Spike en Nsp6 zijn belangrijke determinanten van SARS-CoV-2 Omicron BA.1-demping

De SARS-CoV-2 Omicron-variant is immuunontwijkend en minder virulent dan andere belangrijke virale varianten die tot nu toe zijn erkend1–12. Het Omicron-spike (S)-eiwit, dat een ongewoon groot aantal mutaties heeft, wordt beschouwd als de belangrijkste aanjager van deze fenotypes. Hier hebben we chimeer recombinant SARS-CoV-2 gegenereerd dat codeert voor het S-gen van Omicron (BA.1-lijn) in de ruggengraat van een voorouderlijk SARS-CoV-2-isolaat, en dit virus vergeleken met het natuurlijk circulerende Omicron variant. Het Omicron S-dragende virus ontsnapte op robuuste wijze aan de door vaccins geïnduceerde humorale immuniteit, voornamelijk als gevolg van mutaties in het receptorbindende motief; In tegenstelling tot de natuurlijk voorkomende Omicron repliceerde het echter efficiënt in cellijnen en primair-achtige distale longcellen. Op dezelfde manier was bij K18-hACE2-muizen, hoewel het virusdragende Omicron S een minder ernstige ziekte veroorzaakte dan het voorouderlijke virus, de virulentie ervan niet verzwakt tot het niveau van Omicron. Verder onderzoek toonde aan dat het muteren van niet-structureel eiwit 6 (nsp6) naast het S-eiwit voldoende was om het verzwakte fenotype van Omicron te recapituleren. Dit geeft aan dat hoewel de vaccinontsnapping van Omicron wordt aangestuurd door mutaties in S, de pathogeniteit van Omicron wordt bepaald door mutaties zowel binnen als buiten het S-eiwit.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Sinds december 2022 worden de opeenvolgende golven van de COVID-19-pandemie veroorzaakt door vijf grote SARS-CoV-2-varianten, bekend als varianten van zorg (VOC): Alpha (B.1.1.7) , Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2 en AY-lijnen) en Omicron (BA-lijnen)13. Omicron is de meest recentelijk erkende VOC en werd voor het eerst gedocumenteerd in Zuid-Afrika, Botswana en door een reiziger uit Zuid-Afrika in Hong Kong in november 2021 (GISAID ID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Het verspreidde zich snel over de wereld, verdreef binnen enkele weken de voorheen dominante Delta-variant en was in januari 2022 verantwoordelijk voor de meeste nieuwe SARS-CoV-2-infecties (ref. 16-18). Tot nu toe zijn er ten minste vijf lijnen van Omicron geïdentificeerd: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 en BA.5. BA.1 (hierna Omicron genoemd) vertoont een opmerkelijke ontsnapping aan door infectie en vaccin geïnduceerde humorale immuniteit3,19. Bovendien is het minder virulent dan andere VOS bij mensen en in vivo infectiemodellen4,5,7,11,12,20. Omicron verschilt van het prototype SARS-CoV-2 isolaat, Wuhan-Hu-1, met 59 aminozuren; 37 van deze veranderingen vinden plaats in het S-eiwit, wat de mogelijkheid vergroot dat S de kern vormt van het pathogene en antigene gedrag van Omicron.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

S-mutaties beïnvloeden de replicatie van Omicron in celcultuur

Het Omicron S-eiwit bevat 30 aminozuursubstituties, 6 deleties en één insertie met een lengte van 3 aminozuren, vergeleken met Wuhan-Hu-1 (uitgebreide gegevens, figuur 1). Vijfentwintig van deze veranderingen zijn uniek voor Omicron in vergelijking met andere VOS, hoewel sommige ervan zijn gerapporteerd in afvalwater en kleine SARS-CoV-2-varianten21,22. Om de rol van het S-eiwit in het Omicron-fenotype te testen, hebben we een chimeer recombinant virus gegenereerd dat het S-gen van Omicron (USA-lh01/2021) en alle andere genen van een voorouderlijk SARS-CoV-2 (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (uitgebreide gegevens, afbeelding 2a). Dit chimere virus, Omi-S genaamd, werd gemaakt met behulp van een gemodificeerde vorm van circulaire polymerase-extensiereactie (CPER) (Extended Data Fig. 2b) die zeer geconcentreerde virusvoorraden opleverde, die 0,5 x 106 –5 x 106 plaquevormende stoffen bevatten. eenheden (PFU) per ml, van getransfecteerde cellen binnen twee dagen na transfectie (Extended Data Fig. 2c,d), waardoor de noodzaak voor verdere virale amplificatie wordt vermeden.

Afb. 1|Effect van S op de in vitro groeikinetiek van Omicron. een schema van virussen. S, piek; N, nucleocapside. b–e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 cellen (b,d) en Vero E6-cellen (c,e) werden geïnfecteerd met een MOI van 0.01, en de het percentage N-positieve cellen (n=6 replica's) (b,c) en de afgifte van infectieuze deeltjes (n=3 replica's) (d,e) werden bepaald door flowcytometrie en door plaque-assay, respectievelijk. f, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 cellen werden geïnfecteerd met virusmengsels in een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke MOI van 0 te verkrijgen.005 voor elk virus . De cellen werden op de aangegeven tijdstippen gefixeerd en onderworpen aan flowcytometrie. Links, representatief puntendiagram; rechts, percentage niet-geïnfecteerde, Omi-S/mCherry-geïnfecteerde, Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG)-geïnfecteerde en dubbel geïnfecteerde cellen. Ter compensatie werden afzonderlijk geïnfecteerde cellen gebruikt. Foutbalken, gemiddelde ± sd (n {{20}} replicaties). g, plaqueformaten. Links representatieve afbeeldingen van plaques op ACE2/TMPRSS2/Caco-2-cellen. Rechts wordt de diameter van plaques uitgezet als het gemiddelde ± SD van 20 plaques per virus. uur, menselijke iAT2-epitheelcellen werden gedurende 48 uur of 96 uur geïnfecteerd met een MOI van 2,5. De apicale zijde van de cellen werd gewassen met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en de niveaus van infectieuze virusdeeltjes werden gemeten met behulp van plaque-assay. Foutbalken, gemiddelde ± sd (n=4 replicaties). Experimenten werden twee keer herhaald, waarbij elke experimentele herhaling 3 (b – g) of 4 (h) replicaties bevatte. P-waarden werden berekend door een tweezijdige, ongepaarde t-test met Welch's correctie. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001; NS, niet significant. De poortstrategie voor flowcytometrie wordt getoond in aanvullende figuur 1.

