Structurele karakterisering en beoordeling van ontstekingsremmende en anti-tyrosinase-activiteiten van polyfenolen van Melastoma Normale, deel 2

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Verbinding 3 had dezelfde molecuulformule als verbinding 2, zoals bepaald door zijn HRESIMS-gegevens. Vergelijking tussen de NMR-gegevens van 3 en 2 (Tabel 2) onthulde dat de methoxylgroep op galloyl-C-4 in 2 verschoof naar galloyl-C-3' in 3. Dit werd bevestigd door de HMBC-correlaties (Figuur 2) van de methoxylprotonen (8y 3.88) en aromatische protonen (bH7.24) met galloyl-C-3'(6c 149.1) in 3, en de chemische verschuivingen van de methoxylgroep, galloyl-C{ {24}}, galloyl-C-4 en galloyl-C-3' die verschoven van bc60.8,151.5,141.3 en 146.5 in respectievelijk 2tobc56.7,146.6,140.7 en 149,1 in3. Een positief katoeneffect bij 237 nm en een negatief effect bij 262 nm in het CD-spectrum gaven de (S)configuratie van de HHDP-groep aan voor 3 [24]. De configuratie van de suikergroep werd afgeleid uit de koppelingsconstante (=8,5 Hz) van het anomere proton van de glucosylgroep. Zure hydrolyse van 3 met 1 M HCl leverde D-glucose op, wat werd bevestigd door TLC- en GC-analyses. Daarom werd verbinding 3 geïdentificeerd als 1-O-galloyl-6-O-(3-methoxygalloyl)-2,3-O-(S)-hexahydroxydifenoyl{{ 66}}D-glucose.

De molecuulformule van 4 werd afgeleid uit het HRESIMS-spectrum (m/z 783.1032, [MH]-) als C35 H28 O21. Het molecuulgewicht was 16 massa-eenheden minder dan dat van 3, wat kan worden toegeschreven aan de afwezigheid van een hydroxyl en de aanwezigheid van een aromatisch proton (6H6.87) op vanilloyl-C-5' in 4 (Tabel 2) . Dit werd bevestigd door de aanwezigheid van een 1,2,4-trigesubstitueerde aromatische groep （μ7.60 （dd, J=8.3,1.8 Hz）,6.87 （d, J=8 0,3 Hz） en 7,57 （d, J=1,8 Hz）） en de chemische verschuivingsverandering van galloyl-C-5' bij δc 145,8 in 3 naar vanilloyl-C-5 ' bij bc 115,9 in 4. De methoxylprotonen (6H 3,90) en aromatische protonen (H 6,87) correlaties met vanilloyl-C-3' in het HMBC-spectrum (Figuur 2) bevestigden verder het aromatische proton (H 6,87) bij vanilloyl-C-5'. Het atropisomerie van de HHDP bleek een S-configuratie te zijn door het verschijnen van positieve en negatieve katoeneffecten bij respectievelijk 239 nm en 263 nm [24]. De koppelingsconstanten van het anomere proton in 4 waren 8,5 Hz, wat doet denken aan -anomeerconfiguratie. De zure hydrolyse onthulde dat 4 dezelfde suikereenheden had als 3. Verbinding 4 werd dus geïdentificeerd als 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O- (S)-hexahydroxydifenoyl- -D-glucose.

Klik hier om meer te weten

2.2. Anti-inflammatoire activiteitstests

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM. Er is gemeld dat de bekende flavonolen kaempferol(7)[26[, quercetine (10)[27l en myricetine-3-O- -L-rhamnopyranoside(12)28 een ontstekingsremmende werking hebben, maar kaempferol -3-rhamnoside (8) [26] en quercetine-3-O- -L-rhamnoside (11)[29] hebben geen ontstekingsremmende werking. Uit de experimentele resultaten en literatuurgegevens blijkt dat de flavonoïden in de titelplant een betere ontstekingsremmende activiteit hebben dan ellagitannines, het kan het actieve ingrediënt zijn dat overeenkomt met het ontstekingsremmende effect van deze plant.

