onderzoekt of een door de FDA goedgekeurd H2S-donormolecuul, natriumthiosulfaat (STS), hetzelfde of een beter effect zal hebben in een klinisch relevant rattenmodel van syngene orthotopeniertransplantatie.

Methode:Dertig Lewis-ratten ondergingen bilaterale nefrectomie gevolgd door syngene orthotope transplantatie van de linkernierna 24-uur bewaren in UW of UW plus STS-oplossing bij 4 ◦C. Ratten werden gevolgd tot dag 14 na transplantatie en opgeofferd om de nierfunctie te beoordelen (urineproductie, serumcreatinine en bloedureumstikstof).Niersecties werden gekleurd met H&E, TUNEL, CD68 en myeloperoxidase (MPO) om acute tubulaire necrose (ATN), apoptose, macrofaaginfiltratie en neutrofiele infiltratie te detecteren.

Resultaat:UW plus STS-transplantaten vertoonden een significant verbeterde transplantaatfunctie onmiddellijk na transplantatie, met verbeterde overleving van de ontvanger in vergelijking met UW-transplantaten (p < {{0}}.05).="" histopathologisch="" onderzoek="" onthulde="" significant="" verminderde="" atn-,="" apoptose-,="" macrofaag-="" en="" neutrofiele="" infiltratie="" en="" neerwaartse="" regulatie="" van="" pro-inflammatoire="" en="" pro-apoptotische="" genen="" in="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" vergeleken="" met="" uw-transplantaten="" (p=""><>

Conclusie:We laten voor de eerste keer zien dat conservering van niertransplantaten in STS-aangevulde UW-oplossing beschermt tegen langdurige koude IRI door apoptotische en ontstekingsroutes te onderdrukken, en daardoor de transplantaatfunctie te verbeteren en de overleving van de ontvanger te verlengen. Dit zou een nieuwe klinisch toepasbare therapeutische strategie kunnen zijn om de nadelige klinische uitkomst van langdurige koude IRI in te minimaliserenniertransplantatie.

trefwoorden:Natriumthiosulfaat (STS) Ischemie-reperfusieschade (IRI) Statische koude opslag (SCS)Niertransplantatie Overleving van transplantaat en ontvanger

1. Inleiding

Niertransplantatie is de optimale behandeling voor eindstadiumniernierziekte (ESRD). In vergelijking met dialyse,niertransplantatie is superieur, omdat het een betere kwaliteit van leven biedt en een aanzienlijk overlevingsvoordeel oplevert, samen met de kosteneffectiviteit [1-3]. Het verkrijgen van donornieren is echter inherent geassocieerd met ischemie-reperfusieschade (IRI), een onvermijdelijk gevolg van de stopzetting en het daaropvolgende herstel van de bloedstroom tijdens transplantatie [4]. De huidige strategie om transplantatie-geïnduceerde IRI te verminderen, is statische koude opslag (SCS) van niertransplantaten in standaard conserveringsoplossingen zoals de University of Wisconsin (UW)-oplossing op het ijs bij 4 ◦C tijdens de pre-transplantatieperiode [5]. Er is echter aangetoond dat langdurige SCS geassocieerd is met verhoogde celdood, ontsteking en andere schadelijke cellulaire en moleculaire gebeurtenissen, wat uiteindelijk resulteert in een verhoogde incidentie van vertraagde transplantaatfunctie (DGF), acute tubulaire necrose (ATN) en verminderde transplantaatfunctie. overleving [6-10]. Om gelijke tred te houden met de wereldwijd stijgende incidentie van ESRD en een steeds groter aantal patiënten op wachtlijsten voor transplantatie, accepteren veel transplantatiecentra bovendien niertransplantaten met langdurige koude ischemische perioden, wat verder bijdraagt ​​aan de algehele weefselbeschadiging. Na SCS volgt reperfusie, wanneer warm zuurstofrijk bloed wordt hersteld in het koude ischemische transplantaat. Reperfusie, de effectorfase van ischemische schade, wordt gekenmerkt door toegenomen weefselbeschadiging [11–13].