We vergeleken eerst de infectie-efficiëntie van Omi-S met een voorouderlijk D614G-bevattend virus (GISAID EPI_ISL_2732373; gegenereerd door CPER; hierna wildtype (WT) genoemd) en een Omicron-isolaat (USA-lh01/2021) in celcultuur (Fig. 1a). Hiervoor hebben we ACE2- en TMPRSS2-die Caco-2 tot expressie brengen (hierna ACE2/TMPRSS2/Caco-2) en Vero E6-cellen geïnfecteerd met Omi-S, WT en Omicron bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01, en bewaakte de virale voortplanting door middel van flowcytometrie en plaquevormingstest. Het WT-virus en Omi-S verspreidden zich snel in ACE2/TMPRSS2/Caco-2-cellen, wat respectievelijk 89% en 80% geïnfecteerde cellen opleverde 24 uur na infectie (HPI) (Fig. 1b). Daarentegen repliceerde Omicron langzamer, wat leidde tot 48% geïnfecteerde cellen bij 24 hpi. Een soortgelijk patroon werd gezien in Vero E6-cellen, waarin 60% en 41% van de cellen positief waren voor respectievelijk WT en Omi-S bij 48 hpi, in tegenstelling tot 10% voor Omicron (figuur 1c). De plaquetest toonde aan dat, hoewel zowel Omi-S als Omicron lagere niveaus van infectieuze virusdeeltjes produceerden vergeleken met WT, de virale titer van Omi-S aanzienlijk hoger was dan die van Omicron. In ACE2/TMPRSS2/Caco-2-cellen produceerde Omi-S 5.1-voudig (P=0.0006) en 5.5-voudig (P {{49} }.0312) meer infectieuze deeltjes dan Omicron bij respectievelijk 12 hpi en 24 hpi (Fig. 1d). Op dezelfde manier waren de infectieuze virustiters van Omi-S in Vero E6-cellen 17-voudig (P=0.0080) en 11-voudig (P=0.0078) hoger dan die van Omicron bij respectievelijk 24 hpi en 48 hpi (Fig. 1e). Het verschil tussen virussen werd op latere tijdstippen minder duidelijk vanwege de hogere cytotoxiciteit veroorzaakt door Omi-S vergeleken met Omicron (uitgebreide gegevens, figuur 3a). De verhoogde replicatie-efficiëntie van Omi-S ten opzichte van Omicron bleef behouden bij testen bij verschillende MOI's (Extended Data Fig. 3b). We hebben het fitnessvoordeel van Omi-S ten opzichte van Omicron verder bevestigd door een directe concurrentietest. Hiervoor hebben we eerst recombinant Omicron (micron) gegenereerd, dat in onze celcultuurtesten de replicatiekinetiek van natuurlijk Omicron nabootste (Extended Data Fig. 4). Vervolgens hebben we mCherry-bevattende Omi-S en mNeonGreen-bevattende Omicron gemaakt en ACE2/TMPRSS2/Caco-2-cellen geïnoculeerd met deze virussen gemengd in een verhouding van 1:1. Flowcytometrische analyse van geïnfecteerde cellen op verschillende tijdstippen van infectie toonde aan dat Omi-S/mCherry duidelijk superieur was aan Omicron/mNeonGreen in termen van replicatie (Fig. 1f). Tenslotte werd de hogere infectie-efficiëntie van Omi-S ook weerspiegeld in de plaquegrootte; hoewel het WT-virus de grootste plaques produceerde (ongeveer 4,1 mm), was de grootte van Omi-S-plaques (ongeveer 2,2 mm) tweevoudig (P <0,0001) groter dan die van Omicron-plaques (ongeveer 1,1 mm) (Fig. 1g). Deze resultaten geven aan dat hoewel mutaties in het S-eiwit de infectie-efficiëntie van Omicron beïnvloeden, ze het Omicron-fenotype niet volledig verklaren.

Verschillende bewijslijnen gaven aan dat het in Omi-S geïncorporeerde S-eiwit zich op dezelfde manier gedroeg als in natuurlijk Omicron. Zoals eerder beschreven20,25 was Omicron S bijvoorbeeld slecht gesplitst vergeleken met WIT S; terwijl 71% van de S in WT-virionen zich in de gesplitste vorm bevond, werd respectievelijk slechts 45% en 47% gesplitst in Omi-S en Omicron (uitgebreide gegevens, figuur 5a). Hetzelfde patroon van S-splitsing was duidelijk in met virus geïnfecteerde cellen (WT, 63% gespleten; Omi-S, 33% gespleten; Omicron, 42% gespleten) (Extended Data Fig. 5b). Deze experimenten onthulden ook dat Omicron S inefficiënt werd geïncorporeerd in virusdeeltjes vergeleken met WTS (verhouding S tot nucleocapside (N): 3,40 voor WT-virus, 1,91 voor Omi-S en 2,04 voor Omicron) (uitgebreide gegevens, figuur 5a). Op dezelfde manier produceerden zowel Omi-S als Omicron kleinere syncytia vergeleken met het WT-virus, een waarneming die eerder is gerapporteerd voor Omicron (Extended Data Fig. 5c). Ten slotte vertoonden Omi-S en Omicron, in overeenstemming met de gepubliceerde literatuur , een voorkeur voor toegang via cathepsine, zoals weerspiegeld door hun hogere gevoeligheid voor de cathepsineremmer E64d (Extended Data Fig. 6). Vervolgens vergeleken we de replicatiekinetiek van WT, Omi-S en Omicron in longepitheelcellen, die een belangrijke virale replicatieplaats vormen bij patiënten met COVID-19 (ref. 27,28). Dienovereenkomstig hebben we door de mens geïnduceerde pluripotente stam (iPS)-cel-afgeleide longalveolaire type 2 epitheel (iAT2) cellen gebruikt. AT2-cellen vertegenwoordigen een essentiële celpopulatie in de distale long en vormen een van de belangrijkste doelwitten van SARS-CoV-2-infectie28,29. We infecteerden iAT2-cellen, gekweekt als een lucht-vloeistofinterface (ALI)-cultuur, bij een MOI van 2,5 en volgden de uitscheiding van virale nakomelingen aan de apicale kant van cellen bij 48 hpi en 96 hp. In overeenstemming met de resultaten verkregen uit cellijnen produceerde het WT-virus de hoogste niveaus van infectieuze virusdeeltjes (Fig. 1h). Bij Omi-S en Omicron leverde de eerste een ongeveer vijfvoudig (P=0.0008) hogere infectieuze virale titer op bij 48 pk. De virale titers voor WT en Omi-S daalden bij 96 dpi vergeleken met 48 pk als gevolg van het cytopathische effect (CPE) van infectie. Er werd echter geen CPE waargenomen voor Omicron, wat leidde tot een aanhoudende productie van infectieuze virionen. Over het geheel genomen bevestigen deze resultaten de conclusie dat mutaties in S niet volledig verantwoordelijk zijn voor de verzwakte replicatiecapaciteit van Omicron in celkweek.