2.3. Tyrosinase remmende activiteitstests

Alle verbindingen werden onderzocht op mogelijke tyrosinaseremmende activiteit. Zoals weergegeven in Tabel 3, vertoonden nieuwe verbindingen 2-4 matige tyrosinaseremmende activiteiten. Nieuwe verbinding 1 vertoonde een zwakke tyrosinaseremmende activiteit. Quercetine (10)[30] heeft een significante tyrosinaseremmende activiteit en de anti-tyrosinaseactiviteit is beter dan quercetine-3-OwL-rhamnoside(11)[26] en kaempferol (7) [26], wat consistent is met de literatuurgegevens. Dit gaf aan dat 3'- en 4/-hydroxygroepen op de B-ring en 3-hydroxygroepen op de C-ring in flavonolen cruciaal waren voor hun activiteiten. De anti-tyrosinase-activiteit van kaempferol (7)[26] is beter dan kaempferol-3-rhamnoside (8)[26] en verbindingen 8 en 12 [31] hebben geen significante anti-tyrosinase-activiteit, wat het bovenstaande verder ondersteunt structuur-activiteit relaties.

3. Experimenteel 3.1.Materialen

De wortels van M.normale werden in september 2018 verzameld in Yanshan Town, Guilin City, provincie Guangxi, en geverifieerd door professor Yusong Huang (Guangxi Institute of Botany). Een voucher-exemplaar (20180912) werd gedeponeerd in het Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangxi Institute of Botany, China.

Cistanche kan de immuniteit verbeteren

3.2. Algemene experimentele procedures

Optische rotaties werden gemeten met een ADP440 plus polarimeter （λ 589 nm, padlengte 1.0 cm). De NMR-spectra werden verkregen op een Bruker Advance 500 spectrometer "Bruker Biospin AG, Fällanden, Zwitserland" en de resterende oplosmiddelpieken werden als referentie gebruikt. Koppelingsconstanten en chemische verschuivingen werden respectievelijk gegeven in Hz en op een δ（ppm-schaal. De ESIMS- en HIRESIMS-gegevens werden geregistreerd op respectievelijk een BRUKER HCT-massaspectrometer en LCMS-IT-TOF-spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). GC werd uitgevoerd op een Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, VS) systeem met een 0,32 mm id × 25 ml-Chirasil-Val-kolom. Analytische HPLC werd uitgevoerd op een Shimadzu LC -2030C HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) systeem met behulp van een 4, 6id x 250 mm Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um) kolom. semi-preparatieve HPLC werd uitgevoerd op een Shimadzu LC-20AT HPLC-systeem met behulp van een 20,0id x 250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) kolom met een stroomsnelheid van 4 ml/min. Kolomchromatografie (CC) werd uitgevoerd met behulp van Sephadex LH-20 25-100 m; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Zweden）, silicagelkolom (200-300 mesh, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, China), MCI-gel CHP 20P(75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tokyo, Japan) en Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Duitsland) kolommen.

3.3. Extractie en scheiding

Aan de lucht gedroogde, poedervormige wortels (10 kg) van M. normale werden geëxtraheerd met 8{{2{0}} procent waterige aceton (3 x 7 dagen) bij kamertemperatuur en elk extract werd gefiltreerd. De filtraten werden onder verminderde druk gedroogd om een ​​ruw extract op te leveren (0,6 kg). Het extract werd gesuspendeerd in H20 (1 L) en achtereenvolgens verdeeld met petroleumether (3 x 2 L), EtOAc (3 x 2 L). Het EtOAc-extract (8 {{4 0}} g) werd verdeeld in tien fracties ( Fr.1-10)door silicagel CC (8 id×20 cm) eluerend met een gradiënt van CH2Cl-MeOH(100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4 (32 g) werd geladen op een MCI-gelkolom (6i.d.×20 cm) en geëlueerd met een gradiënt van MeOH-H,O（0∶100-100∶0,v/ø）to verkrijg achttien subfracties（Fr4-1-4-18）. Scheiding van subfracties Fr4-14(3.0g) werd gedaan door een andere silicagelkolom (3i.d.×20 cm) te elueren met een gradiënt van CH2Cl{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) en Sephadex LH-20 CCelutie met CH2Cl2-MeOH(1:1,v/o) om 7 (11,3 mg) te verkrijgen ),8 (10,6 mg),9 (9,3 mg),10 (20,6 mg),11 (7,6 mg) en 12 (6,2 mg). Fr 6 (4,2 g) werd aangebracht op de ODS C18-kolom en geëlueerd met MeOH-H20 (20:80-80:20) om 9 subfracties te verkrijgen (Fr 6-1-6-9). Verdere scheiding van subfractie Fr 6-4(1.2 g)met Sephadex LH-20 CC(geëlueerd met MeOH-H2O,10:90-100:0)leverde verbindingen 1(9,6 mg),5( respectievelijk 7,2 mg) en 6 (7,3 mg). Verbindingen 2 (tR 130,5 min, 5,2 mg), 3 (tR 146,8 min, 9,6 mg) en 4 (tR 177,2 min, 15,3 mg) werden verkregen uit Fr7 (2,5 g) via semi-preparatieve HPLC-eluering met een gradiënt van MeOH-H2O( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4.Spectroscopische gegevens