Een mogelijke therapeutische strategie om koude IRI te beperken tijdensniertransplantatie omvat suppletie van standaard conserveringsoplossing met waterstofsulfide (H2S), een endogeen geproduceerde gasotransmitter waarvan is aangetoond dat het een belangrijke fysiologische rol speelt bij vasodilatatie en cellulaire signalering [14-16]. We hebben eerder aangetoond dat langdurige SCS in H2S-aangevulde UW-oplossing de door transplantatie geïnduceerde koude IRI vermindert en de transplantaatoverleving verbetert in muizenmodellen van syngene en allogene niertransplantatie [17-19,41, 42]. De H2S-donormoleculen die in deze onderzoeken worden gebruikt, zijn echter niet klinisch levensvatbaar. Dit heeft geleid tot de overweging om natriumthiosulfaat (STS) te gebruiken, een H2S-donorgeneesmiddel dat is goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) voor de behandeling van calciphylaxis bij ESRD-patiënten, door cisplatine geïnduceerde toxiciteit bij kankertherapie en als tegengif voor cyanidevergiftiging [20–23]. Recente studies hebben aangetoond dat STS beschermende effecten vertoont in diermodellen van IRI [24–26]. Het effect op door transplantatie geïnduceerde koude renale IRI is echter niet bekend. Daarom onderzoekt de huidige studie de renoprotectieve effecten van STS in een in vitro model van renale IRI en ratmodel van syngene orthotope niertransplantatie.

2. materialen en methoden

2.1. Experimenteel in vitro protocol

Een in vitro model van koude hypoxie en warm reoxygenatieletsel dat cellulaire omstandigheden nabootst tijdens in vivo koude IRI werd gebruikt om de beschermende effecten van STS tijdens nier-IRI te beoordelen. Epitheelcellen van rattennieren (NRK{{0}}E-cellijn; ATCC, VS) werden gebruikt in de in vitro-experimenten omdat deze cellen vatbaar zijn voor ischemische schade [27] en hun gebruik consistent is met de rat transplantatiemodel gebruikt voor het tweede doel van deze studie. De cellen werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10 procent foetaal runderserum (FBS) bevat, geïnactiveerd door hitte bij 60 ◦C gedurende 20 minuten en 1% penicilline/streptomycine (P/S). Cellen werden geïncubeerd bij normale groeiomstandigheden van 37 ° C, 21 procent O2 en 5 procent CO2. Controlecellen bevonden zich in omstandigheden die identiek waren aan die voor pre-experimentele cellen. Experimentele cellen werden behandeld met ofwel serumvrije media (SF), SF plus 200 nM AP39, of SF met variërende concentraties (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) natriumthiosulfaatpentahydraat (STS), die werden verkregen uit een 250 mg/ml injecteerbare oplossing van STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). Een concentratie van 200 nM AP39 werd gebruikt omdat we eerder hebben aangetoond dat AP39 bij deze concentratie cytoprotectief is tegen dezelfde cellijn in een vergelijkbaar model van koude IRI [20]. Cellen werden vervolgens 24 uur bij 10 ◦C geïncubeerd onder hypoxische omstandigheden (5 procent CO2, 0,5 procent O2, 95 procent N2) in HypOxystation H85 hypoxiekamer (HYPO2YGEN, VS) om koude ischemische schade te veroorzaken. Er werd een onderkoelingstemperatuur van 10 ◦C gebruikt omdat dit de laagste temperatuur was die technologisch kon worden bereikt met behoud van een O2-niveau van 0,5 procent hypoxie. Na hypoxie werden de media die experimentele cellen bevatten vervangen door controlemedia, en de cellen werden opnieuw geoxygeneerd via incubatie onder normale groeiomstandigheden (37 ◦C, 21 procent O2 en 5 procent CO2) gedurende 24 uur om reperfusie en de bijbehorende verwonding te simuleren. Na 24 uur reoxygenatie werd de cellulaire levensvatbaarheid beoordeeld via kleuring van cellen met FITC-geconjugeerde Annexin-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, VS) en 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, VS ), die respectievelijk cellulaire apoptose en necrose meet. Cellen werden geanalyseerd via flowcytometrie met behulp van de CytoFLEX S (Beckman Coulter, VS). FlowJo versie 11 (FlowJo LLC, VS) werd gebruikt om de gegevens op de juiste manier te poorten voor statistische analyse.

2.2. proefdieren

Dertig mannelijke Lewis-ratten met een gewicht van 275-300 g en gekocht bij Charles River (St. Constant, QC, Canada) werden onder standaardomstandigheden gehuisvest in de Animal Care and Veterinary Services-faciliteit van de Western University (Londen, ON). Dierstudies werden goedgekeurd door de Western University Council on Animal Care and Animal Use met een protocol-ID 2018-155.

2.3. Niertransplantatiemodel

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 procent gewichtsverlies) of overlijden. Humane eindpunten werden tweemaal per dag gecontroleerd en alle ratten werden geëuthanaseerd door blootstelling aan CO2 in een kamer met een stroomsnelheid van 40 procent. Op het moment van euthanasie waren er geen chirurgische complicaties die tot variaties in de resultaten hadden kunnen leiden.