cistanche voordelen voor mannen versterken het immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Minimale rol van S in de pathogeniciteit van Omicron bij muizen

Om te onderzoeken of Omi-S een hogere in vivo fitheid vertoont vergeleken met Omicron, hebben we de infectie-uitkomst van Omi-S vergeleken met WT SARS-CoV-2 en Omicron in K18-hACE2-muizen. In overeenstemming met de gepubliceerde literatuur4,5 veroorzaakte intranasale inenting van muizen (12-20 weken oud) met Omicron (104 PFU per muis) geen significant gewichtsverlies, terwijl inenting met het WT-virus een snelle afname van het lichaamsgewicht teweegbracht, waarbij alle muizen 8 dagen na infectie (dpi) verliezen ze meer dan 20% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht (Fig. 2a). Opmerkelijk is dat 80% van de met Omi-S geïnfecteerde muizen ook meer dan 20% van hun lichaamsgewicht verloren met 9 dpi (figuur 2a en uitgebreide gegevens figuur 7a). De evaluatie van klinische scores (een cumulatieve maatstaf voor gewichtsverlies, abnormale ademhaling, afwijkend uiterlijk, verminderde responsiviteit en veranderd gedrag) bracht ook een soortgelijk patroon aan het licht; terwijl met Omicron geïnfecteerde muizen weinig tot geen tekenen van klinische ziekte vertoonden, ging de gezondheid van degenen die besmet waren met WT en Omi-S snel achteruit, waarbij het WT-virus een ernstiger ziekte veroorzaakte (P=0.0102) (Fig. 2b en uitgebreide gegevens figuur 7b). Omdat SARS-CoV-2 een fatale infectie veroorzaakt bij K18-hACE2-muizen4 , hebben we de overleving van muizen na een virale infectie vergeleken. In overeenstemming met de resultaten van gewichtsverlies en klinische score, veroorzaakten WT en Omi-S sterftecijfers van respectievelijk 100% (6/6) en 80% (8/10). Daarentegen overleefden alle muizen die met Omicron waren geïnfecteerd (Fig. 2c). Deze bevindingen, die consistent zijn met een recente publicatie30, geven aan dat het S-eiwit niet de exclusieve bepalende factor is voor de pathogeniteit van Omicron in K18-hACE2-muizen.

Vervolgens vergeleken we de verspreiding van Omi-S met Omicron en WT SARS-CoV-2 in de longen en neusschelpen van K18-hACE2-muizen. De muizen (12-20 weken oud) werden intranasaal uitgedaagd met 104 PFU (zeven muizen per virus), en virale titers in de longen van muizen werden gemeten bij 2 en 4 dpi. In overeenstemming met in vitro bevindingen was de titer van het infectieuze virus in de longen van met WT geïnfecteerde muizen hoger dan die gedetecteerd bij muizen die waren geïnfecteerd met de andere twee virussen (Fig. 2d). Met name produceerden met Omi-S geïnfecteerde muizen echter 30- maal (P=0.0286) meer infectieuze virusdeeltjes vergeleken met met Omicron geïnfecteerde muizen bij 2 dpi. De titer daalde bij 4 dpi voor met WT en Omi-S geïnfecteerde muizen, maar vertoonde een stijgende trend voor met Omicron geïnfecteerde muizen, wat wijst op de mogelijkheid van milde maar aanhoudende infectie door Omicron in K18-hACE2-muizen. Alle drie varianten die uit de longen van muizen werden teruggevonden, behielden hetzelfde fenotype van plaquegrootte als het oorspronkelijke inoculum, wat aangeeft dat replicatie bij muizen geen detecteerbaar effect had op genotypen van deze virussen (gegevens niet getoond).

Om de virale pathogeniteit in de longen en neusschelpen van K18-hACE2-muizen te evalueren, hebben we een histopathologische analyse van deze weefsels uitgevoerd bij 2 dpi. Zoals eerder gerapporteerd4,31 werd een uitgebreide bijna-diffundeerde immuunreactiviteit van het SARS-CoV-2 N-eiwit gedetecteerd in longblaasjes van muizen die waren geïnfecteerd met het WT-virus (Fig. 2e). Daarentegen produceerden Omi-S- en Omicron-infectie gelokaliseerde foci van alveolaire kleuring met minder foci voor Omicron vergeleken met Omi-S. Het meest opvallende fenotype werd waargenomen in bronchiolair epitheel, waarin Omi-S een uitgesproken, routinematig circumferentiële infectie veroorzaakte, waarbij ongeveer 10-15% van de bronchiolen positief was voor viraal N-eiwit bij 2 dpi, terwijl slechts 3-5% van de bronchiolen N-eiwit was. -positief voor Omicron (Fig. 2f). Het WT-virus infecteerde ongeveer 1% van de bronchiolen en omvatte in alle gevallen slechts één geïsoleerde epitheelcel per bronchiol. Bovendien was bronchiolaire infectie geassocieerd met epitheliale necrose bij met Omi-S geïnfecteerde muizen, zoals bepaald door seriële hematoxyline en eosine (H&E) sectieanalyse, terwijl er geen histologisch bewijs van luchtwegletsel werd waargenomen bij met Omicron of WT geïnfecteerde muizen (Extended Data Afb. 8a,b). De neusschelpen van muizen die waren geïnoculeerd met WT- en Omi-S-virussen bevatten beide overvloedige SARS-CoV-2-positieve cellen, die geassocieerd waren met openlijke cytopathische effecten, terwijl Omicron zeldzame, sporadische positieve cellen produceerde, zonder duidelijke tekenen van epitheliale letsel (uitgebreide gegevens afbeelding 8c). Over het geheel genomen suggereren deze bevindingen dat de replicatie van Omicron in de luchtwegen van muizen aanzienlijk verzwakt is in vergelijking met Omi-S, wat onze conclusie ondersteunt dat mutaties in S slechts gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor de verzwakte pathogeniteit van Omicron.

Mutaties in S en nsp6 definiëren Omicron-verzwakking

Naast het S-eiwit heeft Omicron aminozuurveranderingen in niet-structurele eiwitten 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, envelop- (E), membraan- (M) en N-eiwitten, vergeleken met het WT-virus (Uitgebreide gegevens afbeelding 9a). Om niet-spike-eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij de verzwakking van Omicron, hebben we een groot panel van fluorescent gelabelde chimere virussen gegenereerd, die elk Omicron S bevatten in combinatie met één niet-spike-eiwit van Omicron, waarbij de overige eiwitten afkomstig zijn van het WT-virus (Extended Data Afb. 9b). Toen we Omicron S combineerden met Omicron nsp6 (Omi-S / nsp6), observeerden we een sterke afname in virale replicatie, waarbij de infectiekinetiek die van Omicron in celkweek nabootste (Fig. 3a – d); een dergelijke afname werd niet waargenomen voor andere chimere virussen. De slechte replicatie-efficiëntie van Omi-S/nsp6 werd ook bevestigd door onze bevinding dat zowel Omi-S/nsp6 als Omicron bijna vijf tot zes dagen nodig hadden om te herstellen door CPER, terwijl alle andere varianten binnen twee dagen werden hersteld (gegevens niet getoond). Ten slotte werd Omi-S / nsp6, net als Omicron, duidelijk overtroffen door Omi-S in een directe competitietest (Fig. 3e).

Afb. 2|Rol van S in de pathogeniciteit van Omicron. a–c, Mannelijke en vrouwelijke K18-hACE2-muizen (12–20 weken oud) werden intranasaal geïnoculeerd met 1 × 104 PFU WT (n=6 muizen), Omi-S (n=10 muizen) of Omicron (n {{1{{40}}}} virus. In dit experiment werden twee onafhankelijk gegenereerde virusvoorraden gebruikt. Lichaamsgewicht (a), klinische score (b) en overleving (c) werden dagelijks gedurende 14 dagen gevolgd. Muizen die 20% van hun aanvankelijke lichaamsgewicht verloren, werden geëuthanaseerd. d,e, K18-hACE2-muizen werden intranasaal geïnoculeerd met 1 x 104 PFU WT (n=14 muizen), Omi-S (n=14 muizen) en Omicron (n {{ 20}} muizen). Longmonsters van de geïnfecteerde muizen werden verzameld bij 2 of 4 dpi om de virale titer te bepalen (n=4 muizen) (d) of voor immunohistochemische (IHC) detectie van het N-eiwit (n=3 muizen) (e). In e worden representatieve IHC-afbeeldingen gepresenteerd die SARS-CoV-2 N (bruine kleur) in longblaasjes (pijlen) en bronchiolen (pijlpunten) in muizenlongen tonen bij 2 dpi. Schaalbalken, 100 µm. f, Percentage N-positieve bronchioli in de longen van geïnfecteerde muizen (n=3 muizen) bij 2 dpi. Elke stip vertegenwoordigt een geïnfecteerde muis. De statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweezijdige, ongepaarde t-test met Welch's correctie (a,b,d,f) en log-rank (Mantel-Cox) test (c). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001; NS, niet significant.

In de longen van K18-hACE2-muizen, terwijl Omi-S uitgebreide bronchiolaire infectie en letsel veroorzaakte, vertoonden zowel Omicron als Omi-S/nsp6 een verminderde infectie zonder bewijs van epitheliale schade (Fig. 3f). In overeenstemming met deze bevindingen produceerden de longen van met Omi-S/nsp6-geïnfecteerde muizen virale titers die equivalent waren aan die waargenomen voor rOmicron en Omicron-isolaat (Fig. 3g). Ten slotte overleefde 71% van de met Omi-S/nsp6 geïnfecteerde muizen (Fig. 3h) - in tegenstelling tot de overlevingspercentages van slechts 20% die werden waargenomen bij muizen die met Omi-S waren geïnfecteerd (Fig. 2c). Over het geheel genomen geven deze resultaten aan dat mutaties in S en nsp6 voldoende zijn om de verzwakte virulentie van Omicron te definiëren. Deze waarnemingen ondersteunen en breiden de bevindingen van een eerder onderzoek verder uit, waaruit blijkt dat mutaties in het 5′-UTR-nsp12-gebied, waarin nsp6 zich bevindt, bijdragen aan de verzwakking van Omicron in K18-hACE2-muizen30.

Afb. 3|Mutaties in S en nsp6 veroorzaken de pathogeniteit van Omicron.a–d, Replicatiekinetiek van aangegeven mNeonGreen-reportervirussen in ACE2/TMPRSS2/Caco-2-cellen (MOI=0.01) bepaald door stroom cytometrie (n=3 replica's) (a,c) en plaquetest (n=3 replica's) (b,d). Experimenten werden tweemaal herhaald. e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 cellen werden geïnfecteerd met virusmengsels in een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke MOI van 0 te verkrijgen.005 voor elk virus . De cellen werden op de aangegeven tijdstippen gefixeerd en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Het percentage niet-geïnfecteerde, enkelvoudig geïnfecteerde en dubbel geïnfecteerde cellen wordt weergegeven. Ter compensatie werden afzonderlijk geïnfecteerde cellen gebruikt. Individuele gegevenspunten worden uitgezet samen met het gemiddelde ± sd (n=3 replicaties). Het experiment werd tweemaal herhaald. f – h, K18-hACE2-muizen werden intranasaal geïnoculeerd met 1 × 104 PFU aan virussen. Longmonsters van geïnfecteerde muizen werden verzameld bij 2 dpi voor IHC-detectie van het N-eiwit (n=3 muizen) (f) of voor de bepaling van virale titers (n=4 muizen) (g). In f worden representatieve afbeeldingen van H&E-kleuring van N-positieve bronchioli getoond in inzetstukken. Bronchiolaire epitheliale necrose wordt aangegeven met pijlen. Er werd geen bewijs van necrose waargenomen in de bronchiolen van muizen die waren geïnfecteerd met Omicron of Omi-S/nsp6. Schaalbalk, 100 µm. De rechter grafiek in f toont het percentage N-positieve bronchiolen in de longen van geïnfecteerde muizen. Elke stip vertegenwoordigt een geïnfecteerde muis. h, Overleving van geïnfecteerde muizen dagelijks gevolgd gedurende 14 dagen. Muizen die 20% van hun aanvankelijke lichaamsgewicht verloren, werden geëuthanaseerd. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweezijdige, ongepaarde t-test met Welch's correctie (a – g) en log-rank (Mantel-Cox) test (h). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001; NS, niet significant.

Het S-eiwit RBM drijft de vaccinontsnapping van Omicron aan

Een grote hoeveelheid literatuur heeft bewijs geleverd voor de grootschalige ontsnapping van Omicron aan door vaccins geïnduceerde humorale immuniteit14,19. Om S-regio's te definiëren die geassocieerd zijn met het immuunontsnappende fenotype van Omicron, hebben we eerst de in vitro neutralisatieactiviteit van sera van gevaccineerde individuen tegen WT SARS-CoV vergeleken-2 (USA-WA1/20 20), Omi-S en Omicron. Sera verzameld binnen twee maanden na de tweede dosis mRNA-1273 (Moderna mRNA-vaccin; n=12) of BNT162b2 (Pfizer-BioNTech mRNA-vaccin; n=12) vaccin zijn opgenomen (uitgebreide gegevens Tafel 1). We voerden een neutralisatietest met meerdere cycli uit in een omgeving waarin het virus en de neutraliserende sera te allen tijde aanwezig waren, waardoor de situatie bij een seropositief individu werd nagebootst. Alle sera neutraliseerden Omicron slecht, met een 11.1-voudige (bereik: 4.4-voudige tot 81.2-voudige; P < 0,0001) lagere half-maximale neutraliserende verdunning (ND50) voor Omicron vergeleken met WA1 (Fig. 4a, b). In feite neutraliseerde ongeveer 80% van de monsters Omicron niet volledig bij de hoogste geteste concentratie (Extended Data Fig. 10). Met name vertoonde Omi-S identieke ND50-waarden als Omicron (11,5- maal lager dan die van WA1; P <0,0001) (Fig. 4a, b), wat suggereert dat het Omicron S-eiwit, wanneer het in een WT wordt opgenomen virus, gedraagt ​​zich op dezelfde manier als in Omicron.

Afb. 4|Rol van S in de immuunresistentie van Omicron. ND50-waarden voor WA1, Omi-S en Omicron in sera van personen die twee injecties met het Moderna-vaccin (donoren 1–12) of Pfizer-vaccin (donoren 13–24) hebben gekregen (meer details over sera vindt u in Uitgebreid Gegevenstabel 1; individuele curven worden weergegeven in uitgebreide gegevensafbeelding 10). b, Trajecten van ND50-waarden tegen WA1, Omi-S en Omicron (de gegevens van a zijn uitgezet). De vouwverandering in ND50-waarden wordt aangegeven (n=24 serummonsters). c – f, Schematische voorstelling van de chimere (links; c, d) en mutante (links; e, f) virussen. De aminozuurnummering voor WA1-mutanten in e is gebaseerd op de WA1 S-sequentie, terwijl de nummering voor Omicron-mutanten in f is gebaseerd op de Omicron S-sequentie. Zes van de 24 sera (3 van Moderna en 3 van Pfizer) werden getest. Elk serummonster wordt weergegeven door een stip van een specifieke kleur. De gegevens worden uitgezet als de vouwverandering van het ouderlijke virus. De statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweezijdige, ongepaarde t-test met Welch's correctie. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001; NS, niet significant.

Het SARS-CoV-2 S-eiwit bestaat uit twee domeinen: het S1-domein, dat interageert met de ACE2-receptor, en het S2-domein, dat verantwoordelijk is voor membraanfusie32. Binnen het S1-domein liggen een N-terminaal domein (NTD) en een receptor-bindend domein (RBD), dat het receptor-bindende motief (RBM) bevat dat direct contact maakt met de ACE2-receptor33. De NTD van Omicron S heeft 11 aminozuurveranderingen, waaronder 6 deleties en één 3-aminozuurlange insertie, terwijl de RBD 15 mutaties bevat, waarvan er 10 geconcentreerd zijn in de RBM (Extended Gegevens Afb. 1). Zowel de NTD als de RBD zijn gastheer van neutraliserende epitopen34-37, maar de RBD is immunodominant en vertegenwoordigt het primaire doelwit van de neutraliserende activiteit die aanwezig is in SARS-CoV-2 immuunsera37,38. Om te bepalen of het neutralisatieresistentiefenotype van Omicron wordt veroorzaakt door mutaties in een bepaald domein van het S-eiwit, hebben we twee groepen chimere virussen gegenereerd. De eerste groep bestond uit het WA1-virus dat de NTD, RBD of RBM van Omicron droeg (Fig. 4c), en de tweede groep bestond uit het Omi-S-virus dat de NTD, RBD of RBM van WA1 droeg (Fig. 4d). Uit de neutralisatietest bleek dat mutaties in de RBM de belangrijkste oorzaak waren van de resistentie van Omicron tegen door vaccins geïnduceerde humorale immuniteit: het vervangen van de RBM van WA1 door die van Omicron verlaagde de ND50 met een factor 5,4- (P < 0,0001), en omgekeerd verhoogde het vervangen van de RBM van Omi-S door die van WA1 de ND50 met een factor 5,6- (P=0,0003) (Fig. 4c,d). Het feit dat geen van de RBM-swapvirussen het ongeveer 11-voudige verschil bereikte dat werd waargenomen tussen WA1 en Omi-S suggereert dat mutaties in andere delen van S ook bijdragen aan vaccinresistentie.

Om te onderzoeken of specifieke mutaties in Omicron RBM het ontsnappen van vaccins aandrijven, hebben we twee extra panels van recombinante virussen gegenereerd, één met WA1 S die Omicron RBM-mutaties draagt, afzonderlijk of in combinatie (Fig. 4e), en de andere met Omicron S zonder dezelfde reeks mutaties (Fig. 4f). Twee WA1-mutanten - mutant 3 (met een E484A-substitutie) en mutant 4 (met een cluster van vijf substituties Q493R, G496S, Q498R, N501Y en Y505H) - vertoonden een gematigde maar statistisch significante afname van 1,4--voudig ( P=0.0002) en 1.8-voudig (P=0.0003) in respectievelijk ND50-waarden, vergeleken met WA1 (Fig. 4e). Het tegenovergestelde werd waargenomen toen deze mutaties uit Omicron S werden verwijderd; de Omicron-mutant 3 (zonder de E484A-substitutie) en mutant 4 (zonder Q493R, G496S, Q498R, N501Y en Y505H) hadden een 1.9--voudig (P=0.0082) en 3.{{38 }}voudige (P=0.0025) hogere ND50-waarden vergeleken met Omicron (Fig. 4f). Omdat geen van de mutanten het algehele fenotype van Omicron heeft gevangen, nemen we aan dat de ontsnapping uit het vaccin een cumulatief effect is van mutaties verdeeld over de lengte van het S-eiwit. Het is mogelijk dat mutaties de conformatie van Omicron S zodanig veranderen dat de meeste immunodominante neutraliserende epitopen worden verstoord en niet meer beschikbaar zijn voor neutralisatie.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Discussie

Deze studie biedt belangrijke inzichten in virale eiwitten die bijdragen aan de pathogeniteit van SARS-CoV-2. We laten zien dat S, het meest gemuteerde eiwit in Omicron, een onvolledige rol speelt bij de verzwakking van Omicron. In celgebaseerde infectietests vertoont het Omi-S-virus een gemiddelde replicatie-efficiëntie tussen het voorouderlijke virus en Omicron. Op dezelfde manier contrasteert Omi-S bij K18-hACE2-muizen met niet-fatale Omicron en leidt het tot een sterfte van 80%; het voorouderlijke virus veroorzaakt 100% sterfte bij deze muizen. Toen we S-mutaties combineerden met mutaties in nsp6, vertoonde het virus met name een verzwakt fenotype dat grotendeels leek op dat van Omicron, wat aangeeft dat deze twee eiwitten belangrijke determinanten zijn van de pathogeniteit van Omicron. Toekomstige studies zullen de mechanismen ontcijferen waarmee nsp6-mutaties de virale replicatie beïnvloeden.

Een mogelijke beperking van onze studie is het gebruik van K18-hACE2-muizen voor pathogenesestudies in plaats van primatenmodellen die meer overeenkomsten hebben met mensen39. Er moet echter worden opgemerkt dat K18-hACE2-muizen een beproefd model zijn voor het onderzoeken van het dodelijke fenotype van SARS-CoV-24,31. Hoewel deze muizen longpathologie ontwikkelen na een SARS-CoV-2-infectie, is de mortaliteit in verband gebracht met de betrokkenheid van het centrale zenuwstelsel als gevolg van virale neuro-invasie en verspreiding31,40. Het feit dat infectie van K18-hACE2-muizen met Omi-S, maar niet met Omicron, neurologische symptomen uitlokt (bijvoorbeeld een gebogen houding en een gebrek aan reactievermogen) suggereert dat de eigenschap van neuro-invasie behouden blijft in Omi-S, waarschijnlijk als gevolg van de hogere replicatie-efficiëntie ervan, en dat de determinanten van deze eigenschap buiten het S-eiwit liggen. Deze bevindingen komen overeen met een eerder onderzoek waaruit blijkt dat hamsters die zijn geïnfecteerd met Omi-S aanzienlijk meer virus uitscheiden en meer gewicht verliezen dan hamsters die zijn geïnfecteerd met Omicron, wat erop wijst dat mutaties buiten S bijdragen aan de verzwakte pathogeniteit van Omicron41.

We ontdekten dat, hoewel het voorouderlijke virus zich hoofdzakelijk in de longblaasjes vermenigvuldigt en slechts een zeldzame infectie van de bronchiolen veroorzaakt bij K18-hACE2-muizen, zowel Omi-S als Omicron een verhoogde neiging vertonen om zich te vermenigvuldigen in het bronchiolaire epitheel, wat aangeeft dat de S eiwit is verantwoordelijk voor het veranderde tropisme. Het mechanisme achter deze omschakeling is onbekend, maar het is mogelijk dat Omicron S efficiënter is dan WTS bij het gebruik van cathepsine B of cathepsine L (refs. 25,42,43), die een actieve virale toegangsroute vormen in de bronchiolen en andere luchtwegen. cellen41. Daarentegen wordt het binnendringen van SARS-CoV-2 in alveolaire epitheelcellen voornamelijk veroorzaakt door TMPRSS2 (refs. 28,44), waar Omicron S onvoldoende gebruik van maakt25,45, wat leidt tot een slechte infectie van deze cellen4,5 ,25,43. Deze bevindingen kunnen de verzwakte longpathologie verklaren die door Omicron wordt veroorzaakt.

cistanche voordelen-versterken het immuunsysteem

Omicron nsp6 heeft twee gewijzigde locaties ten opzichte van het prototype SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1 isolaat: een deletie van drie aminozuren (LSG, posities 105-107) en een I189V-substitutie (Extended Data Fig. .9). Er zijn verschillende functies van nsp6 bij de replicatie van coronavirus beschreven; De belangrijkste daarvan is de biogenese van dubbelmembraanblaasjes (DMV's), die de plaats van virale RNA-synthese vertegenwoordigen. Uit een eerder onderzoek is gebleken dat SARS-CoV-2 DMV's voornamelijk worden gegenereerd door de gezamenlijke werking van drie virale eiwitten: nsp3, nsp4 en nsp6; hoewel nsp3 en nsp4 voldoende zijn voor de vorming van DMV's, verbindt nsp6 deze DMV's met het endoplasmatisch reticulum en kanaliseert de essentiële communicatie tussen deze structuren46. Of de constellatie van mutaties in Omicron nsp6 de vorming of functies van DMV beïnvloedt, moet verder worden onderzocht. Nsp6 activeert ook NLR3-afhankelijke cytokineproductie en pyroptose in de longen van patiënten met COVID-19, en fungeert als een belangrijke virulentiefactor47. Merk op dat een nsp6-variant die geassocieerd is met asymptomatische COVID-19 een verminderd vermogen vertoonde om pyroptose te induceren47, wat aanleiding gaf tot speculatie dat mutaties in Omicron nsp6 ook pyroptose zouden kunnen beïnvloeden. Gedetailleerde mechanistische studies zullen nodig zijn om het effect van Omicron-mutaties op de functies van nsp6 te ontleden.

Het is momenteel niet bekend of mutaties in S en nsp6 samenwerken om Omicron-verzwakking te bewerkstelligen. Gegeven dat Omicron S een grotere voorkeur voor bronchiolen vertoonde, is het mogelijk dat S verantwoordelijk is voor het veranderde virale tropisme, terwijl niet-spike-mutaties, inclusief die in nsp6-slechts aanpassingen zijn aan de veranderde weefselomgeving. Het is de moeite waard te vermelden dat hoewel nsp6 het belangrijkste niet-spike-eiwit achter Omicron-verzwakking lijkt te zijn, de bijdrage van andere virale eiwitten niet volledig kan worden uitgesloten. In vitro-experimenten die de rol van niet-spike-mutaties onderzochten, werden allemaal uitgevoerd in ACE2/TMPRSS2/Caco-2-cellen. Het gebruik van andere, meer immuuncompetente celtypen zou ook het effect van andere niet-spike-mutaties kunnen onthullen. Bovendien bevatten onze chimere virussen Omicron S gecombineerd met slechts één niet-spike-eiwit tegelijk, wat epistatische interacties op lange afstand tussen mutaties in meerdere virale eiwitten beperkte.

cistanche voordelen voor mannen versterken het immuunsysteem

Onze studie toont aan dat mutaties in de RBM van Omicron S de belangrijkste determinanten zijn van de ontsnapping van Omicron aan neutraliserende antilichamen, hoewel mutaties in andere regio's van S ook een bijdrage leveren. Binnen de RBM identificeren we twee hotspots van mutaties, die Omicron S het vermogen geven om neutralisatie te weerstaan: de ene draagt ​​de E484A-substitutie en de andere bevat een cluster van vijf substituties: Q493R, G496S, Q498R, N501Y en Y505H. Er is aangetoond dat de E484A-substitutie aan neutralisatie door herstellende sera ontsnapt51. Bovendien suggereert structurele modellering dat sommige therapeutische monoklonale antilichamen zeer stabiele zoutbruggen vormen met het E484-residu, waarbij ze hun binding volledig verliezen wanneer dit residu wordt veranderd in A of nadat Q493K en Y505H veranderen52. Op dezelfde manier onthulde het in kaart brengen van RBM-residuen die direct interageren met 49 bekende neutraliserende antilichamen N440, G446, S477 en T478 als laagfrequente interactoren, N501, Y505 en Q498 als middenfrequente interactoren, en E484 en Q493 als hoogfrequente interactoren53 , in lijn met onze neutralisatietestresultaten. Opmerkelijk is dat, hoewel het antilichaambindende potentieel van Omicron S verminderd is54, het receptorbindende vermogen ervan intact is. In feite heeft het Omicron RBD een hogere affiniteit voor ACE2 vergeleken met de Wuhan-Hu-1 en Delta RBD's25. Dit geeft aan dat mutaties in Omicron S zo zijn geëvolueerd dat ze de binding van antilichamen belemmeren, maar de receptorbetrokkenheid behouden. Dit opent de mogelijkheid om zich te richten op de geconserveerde en structureel beperkte regio's van S die betrokken zijn bij de ACE2-herkenning voor het ontwerpen van breedspectrumvaccins om de COVID-19 pandemie onder controle te houden.

referenties

1. Liu, L. et al. Opvallende ontduiking van antilichamen, gemanifesteerd door de Omicron-variant van SARS-CoV-2. Natuur 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. et al. Aanzienlijke ontsnapping van SARS-CoV-2 Omicron aan neutralisatie van antilichamen. Natuur 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. et al. Plasmaneutralisatie van de SARS-CoV-2 Omicron-variant. N. Engels. J. Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. et al. Verzwakte replicatie en pathogeniteit van SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Natuur 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ et al. SARS-CoV-2 Omicron-virus veroorzaakt verzwakte ziekten bij muizen en hamsters. Natuur 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA et al. Klinische uitkomsten geassocieerd met SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529)-variant en BA.1/BA.1.1- of BA.2-subvariantinfectie in Zuid-Californië. Nat. Med. 28, 1933-1943 (2022).

7. Wolter, N. et al. Vroege beoordeling van de klinische ernst van de SARS-CoV-2 omicron-variant in Zuid-Afrika: een datakoppelingsonderzoek. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA Schattingen van de ernst van de SARS-CoV-2 Omicron-variant in Ontario, Canada. J. Am. Med. Assoc. 327, 1286–1288 (2022).

9. Uraki, R. et al. Karakterisering van SARS-CoV-2 Omicron BA.4- en BA.5-isolaten bij knaagdieren. Natuur 612, 540–545 (2022).

10. Uraki, R. et al. Karakterisering en antivirale gevoeligheid van SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Natuur 607, 119–127 (2022).

11. Dyer, O. Covid-19: Omicron veroorzaakt meer infecties, maar minder ziekenhuisopnames dan Delta, blijkt uit Zuid-Afrikaanse gegevens. Br. Med. J.375, n3104 (2021).

12. Sigal, A. Mildere ziekte met Omicron: is het het virus of de reeds bestaande immuniteit? Nat. Ds. Immunol. 22, 69–71 (2022).

13. WIE. Het volgen van SARS-CoV-2 varianten https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-varianten/ (2022).

14. Cele, S. et al. Omicron ontsnapt uitgebreid maar onvolledig aan de neutralisatie van Pfizer BNT162b2. Natuur 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. et al. Waarschijnlijke overdracht van SARS-CoV-2 omicron-variant in quarantainehotel, Hong Kong, China, november 2021. Nood. Infecteren. Dis. 28, 460–462 (2022).

16. Iuliano, AD et al. Trends in de ernst van de ziekte en het gebruik van gezondheidszorg tijdens de vroege Omicron-variantperiode vergeleken met eerdere periodes van SARS-CoV-2 hoge transmissie - Verenigde Staten, december 2020 – januari 2022. Morb. Sterfelijk. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. COVID-datatracker https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Taylor, L. Covid-19: Omicron behaalt wekelijks een recordaantal wereldwijde infecties. Br. Med. J.376, o66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 leidt tot een wijdverbreide ontsnapping aan neutraliserende antilichaamreacties. Cel 185, 467–484 (2022).

20. Suzuki, R. et al. Verzwakte fusogeniciteit en pathogeniteit van SARS-CoV-2 Omicron-variant. Natuur 603, 700–705 (2022).

21. Smyth, DS et al. Het volgen van cryptische SARS-CoV-2-lijnen die zijn gedetecteerd in het afvalwater van New York. Nat. Gemeenschappelijk. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE et al. Opmerkingen uit het veld: vroeg bewijs van de SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron)-variant in gemeenschapsafvalwater – Verenigde Staten, november-december 2021. Morb. Sterfelijk. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Hermann, A. et al. Klonering van een passagevrij SARS-CoV-2-genoom en mutagenese met behulp van rode recombinatie. Int. J. Mol. Wetenschap 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Een geoptimaliseerde op circulaire polymerase-extensiereactie gebaseerde methode voor functionele analyse van SARS-CoV-2. Voordruk op https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. et al. Veranderd TMPRSS2-gebruik door SARS-CoV-2 Omicron heeft invloed op tropisme en fusogeniciteit. Natuur 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ et al. SARS-CoV-2 Omicron is een immuun-ontsnappingsvariant met een gewijzigde celingangsroute. Nat. Microbiol. 7, 1161–1179 (2022).

27. Martines, RB et al. Pathologie en pathogenese van SARS-CoV-2 geassocieerd met dodelijke coronavirusziekte, Verenigde Staten. Opduiken. Infecteren. Dis. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. et al. SARS-CoV-2-infectie van pluripotente stamcel-afgeleide menselijke longalveolaire type 2-cellen lokt een snelle epitheliale-intrinsieke ontstekingsreactie uit. Celstamcel 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. et al. SARS-CoV-2-infectie van primair menselijk longepitheel voor COVID-19-modellering en medicijnontdekking. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Spike-eiwit-onafhankelijke verzwakking van SARS-CoV-2 Omicron-variant in laboratoriummuizen. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. et al. Fatale neurodisseminatie en SARS-CoV-2-tropisme bij K18-hACE2-muizen zijn slechts gedeeltelijk afhankelijk van hACE2-expressie. Virussen 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW Structurele en functionele eigenschappen van SARS CoV-2 spike-eiwit: potentiële ontwikkeling van antivirusgeneesmiddelen voor COVID-19 . Acta Pharmacol. Zonde. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. et al. Structuur van het SARS-CoV-2-spike-receptor-bindende domein gebonden aan de ACE2-receptor. Natuur 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. et al. Een neutraliserend menselijk antilichaam bindt zich aan het N-terminale domein van het Spike-eiwit van SARS-CoV-2. Wetenschap 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN et al. Prevalente, beschermende en convergente IgG-herkenning van SARS-CoV-2 niet-RBD-spike-epitopen. Wetenschap 372, 1108–1112 (2021).

36. Premkumar, L. et al. Het receptorbindende domein van het virale spike-eiwit is een immunodominant en zeer specifiek doelwit van antilichamen bij SARS-CoV-2-patiënten. Wetenschap Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. et al. Menselijke neutraliserende antilichamen opgewekt door SARS-CoV-2-infectie. Natuur 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. et al. Het in kaart brengen van neutraliserende en immunodominante plaatsen op het SARS-CoV-2 piekreceptorbindende domein door middel van structuurgeleide serologie met hoge resolutie. Cel 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Niet-menselijke primatenmodellen voor SARS-CoV-2 onderzoek: overweeg alternatieven voor makaken. Lab-anim. 50, 113–114 (2021).

40. Kumari, P. et al. Neuro-invasie en encefalitis na intranasale inenting van SARS CoV-2 in K18-hACE2-muizen. Virussen 13, 132 (2021).

41. Peacock, TP et al. De veranderde toegangsroute en antigene afstand van de SARS-CoV-2 Omicron-variant wijzen op afzonderlijke domeinen van spike-eiwit. Voordruk op https://doi.org/10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Modellering van hoe het veranderde gebruik van celingangsroutes door de SARS-CoV-2 Omicron-variant de werkzaamheid en synergie van TMPRSS2 en cathepsine B/L-remmers kan beïnvloeden. Voordruk op https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY et al. SARS-CoV-2 Omicron-variantreplicatie in menselijke bronchiën en longen ex vivo. Natuur 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. et al. Evaluatie van het binnendringen van SARS-CoV-2, ontstekingen en nieuwe therapieën in menselijke longweefselcellen. PLoS-pathog. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. et al. De SARS-CoV-2 Omicron-variant vertoont minder efficiënte replicatie- en fusie-activiteit vergeleken met de Delta-variant in TMPRSS2-tot expressie gebrachte cellen. Opduiken. Microben infecteren. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. et al. De rol van NSP6 in de biogenese van het SARS-CoV-2-replicatieorganel. Natuur 606, 761–768 (2022).

47. Zon, X. et al. SARS-CoV-2 niet-structureel eiwit 6 veroorzaakt NLRP3-afhankelijke pyroptose door zich te richten op ATP6AP1. Celdood verschilt. 29, 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Coronavirus NSP6 beperkt de expansie van autofagosoom. Autofagie 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. et al. Evolutionaire analyse van SARS-CoV-2: hoe mutatie van niet-structureel eiwit 6 (NSP6) virale autofagie zou kunnen beïnvloeden. J. Infecteren. 81, e24-e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC RNA-replicatie van muizenhepatitisvirus vindt plaats bij dubbelmembraanblaasjes. J. Virol 76, 3697-3708 (2002).

51. Liu, Z. et al. Identificatie van SARS-CoV-2-piekmutaties die de neutralisatie van monoklonale antilichamen en serumantilichamen verzwakken. Celgastheermicrobe 29, 477–488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: een sterk gemuteerde SARS-CoV-2-variant vertoont een sterkere binding aan ACE2 en ontsnapt krachtig aan goedgekeurde COVID-19 therapeutische antilichamen. Voorkant. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. Cryo-EM-structuur van een SARS-CoV-2 omicron-spike-eiwit-ectodomein. Nat. Gemeenschappelijk. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM et al. Activiteit van herstellend serum en vaccinserum tegen SARS-CoV-2 Omicron. Natuur 602, 682–688 (2022).