Whisky tannine C (1): Bruin amorf poeder; [ ]-12.6 graad (c= 0.16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203（2.02）,276（1.19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1Hand 13C NMR-gegevens, zie tabel 1;HRESIMSm/z:[MH]{{24} }.1240(berekend voor C4sH33O27-, 1005.1215). 1-O-(4-methoxygalloyl)-6-O-galloyl-2,3-O-(S)-hexahydroxydifenoyl- -D-glucose( 2): Bruin amorf poeder amorf poeder; 【 】5-5.5 graden （c=0.17, MeOH）; UV（MeOH） 入max nm （log e）∶203 （2,52）,275（2,01）; CD （MeOH）λmax（△8）264（-8.0）,238（30.6）,218（1.3）.'H en 13C-NMR-gegevens, zie tabel 2; HRESIMS m/z:799.0983[MH]- (berekend voor C3sH2022-, 799.099).

{{0}}O-galloyl-6-O-(3-methoxygalloyl)-2,3-O-(S)-hexahydroxydifenoul-6- D-glucose (3); Bruin amorf poeder;【 】7-33.5 graden （c=0.12, MeOH）; UV（MeOH）入max nm（log e）∶203 （2,40）,273（1,68）; CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR-gegevens, zie Tabel 2;HRESIMS m/z:799.1006 [MH]-(berekend voor C35H2O22-,799.0999). 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O-(S)-hexahydroxydifenoyl- -D-glucose (4): Bruin amorf poeder; 【 】7-20.6 graden （c=0.15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm （log e）∶203 （2.42）,278（1.86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）,239 （42.5）, 219（0.9）.'H en 13CNMR data, zie Tabel 2;HRESIMS m/z: 783.1032 [MH]- (berekend voor C35H27O21-,783,1050).

3.5. Zure hydrolyse van 2-4

Verbinding 2 (2 mg) werd gedurende 4 uur behandeld met 1 M HC1 (5 ml) bij 80 graden en vervolgens geëxtraheerd met ethylacetaat (3 x 5 ml). De waterige fase werd gedroogd onder een stroom N2 om een ​​neutraal residu te genereren dat werd geanalyseerd met behulp van TLC (Si02) met EtOAc-pyridine-EtOH-H, O (7:1:1:2) als oplosmiddelsysteem. De R-waarde van het neutrale residu was dezelfde als die van authentieke D-glucose, wat aangeeft dat de suikercomponent van 2 glucose was. Het neutrale residu en 5 mg L-cysteïnemethylester-hydrochloride werden achtereenvolgens opgelost in 3 ml watervrije pyridine en gedurende 1 uur op 80°C verwarmd. Na verwijdering van het oplosmiddel door verdamping onder verlaagde druk, liet men het reactiemengsel vervolgens 1 uur reageren met 0,6 ml N-trimethylsilylimidazool bij 80°C. Het reactiemengsel werd verdeeld over n-hexaan en H,O en vervolgens werd de n-hexaanlaag geanalyseerd met een GC-instrument. De injector- en detectortemperaturen waren respectievelijk ingesteld op 250 graden en 280 graden. De aanvankelijke kolomtemperatuur werd gedurende 1 minuut op 160°C gehouden, daarna verhoogd tot 280°C met 5°C/min, en 10 minuten gehouden. De authentieke D-glucose en authentieke L-glucose werden op dezelfde manier gesilyleerd en geanalyseerd, en hun retentietijden waren respectievelijk 19,09 en 19,25 min. De resultaten van de GC-analyse gaven aan dat de suikercomponent van 2 D-glucose was (t 19,1 min). De suikercomponenten van 3 en 4 werden bepaald met dezelfde procedure.