2.4. Analyse van de nierfunctie

Na niertransplantatie werden ratten gedurende 14 dagen in metabole kooien gevolgd en vervolgens opgeofferd. Bloed- en urinemonsters werden verzameld op POD 3, 5, 7, 10 en 14 om parameters van de nierfunctie te bepalen (serumcreatinine, bloedureumstikstof [BUN], urine-osmolaliteit en urineproductie). BUN en serumcreatinine waren afkomstig van ontvangers van niertransplantaties en Sham-geopereerde ratten werden gemeten met behulp van de IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer-machine (Markham, ON). Urine-osmolaliteitsniveaus werden bepaald door middel van vriespunt-osmometrie met behulp van de 3320 Osmometer-machine (Advanced Instruments, Norwood, MA) en vergeleken met door het bedrijf verstrekte normen.

2.5. Histopathologische en morfometrische analyse

In paraffine ingebedde nierweefsels werden in 4 µm dikke secties gesneden en voor histologie op microscopische objectglaasjes gemonteerd. De coupes werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E), terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) om respectievelijk de mate van ATN en apoptose te bepalen. H&E-secties kregen een score voor ATN toegewezen door een geblindeerde nierpatholoog volgens het volgende schema: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 procent ent ATN. Niercoupes werden ook gekleurd met de volgende primaire antilichamen: nierbeschadigingsmarker (KIM-1), macrofaagoppervlaktemarker CD68 en neutrofiel-specifiek enzym myeloperoxidase (MPO; Abcam®, Toronto, Canada) en gevisualiseerd met secundaire antilichamen en DAB-substraatchromogeen met behulp van het Dako Envision-systeem (Dako, Glostrup, Denemarken) volgens het protocol van de fabrikant, gevolgd door geanalyseerd onder Eclipse 90i digitale lichtmicroscoop (Nikon® Instruments, New York) bij een vergroting van 10x en gekwantificeerd met ImageJ-software v. 1.8 (Nationaal Institutes of Health, Bethesda, MD).

2.6. Kwantitatieve PCR-analyse

Totaal RNA werd geïsoleerd uit niertransplantaatweefsels verkregen bij POD 3 met behulp van RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Canada) en omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van OneScript® Plus cDNA-synthesekit (ABM, Canada) in combinatie met oligo(dT)12– 18 primers volgens het protocol van de fabrikant. Geïsoleerd RNA en cDNA werden vóór gebruik geanalyseerd via nanodrop (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Canada), met A260/280-beoordelingen consistent respectievelijk > 1,95 en > 1,8. Het reactiemengsel van elk qPCR-monster had een volume van 20 µL en werd gemaakt volgens het Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix-protocol (ABM, Canada) en geanalyseerd met behulp van een CFX Connect Real-Time PCR Detection System-machine (Bio-Rad, Canada) . Primersequenties werden ontworpen met behulp van Primer-BLAST-software (NCBI) tegen bèta-actine, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), interferon-gamma (IFN-), tumornecrosefactor-alfa (TNF-), interleukine 6 (IL -6), B-cellymfoom 2 (Bcl-2), Bcl-2--geassocieerd X-eiwit (BAX), caspase 3, BH3-interagerende domein-doodagonist (BID), c-Jun N-terminaal kinase 1/2 (JNK1/2), Pparg-coactivator 1 alfa (PGC-1), mitochondriacomplex I (NDUFB8), mitochondriacomplex II (SDHB), mitogeen-geactiveerd proteïnekinase 1/2 (ERK1 /2), neutrofiel gelatinase lipocaline (NGAL) en genen voor nierbeschadigingsmolecuul -1 (KIM-1). Alle genen van belang waren genormaliseerd tegen bèta-actine. Vouwveranderingen van genexpressie werden vergeleken met Sham-geopereerde ratten en werden berekend met behulp van de ΔΔCt-methode.

2.7. statistische analyse

Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met het GraphPad (La Jolla, CA) Prism statistische softwarepakket, versie 9.0. Overlevingsgegevens werden geanalyseerd met behulp van Kaplan-Meier-overlevingsanalyse en log rank-test, terwijl qPCR-genexpressiegegevens werden geanalyseerd met behulp van ongepaarde eenrichtings-t-test. Alle andere gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door Tukey's post-hoctest om statistische verschillen tussen groepen te bepalen. Statistische significantie werd geaccepteerd op p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Resultaten

3.1. STS-aangevuld serumvrij medium verbetert de overleving van niertubulaire epitheelcellen tijdens koude hypoxie/reoxygenatie

Flowcytometrie-analyse na kleuring op apoptose en necrose toonde aan dat NRK{{0}}E-cellen behandeld met SF tijdens in vitro koude IRI een significant verminderde levensvatbaarheid van de cellen vertoonden in vergelijking met controle (normoxische) cellen (Fig. 1A; p < 0.05).="" hoewel="" alle="" experimentele="" monsters="" een="" significant="" lagere="" levensvatbaarheid="" van="" de="" tubulaire="" epitheelcellen="" van="" de="" nier="" vertoonden="" dan="" cellen="" die="" waren="" gekweekt="" onder="" normoxische="" omstandigheden="" (p="">< 0,05),="" vertoonden="" cellen="" die="" waren="" behandeld="" met="" sf="" aangevuld="" met="" 150="" µm="" en="" 500="" µm="" sts="" een="" significant="" hogere="" levensvatbaarheid="" dan="" die="" behandeld="" met="" alleen="" sf-media="" (fig.="" 1a;="" p=""><0,05), wat="" overeenkwam="" met="" duidelijk="" verminderde="" apoptose="" in="" vergelijking="" met="" cellen="" die="" alleen="" met="" sf-media="" werden="" behandeld="" (fig.="" 1b;="" p=""><0,05). bovendien="" lijkt="" de="" toename="" in="" cellevensvatbaarheid="" en="" afname="" in="" apoptose="" optimale="" niveaus="" te="" bereiken="" met="" 150="" m="" en="" 500="" µm="" sts,="" aangezien="" een="" hogere="" dosis="" deze="" trends="" omkeerde="" (fig.="" 1a="" en="">

3.2. Suppletie van UW-oplossing met STS verbetert vroege overleving en functie van niertransplantaten

Behoud van niertransplantaten in STS-aangevulde UW-oplossing verbeterde de overleving van de ontvanger significant met 83 procent overleving tot POD 14 (dag van opoffering) in vergelijking met de controlegroep zonder STS-suppletie, die 12,5% overleving liet zien, vooral in de eerste 3 dagen (Fig. 2A; p < 0.05).="" bovendien="" verbeterde="" sts-suppletie="" de="" transplantaatfunctie="" aanzienlijk="" tijdens="" de="" vroege="" post-transplantatieperiode="" in="" vergelijking="" met="" alleen="" uw-behandeling.="" serumcreatinine-="" en="" bun-spiegels="" waren="" significant="" verhoogd="" in="" zowel="" uw-="" als="" uw="" plus="" sts-groepen="" op="" pod="" 3,="" wat="" correleerde="" met="" verminderde="" urine-osmolaliteit="" in="" vergelijking="" met="" sham="" (fig.="" 2b,="" c="" en="" 3a;="" p=""><0.{{25 }}5).="" de="" serumcreatinine-="" en="" bun-spiegels="" in="" de="" uw="" plus="" sts-groep="" namen="" echter="" significant="" af="" op="" pod="" 3="" met="" een="" overeenkomstige="" toename="" van="" de="" urine-osmolaliteit="" in="" vergelijking="" met="" de="" uw-groep="" (fig.="" 2b,="" c="" en="" 3a;="" p=""><0,05). interessant="" is="" dat="" de="" niveaus="" van="" serumcreatinine="" en="" bun="" in="" de="" uw="" plus="" sts-groep="" gestaag="" daalden="" van="" pod="" 3="" tot="" pod="" 14="" met="" verhoogde="" urine-osmolaliteit="" en="" vergelijkbaar="" waren="" met="" die="" van="" sham="" (fig.="" 2b,="" c="" en="" 3a).="" ook="" was="" de="" urineproductie="" in="" de="" uw="" plus="" sts-groep="" significant="" hoger="" tijdens="" de="" eerste="" vier="" postoperatieve="" dagen="" in="" vergelijking="" met="" uw-="" en="" sham-groepen="" (fig.="" 3b;="" p=""><0,05). het="" nam="" echter="" gestaag="" af="" naar="" de="" basislijnwaarde="" (sham)="" en="" was="" vergelijkbaar="" met="" die="" van="" sham="" op="" pod="" 14,="" terwijl="" de="" urineproductie="" bij="" de="" overlevende="" rat="" in="" de="" uw-groep="" hoger="" bleef="" dan="" de="" basislijnwaarde="" op="" pod="" 14="" (fig.="">

3.3. Toevoeging van STS aan UW-oplossing vermindert transplantatie-geïnduceerde celdood na niertransplantatie

Niercoupes verkregen op POD 3 en 14 werden gekleurd met TUNEL als een maat voor apoptotische celdood en gescoord door een geblindeerde nierpatholoog (Fig. 4A). Niertransplantaten van de UW-groep vertoonden significant hogere apoptotische celdood op POD 3, zoals aangegeven door een hogere TUNNEL-score in vergelijking met nieren van UW plus STS- en Sham-groepen (Fig. 5A en b; p <0.{{11} }5).="" transplantaten="" van="" de="" uw="" plus="" sts-groep="" waren="" niet="" significant="" verschillend="" in="" vergelijking="" met="" die="" van="" sham="" op="" hetzelfde="" tijdstip="" en="" op="" pod="" 14="" (fig.="" 4b).="" bovendien,="" terwijl="" transplantaten="" van="" zowel="" uw="" als="" uw="" plus="" sts-groepen="" significant="" verhoogde="" atn-scores="" vertoonden="" op="" pod="" 3="" in="" vergelijking="" met="" de="" sham-groep="" (fig.="" 5;="" p=""><0.05), uw="" plus="" sts-transplantaten="" vertoonde="" verlaagde="" atn-scores="" op="" pod="" 3="" in="" vergelijking="" met="" uw="" (fig.="" 5;="" p=""><0,05). ook,="" terwijl="" ontvangers="" van="" uw-transplantaten="" niet="" overleefden="" tot="" pod="" 14,="" en="" hun="" atn-scores="" daarom="" niet="" konden="" worden="" bepaald="" op="" pod="" 14,="" overleefden="" die="" van="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" tot="" pod="" 14,="" maar="" vertoonden="" significant="" verhoogde="" atn-scores="" in="" vergelijking="" met="" de="" sham-groep="" (fig.="" 5;="" p=""><>

3.4. Niertransplantaten geconserveerd in STS-aangevulde UW-oplossing vertoonden verminderde verwondingsmarkers en ontstekingsinfiltraat na niertransplantatie

Niercoupes verkregen op POD 3 en 14 werden gekleurd met KIM-1 om proximale tubulaire schade te detecteren, evenals CD68 (macrofaagmarker) en MPO (neutrofielmarker) en beoordeeld door een geblindeerde nierpatholoog (Fig. 6A, 7A, en C). Expressie in nierweefsel van KIM-1, CD68 en MPO was significant hoger in de UW-groep op POD 3 vergeleken met die van UW plus STS- en Sham-groepen (Fig. 6B, 7B en D; p <{{11} }.05)="" terwijl="" de="" expressie="" van="" deze="" markers="" in="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" niet="" significant="" verschilde="" van="" sham="" op="" pod="" 14="" (fig.="" 6b,="" 7b="" en="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. STS-suppletie aan UW-oplossing onderdrukte renale expressie van pro-inflammatoire, pro-apoptotische en mitochondriale genen

Genexpressie van pro-inflammatoire, pro-apoptotische, mitochondria-gerichte en nierbeschadigingsmarkers werden bepaald via qRT-PCR in getransplanteerde nieren verkregen op POD 3. Expressie van de pro-inflammatoire genen IFN-, TNF- en IL{{8 }} waren aanzienlijk verhoogd in UW-transplantaten ten opzichte van UW plus STS-transplantaten op POD 3 (Fig. 8A; p <0.05) en="" volgden="" hetzelfde="" patroon="" met="" pro-apoptotische="" genen="" parp,="" bax="" ,="" caspases-3,="" bid,="" jnk1="" en="" jnk2="" (fig.="" 8a;="" p=""><0.05) terwijl="" de="" expressie="" van="" anti-apoptotisch="" bcl-2="" iets="" verhoogd="" was="" in="" uw="" plus="" sts-groep="" vergeleken="" met="" uw-groep,="" hoewel="" deze="" toename="" geen="" statistische="" significantie="" bereikte="" (fig.="" 8a).="" bovendien="" was="" de="" expressie="" van="" mitochondriale="" genen="" pgc-1,="" ndufb8="" (complex="" i)="" en="" sdhb="" (complex="" ii)="" in="" uw-transplantaten="" significant="" verminderd="" in="" vergelijking="" met="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" (fig.="" 8b;="" p=""><0 .05)="" terwijl="" het="" omgekeerde="" werd="" waargenomen="" met="" erk1-="" en="" erk2-expressies="" (fig.="" 8b;="" p=""><0,05). bovendien="" was="" de="" kim-1-genexpressie="" in="" uw-transplantaten="" significant="" verhoogd="" in="" vergelijking="" met="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" (fig.="" 8c;="" p=""><0,05), terwijl="" verminderde="" ngal-expressie="" in="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" geen="" statistische="" significantie="" bereikte="" in="" vergelijking="" met="" die="" in="" uw-transplantaten="" (fig.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Discussie

Deze studie stelt suppletie vast van standaard conserveringsoplossing met STS, een klinisch levensvatbare, door de FDA goedgekeurde H2S-donor, om door transplantatie geïnduceerde koude nier-IRI te verminderen, de kwaliteit van het transplantaat te verbeteren en de overleving van de ontvanger te verlengen. Met behulp van een in vitro model van renale IRI en ratmodel van syngene orthotope niertransplantatie, demonstreren we voor de eerste keer dat suppletie van UW-oplossing met STS tijdens langdurige SCS voor- en orgaanbeschermend is.

De primaire bevinding in ons in vitro-model is dat STS-suppletie aan serumvrije media de nierepitheelcellen beschermt tegen koude hypoxie en warme reoxygenatie-geïnduceerde apoptose en de levensvatbaarheid verhoogt, wat consistent is met onze eerdere studie waarin we de beschermende effecten van de mitochondriën aantoonden - gericht op H2S-donorgeneesmiddel, AP39, in een in vitro model van koude nier-IRI [20]. Interessant is dat een hogere STS-concentratie van 1 mM de gunstige effecten omkeerde, wat impliceert dat STS een bifasisch dosis-responsfenomeen vertoont dat hormesis wordt genoemd, waarbij een lagere concentratie cytoprotectief is, terwijl een hogere concentratie cytotoxisch is. Mitochondriale schade is een belangrijk gevolg van renale IRI, aangezien mitochondriale permeabiliteit de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) kan remmen en de vorming van reactieve zuurstofspecies (ROS), een destructieve mediator van weefselbeschadiging [13] kan verhogen. Onlangs is gesuggereerd dat mitochondriën een primaire plaats van STS-activiteit zijn. Van STS is niet alleen bekend dat het H2S genereert in de mitochondriën via glutathionafhankelijke reductie en vice versa via de sulfide-oxidatieroute, maar het behoudt ook de mitochondriale ATP-synthese, vermindert de ROS-productie en verbetert de complexe enzymactiviteiten in de elektronentransportketen (ETC) [24] ,28-30]. Bovendien toonden recente studies aan dat STS de expressie van PGC-1 significant verhoogde, een positieve regulator van mitochondriale biogenese en ATP-productie [26], wat in overeenstemming is met onze in vivo observatie. Deze moleculaire mechanismen zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor de significant verhoogde expressie van mitochondriale ETC-complexen I en II (respectievelijk NDUFB8 en SDHB) in ons niertransplantatiemodel met verhoogde overleving en functie zoals waargenomen in niertransplantaten bewaard in STS-aangevulde UW-oplossing.

Op basis van onze in vitro resultaten hebben we besloten om te onderzoeken of het beschermende effect van STS in vivo van toepassing is met behulp van een transplantatiemodel waarbij koude IRI een belangrijke bijdrage levert aan transplantaatdisfunctie en verhoogde complicaties na transplantatie. Onze bevindingen tonen aan dat langdurige (24 uur) SCS van niertransplantaten in STS-aangevulde UW-oplossing de transplantaatkwaliteit en -functie aanzienlijk verbetert, gekenmerkt door verlaagde serumcreatinine- en BUN-spiegels, hogere urineproductie en verlengde overleving van de ontvanger in vergelijking met transplantaten die alleen in UW-oplossing worden bewaard . Het is belangrijk op te merken dat de onmiddellijke urineproductie, zelfs na klinische niertransplantatie, een kritische uitkomst is die bepaalt of dialyse nodig is om vertraagde transplantaatfunctie (DGF) aan te pakken. Daarom is onze waarneming dat STS de urineproductie onmiddellijk na transplantatie verhoogt en vergelijkbaar is met de Sham-groep op POD 14 een veelbelovende bevinding. De waargenomen verbetering van de nierfunctie na transplantatie van transplantaten bewaard in STS-aangevulde UW-oplossing gaf ook een significant overlevingsvoordeel. Kwantitatief verlengde STS-suppletie de levensduur van het transplantaat, zodat 83 procent (5/6) van de ratten die UW plus STS-transplantaten kregen, overleefde tot POD 14 (dag van opoffering) vergeleken met slechts 12,5 procent (1/8) van de ontvangende ratten van transplantaten geconserveerd in UW-oplossing zonder STS-suppletie. Deze bevinding uit de huidige studie komt ook overeen met onze eerdere studie, waarin slechts 14 procent (1 van de 7) van de ontvangende ratten van transplantaten 24 uur in UW-oplossing werd bewaard zonder H2S (GYY4137)-suppletie, en overleefde tot POD 14 [20] .

Naast verbetering van nierfunctieparameters, remde STS-suppletie ook apoptose en ontsteking van niertransplantaten door de weefselexpressie van pro-apoptotische en pro-inflammatoire genen te downreguleren, terwijl tegelijkertijd anti-apoptotische genen werden opgereguleerd en CD68-positieve macrofagen en MPO-positieve neutrofielen, wat in totaal resulteerde in verminderde KIM-1-expressie en ATN en uiteindelijk tot behoud van de niermorfologie. Van deze inflammatoire cytokines is bekend dat ze mediatoren zijn van celdood tijdens koude IRI [31], en hun vermindering van UW plus STS-transplantaten is waarschijnlijk te wijten aan de bekende kenmerken van STS om de endotheliale permeabiliteit in vasculaire endotheliale monolaag te verminderen, de productie van cytokines te verminderen en lokken de productie van ontstekingsremmende cytokinen uit [32]. Ook onze bevinding dat STS-suppletie aan UW-oplossing de expressie van pro-inflammatoire genen neerwaarts reguleert, komt overeen met die van een eerder onderzoek naar de ontstekingsremmende activiteit van STS door niveaus van TNF- en IL-6 bij neurologische ziekten te verlagen [33] ,34]. Mechanistisch inactiveert STS caspase-3 door zich via sterke waterstofbruggen aan zijn actieve plaats te hechten en daardoor de toegang van natuurlijk substraat tot de actieve plaats te voorkomen, waardoor uiteindelijk apoptose wordt gestopt [35]. STS blokkeert ook de activering van JNK, een eiwit dat een cruciale rol speelt bij apoptotische signalering [35], wat onze bevinding over het downregulerende effect van STS op caspase3 en JNK ondersteunt. We kunnen echter niet bepalen of dergelijke mechanismen operationeel zijn in de huidige studie, omdat we geen aanvullende experimenten hebben uitgevoerd om deze moleculaire mechanismen te onderzoeken.

Een belangrijke beperking van ons in vitro-experiment is onze technische uitdaging om de huidige standaard bewaartemperatuur van 4 C [36] te gebruiken, aangezien de 10 ◦C die we gebruikten de laagste temperatuur was die technologisch kon worden bereikt zonder de hypoxische omgeving in gevaar te brengen. Dit is een echt verschil met betrekking tot cellulaire fysiologische processen en ook in conserveringstechnieken. Een mogelijke oplossing is om chemisch geïnduceerde hypoxie in een plastic zak te gebruiken en deze in een koelkast van 4 ◦C te plaatsen om de klinische instellingen van SCS weer te geven. Deze tassen voor het genereren van een anaërobe atmosfeer zijn echter ontworpen om te worden gebruikt bij warme temperaturen (21-37 C), omdat de chemische verbindingen die de hypoxische omgeving induceren onder die omstandigheden functioneren. Toekomstige studies moeten gericht zijn op het optimaliseren van de temperatuur in de hypoxiekamer om klinische SCS-instellingen na te bootsen. Door een consistente temperatuur van 4 ◦C te bereiken zonder een hypoxische omgeving in gevaar te brengen, kunnen we bepalen of de waargenomen fenotypes in het experimentele in vitro koude IRI-model consistent worden uitgedrukt. Afgezien van het in vitro-experiment is ons rattentransplantatiemodel ook niet zonder nadeel. We voerden syngene niertransplantatie uit (genetisch identieke donoren en ontvangers met immunologische compatibiliteit), die alleen van toepassing is op identieke tweelingen bij klinische niertransplantatie, terwijl de meeste klinische niertransplantaties allogeen zijn (genetisch verschillende donoren en ontvangers). De allogene transplantatie dwingt getransplanteerde ontvangers om voorafgaand aan de transplantatie immunologische tests te ondergaan om de menselijke leukocytenantigenen (HLA; moleculen die de immuunrespons induceren en reguleren) van de donor te identificeren, de immunologische compatibiliteit tussen donoren en ontvangers te bepalen en orgaanafstoting te voorkomen [37,38]. Toekomstige studies met STS zouden allogene transplantatie moeten overwegen. Een ander beperkingsmodel voor niertransplantatie is het feit dat we ons hebben gericht op levende donoren, suboptimale transplantaten van donatie na hartdood (DCD)-donoren komen steeds vaker voor als bron van donornieren in veel transplantatiecentra wereldwijd [39]. DCD stelt donororganen bloot aan verschillende perioden van warme ischemie naast koude ischemische tijden tijdens SCS, en wordt geassocieerd met verhoogde percentages van DGF en verminderde transplantaatoverleving in vergelijking met levende donoren [40]. Daarom zouden toekomstige studies het DCD-niertransplantatiemodel moeten overwegen om het effect van STS tegen IRI in dit model te beoordelen.

Concluderend toont onze studie aan dat suppletie van standaard conserveringsoplossing met een klinisch levensvatbaar H2S-donorgeneesmiddel tijdens langdurige SCS van niertransplantaten beschermt tegen transplantatie-geïnduceerde koude nier-IRI, de algehele transplantaatkwaliteit en transplantaatfunctie verbetert en de overleving van de transplantaatontvanger verlengt. Aangezien het risico op DGF toeneemt met verlengde koude ischemische tijd bij klinische niertransplantatie, wat een grote klinische zorg oproept, biedt de observatie dat STS niertransplantaten beschermt tijdens langdurige SCS en DGF na transplantatie voorkomt een grote klinische belofte die de incidentie van DGF bij klinische niertransplantatie in de nabije toekomst. Het toekomstige voordeel van het toevoegen van STS aan bewaaroplossingen kan dus een mogelijke oplossing zijn voor dit aanhoudende probleem. Over het algemeen draagt ​​deze studie bij aan de groeiende hoeveelheid literatuur die de cytoprotectieve effecten van STS en andere H2S-donoren tegen orgaan-IRI ondersteunt, met name het verbeteren van de transplantaatresultaten bij transplantatie-geïnduceerde koude nier-IRI. Deze strategieën kunnen het gebruik vergemakkelijken van meer transplantaten die worden blootgesteld aan langdurige koude ischemische tijden, wat de pool van transplanteerbare organen zou kunnen vergroten.

CrediT auteursbijdrage verklaring

Alle auteurs hebben ingestemd met de indiening van dit manuscript. Er is geen belangenverstrengeling.

Referenties

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Vergelijking van mortaliteit bij alle dialysepatiënten, dialysepatiënten in afwachting van transplantatie en ontvangers van een eerste kadavertransplantatie, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725-1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., Systematische review: niertransplantatie vergeleken met dialyse in klinisch relevante uitkomsten, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093-2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Kosteneffectiviteit van niertransplantatie van DCD in Italië, Transplantatie. Proc. 46 (10) (2014) 3289-3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemie-reperfusieletsel, Eur. J. Trauma ontstaat. Surg. 33 (6) (2007) 600-612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Orgelpreservatie: huidige concepten en nieuwe strategieën voor het volgende decennium, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125-142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Koude ischemie en de verminderde overleving op lange termijn van cadaverische niertransplantaten, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713-718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Belangrijke effecten van vertraagde transplantaatfunctie en koude ischemietijd op de overleving van niertransplantaten, Nephrol. Kies. Transplantatie. 21 (6) (2006) 1689-1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Impact van koude ischemietijd op transplantaatoverleving bij ontvangers van ECD-transplantaten: een gepaarde nieranalyse, Am. J. Transplantatie. 11 (12) (2011) 2647-2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Ontvanger risicofactoren geassocieerd met vertraagde transplantaatfunctie: een gepaarde nieranalyse, Transplantatie 91 (6) (2011) 666-671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr'ebern-Launay, et al., Elk extra uur koude ischemie verhoogt significant het risico op transplantaatfalen en mortaliteit na niertransplantatie, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343-349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondria-gerichte antioxidanten: toekomstperspectieven bij nierischemie-reperfusieschade, Oxid. Med. Cel Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oxidatieve stress veroorzaakt door mitochondriale calciumoverbelasting, Ann. NY Acad. Wetenschap. 1201 (2010) 183-188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, De rol van mitochondriën bij ischemie / reperfusieschade, Transplantatie 73 (4) (2002) 493-499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Opkomende rol van gastransmitters bij niertransplantatie, Am. J. Transplantatie. 13 (12) (2013) 3067-3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Waterstofsulfide en celsignalering: teamspeler of scheidsrechter? Planten Fysiol. Biochem. 78 (2014) 37-42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, het vasorelaxerende effect van H (2) S als een nieuwe endogene gasvormige K (ATP) kanaalopener, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008-6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Behandeling met waterstofsulfide vermindert ischemie-reperfusiebeschadiging van de niertransplantaat tijdens koude opslag en verbetert de vroege nierfunctie en overleving na allogene niertransplantatie, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806-1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Aanvullend waterstofsulfide beschermt de nierfunctie van de transplantatie en verlengt de overleving van de ontvanger na langdurige koude ischemie-reperfusieschade door apoptose van niertransplantaten te verminderen en ontsteking, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Waterstofsulfide beschermt niertransplantaten tegen langdurige koude ischemie-reperfusieschade via specifieke mitochondriale acties, Am. J. Transplantatie. 17 (2) (2017) 341-352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Natriumthiosulfaat voor acute cyanidevergiftiging: een onderzoek in een rattenmodel, Ann. apotheek vr. 63 (2) (2005) 154-161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Natriumthiosulfaat beschermt tegen nierinsufficiëntie na hyperthermische intraperitoneale chemotherapie (HIPEC) met Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.