3.6. Anti-inflammatoire activiteit

3.6.1.GEEN productie door LPS-gestimuleerde RAW 264.7-cellen

De RAW 264,7-cellen werden 24 uur gekweekt in DMEM aangevuld met 10 procent FBS bij 37 graden in een bevochtigde atmosfeer van 5 procent CO2. Cellen in een 24-putjesplaat (5x104 cellen/putje) werden behandeld met 200 ng/ml LPS en de testverbindingen. Na 22 uur werden de media verzameld en werd het nitrietgehalte gemeten met behulp van het Griess Reagent System (Promega, Madison, WI, VS).

3.6.2. levensvatbaarheid van de cel

MTT-assay werd uitgevoerd om de cytotoxiciteit van testmonsters op de RAW264.7-cellijn te meten. Cellen die zich in de logaritmische groeifase bevonden, werden gezaaid in een 96-putjesplaat met een dichtheid van 5×10 plus -6×10* cellen/putje en geïncubeerd bij 37 graden met 5 procent CO, gedurende 24 h. Vervolgens werden de cellen gedurende 24 uur behandeld met 100 L kweekmedium bij verschillende concentraties testmonsters. Het medium werd weggegooid en 100 µl FBS-vrij medium met MTT (1 mg/ml) werd aan elk putje toegevoegd. Na incubatie in de incubator gedurende 4 uur, werd het supernatant weggegooid en werd 100 L DMSO aan elk putje toegevoegd om de formazan op te lossen. De absorptie werd gemeten bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer.

3.7. Anti-Ty/rosinase-activiteit

De anti-tyrosinase-activiteiten van de isolaten werden onderzocht volgens de procedure beschreven door Aoki et al. met kleine aanpassingen [21]. L-DOPA en kojiczuur werden respectievelijk als substraat en positieve controle gebruikt. Oplossing van L-DOPA bij 5.0 mM, paddestoeltyrosinase bij 100 U/mL, evenals monsters in verschillende concentraties werden bereid in fosfaatbuffer （pH6.8）.20 μL van de monsteroplossing en 10 μL tyrosinase-oplossing van de paddenstoel werden gemengd en gedurende 10 minuten bij 37°C voorgeïncubeerd, vervolgens werd 40 L L-DOPA-oplossing toegevoegd en gedurende 5 minuten bij 37°C geïncubeerd. Het reactiesysteem van het anti-tyrosinase-activiteitsexperiment wordt getoond in Tabel 4. De absorptie werd gemeten bij 475 nm met behulp van de Spark 10M multimode microplaatlezer (Tecan Trading AG, Zürich, Zwitserland). Alle testen werden drie keer herhaald en elke keer in drievoud. Het percentage remming van tyrosinase-activiteit werd berekend met behulp van de volgende formule:

waarbij T de absorptie met monster en tyrosinase voorstelt; Om de absorptie weer te geven met een monster maar zonder tyrosinase; C staat voor de absorptie met tyrosinase maar geen monster; Co vertegenwoordigt de absorptie zonder tyrosinase en monster.

4. Conclusies

De studie is bedoeld om meer ontstekingsremmende en enzymremmende activiteiten van polyfenolen uit de wortels van M.normale te onderzoeken op basis van onze eerdere werken [20]. Zoals verwacht werden voor het eerst twaalf polyfenolen uit de tegelplant gehaald en was verbinding 1-4 nieuw ellagitannine. De succesvolle isolatie en structuuridentificatie van ellagitannine levert materialen voor de screening van ontstekingsremmende geneesmiddelen en enzymremmers en draagt ​​ook bij aan de ontwikkeling en het gebruik van M.normale. Ellagitannines 1-4 hebben geen significante tyrosinaseremmende en ontstekingsremmende werking, waardoor het minder waarschijnlijk een potentieel ontstekingsremmend geneesmiddel of enzymremmer is. Gelukkig hebben ze nieuwe effecten, zoals anti-obesitas [6,7]. Flavonoïden hebben betere ontstekingsremmende en remmende enzymactiviteiten dan ellagitannines in de wortels van M. normale, en het is waarschijnlijker dat ze ontstekingsremmende en anti-enzymremmers zijn. De studie van de structuur-activiteitsrelatie is nuttig om nieuwe ontstekingsremmende geneesmiddelen en enzymremmers te vinden.

Dit artikel is afkomstig uit Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules