Structureel verschillende polymorfen van Tau-aggregaten onthuld door infraroodspectroscopie op nanoschaal

Abstract

Aggregatie van het tau-eiwit speelt een centrale rol bij verschillende neurodegeneratieve ziekten die gezamenlijk bekend staan ​​als tauopathieën, waaronder de ziekte van Alzheimer en Parkinson. Tau vouwt verkeerd in fibrillaire beta-sheetstructuren die de gepaarde spiraalvormige filamenten vormen die worden aangetroffen in neurofibrillaire knopen. Het is bekend dat er significante structurele heterogeniteiten kunnen zijn in tau-aggregaten geassocieerd met verschillende ziekten.

Hoewel structuren van volwassen fibrillen zijn bestudeerd, zijn de structurele verdelingen in tau-aggregaten in een vroeg stadium niet goed begrepen. In de huidige studie gebruiken we AFM-IR om spectra op nanoschaal van individuele tau-fibrillen in verschillende aggregatiestadia te onderzoeken en de aanwezigheid van meerdere fibrillaire polymorfen aan te tonen die verschillende secundaire structuren vertonen. We laten verder zien dat volwassen fibrillen aanzienlijke hoeveelheden antiparallelle beta-vellen bevatten. Onze resultaten zijn de allereerste toepassing van infraroodspectroscopie op nanoschaal op tau-aggregaten en onderstrepen de belofte van ruimtelijk opgeloste infraroodspectroscopie voor het onderzoeken van eiwitaggregatie.

De ziekte van Alzheimer is een neurodegeneratieve ziekte met een hoge incidentie, en de belangrijkste pathologische kenmerken zijn ernstig verlies van neuronen en synapsen en accumulatie van -amyloïde (-amyloïde) en Tau-eiwit (een met microtubuli geassocieerd eiwit) in de hersenen. Deze eiwitten vormen volwassen fibrilstructuren tijdens ziekteprogressie en de eiwitvezels van deze structuur kunnen leiden tot neuronale dood en cognitieve achteruitgang. Rijpe fibrillen spelen een grotere rol bij ziektevorming dan -amyloïde en Tau-eiwitten. Dit komt omdat de vorming van volwassen fibrillen het eindpunt is van het pathogene mechanisme, dat het verlies van neuronen en synapsen tijdens ziekteprogressie verder verergert en de progressie van de ziekte versnelt. Daarom zijn voor het onderzoek naar en de ontwikkeling van de behandeling van de ziekte van Alzheimer ook het onderzoek naar en de verkenning van rijpe fibrillen een onderzoekshotspot geworden. In ons onderzoek ontdekten we dat Cistanche effectief is bij de behandeling van de ziekte van Alzheimer. Cistanche bevat een grote hoeveelheid anthocyanines en flavonoïden, die een sterke antioxiderende werking hebben. Deze ingrediënten kunnen de productie van vrije radicalen helpen verminderen en hersencellen beschermen tegen oxidatieve schade, waardoor de kans op neurodegeneratie wordt verkleind.

Klik op cistanche deserticola-supplement

Trefwoorden

Tau; aggregatie; Ziekte van Alzheimer; AFM-IR; IR-spectroscopie op nanoschaal; AFM; fibril structuur; antiparallelle bètabladen.

Het verkeerd vouwen en aggregeren van tau-eiwitten tot fibrillaire aggregaten is het pathologische kenmerk van veel neurodegeneratieve ziekten die tauopathieën worden genoemd, waaronder de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson1-5. Tau is een microtubuli (MT)-geassocieerd eiwit dat zich verkeerd vouwt tot onoplosbare cellulaire afzettingen die Neurofibrillaire Tangles (NFT's) worden genoemd1-2, 5-6.

Hoewel vroeg bewijs wees op de potentiële neurotoxiciteit van NFT's, wordt nu aangenomen dat prefibrillaire oligomere assemblages de belangrijkste neurotoxische soorten zijn3, 5-6. Opheldering van specifieke tau-fibrillatieroutes kan inzicht verschaffen in ziektemechanismen en potentiële therapeutische doelen voor het ontdekken van geneesmiddelen onthullen. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om de aggregatie van tau te begrijpen en de rol van verschillende factoren die de aggregatie moduleren1-2, 7-18. De rol van andere amyloïde-eiwitten, bijvoorbeeld amyloïde beta bij het veranderen van de tau-conformatie, is ook onderzocht19-21. Het is bekend dat tau-filamenten in NFT's een cross-beta-structuur hebben die lijkt op amyloïde plaques. Het volledig ophelderen van de structurele evolutie van tau die resulteert in fibrilvorming blijft echter een uitdaging.

In het menselijk brein zijn zes verschillende tau-isovormen geïdentificeerd die verschillen wat betreft het aantal aminozuurresiduen2, 5, 22. De dominante isovorm en fibrillaire structuur kan variëren met ziekte2, 22. Alle tau-isovormen zijn grote polypeptiden en vertonen daarom structurele flexibiliteit. Daarom is er veel onderzoeksinteresse gericht op korte peptiden die de microtubuli-bindende domeinen vertegenwoordigen, die essentieel zijn voor tau-aggregatie23-25 in plaats van de eiwitten met de volledige lengte. Bovendien vertonen tau en zijn isovormen polymorfisme: in wezen dezelfde peptide-aggregaten in verschillende fibrillaire structuren, die niet alleen verschillen wat betreft morfologie maar ook wat betreft moleculaire rangschikking8-9, 26-27. Alle bovenstaande factoren maken isolatie en structurele analyse van specifieke tau-aggregaten gevormd in verschillende stadia van de aggregatie een moeilijke taak. De aard van amyloïde-aggregatie in het algemeen is zodanig dat het een overvloed aan geaggregeerde soorten genereert die van voorbijgaande aard zijn en met elkaar in evenwicht zijn. Onlangs is cryo-EM met succes toegepast voor het oplossen van tau-fibrillaire structuren; de toepassingen ervan blijven echter beperkt tot in wezen volgroeide fibrillen die het eindpunt van aggregatie zijn, en geen tussenproducten9-10.

Met name de structurele aspecten van tau-tussenproducten in een vroeg stadium worden niet goed begrepen. De gouden standaard voor het bepalen van de secundaire structuur van amyloïde-achtige aggregaten zijn in het algemeen spectroscopische technieken zoals solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) en Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)15, 28-31. Geen van deze technieken is echter in staat om ruimtelijke resolutie te bieden op de schaal van individuele aggregaten, en zonder ruimtelijke resolutie is het moeilijk om ondubbelzinnig spectrale kenmerken toe te schrijven aan specifieke aggregaten of morfologieën of om te bepalen welke voorbijgaande soorten evolueren naar een bepaalde morfologie. In wezen is het niet mogelijk om te bepalen of waargenomen spectrale kenmerken voortkomen uit een bepaalde aggregatietoestand of een statistische mix van verschillende conformaties.

Dientengevolge zijn alleen gemiddelde structuren van oligomeren en fibrillen bekend, en worden structurele variaties heterogeniteiten binnen elke toestand, indien aanwezig, niet goed begrepen. Om onze kennis van de aggregatie van tau en andere amyloïdogene eiwitten onder verschillende omstandigheden te vergroten, is het absoluut noodzakelijk om de structuur van elk lid van het conformationele ensemble in verschillende stadia van aggregatie te begrijpen. In het afgelopen decennium zijn nieuwe benaderingen ontwikkeld voor het verbeteren van de ruimtelijke resolutie van vibratiespectroscopie die infraroodspectroscopie combineren met AFM om een ​​resolutie op nanometerschaal te bereiken.

Een van de meest recent ontwikkelde op AFM gebaseerde benaderingen maakt gebruik van fotothermische geïnduceerde resonantie (PTIR), waarbij de lokale thermische uitzetting als gevolg van infraroodabsorptie door een monster wordt waargenomen door een AFM-tip 32-35. Fotothermische AFM-IR omzeilt dus resolutielimieten in conventionele IR-microscopie door de punt van een AFM-sonde te gebruiken om infraroodabsorptie te meten. Absorptie van straling door resonante excitatie van een infraroodmodus leidt tot een thermische uitzetting van het monster, waardoor een impulsieve kracht op de AFM-cantilever ontstaat. De resulterende respons van de AFM-sonde is evenredig met de infraroodabsorptie en het scannen van de golflengte levert een infraroodabsorptiespectrum op dat overeenkomt met een gebied op nanoschaal van het monster (Afbeelding 1).

Dus, in tegenstelling tot conventionele optische technieken, kan AFM-IR structuren op nanoschaal onderzoeken met ongekende chemische details en combineert het het beste van twee werelden: de ruimtelijke resolutie van AFM en de chemische resolutie van infrarood. Hoewel AFM-IR is gebruikt om aggregaten van amyloïdogene peptiden zoals bèta-amyloïde en alfa-synucleïne35-38 te bestuderen, is het nooit toegepast om de aggregatie van tau te bestuderen. In deze studie maken we gebruik van de mogelijkheden van AFM-IR en onderzoeken we fibrillen van de tau-441-isomeer in verschillende stadia van aggregatie om aan te tonen dat er in de vroege stadia van aggregatie een aanzienlijke heterogeniteit is in de fibrillaire structuur, zelfs zonder significante variaties. in de morfologie. Onze resultaten tonen voor het eerst aan dat er onderliggende verschillen kunnen zijn in de secundaire structuur van fibrillen die dezelfde morfologie vertonen. Er worden meerdere structureel verschillende fibrilpolymorfen waargenomen; de ene meer structureel geordend dan de andere, wat ook van voorbijgaande aard is en niet wordt aangetroffen in volwassen fibrillen. Verder tonen we ook aan dat tau-fibrillen antiparallelle beta-sheets kunnen bevatten, die doorgaans niet geassocieerd zijn met fibrillaire morfologieën.

Om de structurele evolutie van fibrillen in de loop van de tijd te begrijpen, hebben we fibrillen op verschillende tijdstippen van aggregatie onderzocht, namelijk na 3, 5, 10 en 15 dagen aggregatie. Voor elke meting werden aliquots afgezet op goudsubstraten en gedroogd onder stikstof. AFM topografische beelden van tau-fibrillen na 3 dagen incubatie bij 37 graden worden weergegeven in figuur 2. Figuur 2A toont een representatief fibrilcluster. Meer AFM-afbeeldingen van individuele fibrillen in alle verschillende aggregatiestadia worden getoond in figuur S1-S5. Om de totale hoogteverdeling van de fibrillen in het monster te verkrijgen, werden de hoogtewaarden van de individuele fibrillen gemeten en uitgezet als een histogram (Figuur 2B). De gegevens werden voorzien van een Gaussiaan om de gemiddelde hoogtewaarde van 6,3 ± 0 0,7 nm te bepalen. AFM-afbeeldingen van 5-dagfibrillen en bijbehorende hoogteanalyse worden weergegeven in afbeelding 2C-D. Individuele fibrillen samen met fibrilclusters worden waargenomen. De hoogte van de fibrillen is 6,5 ± 0,9 nm, wat dicht bij die van het 3-dagfibrillenmonster blijft.

Vervolgens werden tau-fibrillen met {{0}}dag incubatie onderzocht (Figuur 2E-F). Individuele fibrillen werden waargenomen op het goudoppervlak (Figuur 2E). De gemiddelde hoogte van 10-dagfibrillen is 7,2 ± 1,0 nm. Rijpe tau-fibrillen, gegenereerd na 15 dagen aggregatie, worden weergegeven in figuur 2G. De 15-dagfibrillen zijn lang en verward met elkaar en genereren een netwerkachtige morfologie. In dit aggregatiestadium zijn afzonderlijke fibrillen niet langer zichtbaar. De gemiddelde fibrilhoogte is 42,5 ± 40,5 nm (Figuur 2H), wat aanzienlijk hoger is in vergelijking met de andere fibrillen die op de eerdere tijdstippen zijn gegenereerd. De brede verdeling van de hoogte van fibrillen geeft aan dat volwassen fibrillen verschillende hoogtewaarden hebben, in tegenstelling tot de smalle verdeling van eerdere fibrillen. De hier waargenomen fibrillaire structuren komen overeen met eerdere AFM-rapporten over tau-aggregatie11, 39-40. Een andere belangrijke observatie van de AFM-metingen is dat de tau-fibrillen die in de oplossing worden gegenereerd homogeen zijn in hun morfologie.

Ze zijn recht, zonder enige vorm van vertakking of gedraaide conformaties, met minimale hoogteveranderingen binnen één vezel. Met fibrilrijping zien we een toename van de fibrilhoogte, maar er ontwikkelen zich geen nieuwe morfologieën. Dit kan worden gevisualiseerd in afbeelding S5, waar 3-dag- en 10-dagfibrilmorfologieën worden weergegeven in een regenboogkleurenkaart, wat aantoont dat ze binnen één fibril minimale hoogteveranderingen hebben. Hoewel de fibrillen geen significante morfologische verschillen vertonen, bevatten de IR-spectra op nanoschaal van fibrillen significante verschillen.

Met name voor de 3-dagfibrillen zien we drie verschillende fibrilpolymorfen met verschillende spectra. Voor 5-dag-, 10-dag- en 15-daggerijpte fibrillen nemen we slechts één conformatie waar. We merken op dat typisch polymorfisme wordt gebruikt om morfologisch verschillende fibrillen aan te duiden die ook verschillend kunnen zijn wat betreft de moleculaire structuur2, 26; in ons geval is de morfologie onveranderlijk, maar de fibrillen kunnen op basis van hun spectra worden onderverdeeld in drie verschillende subtypen. Voor de duidelijkheid verwijzen we naar deze structuren/polymorfen als respectievelijk Type 1, Type 2 en Type 3 voor de rest van dit artikel. Representatieve infraroodspectra in het amide-I-bereik worden weergegeven in figuur 3. De spectra zijn het gemiddelde van meerdere metingen langs de lengte van de fibrillen. Meer spectra zijn te vinden in de ondersteunende informatie (figuur S6). Het spectrum van het 3-dagfibriltype-1 bevat een prominente piek bij ~1628 cm−1 en een kleinere schouder bij ~1670 cm−1.

Bovendien is er een zwakke band te zien op ~1740 cm-1. Het spectrum van het fibriltype-2 is significant verschillend en bevat een verbrede asymmetrische amide-I-band gecentreerd op ~1650 cm-1. Er wordt geen significante intensiteit waargenomen boven 1700 cm−1. Voor fibriltype-3 zien we een amide-I-spectrum dat erg lijkt op type-2, met één belangrijke uitzondering: de aanwezigheid van een prominente band op ~1738 cm-1. Het is interessant om op te merken dat de fibrilspectra, met uitzondering van de type-1 polymorf, geen scherpe piek bevatten bij typische beta-sheetfrequenties van ~1630 cm−1, ook al is bekend dat fibrillaire aggregaten in-register parallel beta zijn lakens. De bredere lijnbreedte die wordt waargenomen voor type 2- en type 3-fibrillen, naast het ontbreken van een scherpe piek bij beta-velfrequenties, zou wijzen op de aanwezigheid van structurele wanorde.

Interessant genoeg vonden we geen grote variantie in spectra langs een enkele fibril (Figuur S5), wat aangeeft dat de fibrillen goed gedefinieerde structuren zijn en intrinsieke structurele stoornissen hebben. In deze context moet worden opgemerkt dat er variaties zijn in spectra langs fibrillen, in het bijzonder voor type-3 fibrillen zoals blijkt uit de grotere spectrale standaarddeviatie (Figuur 3). Het belangrijkste verschil tussen de drie fibril-subtypen is echter de intensiteit van de banden op 1628 cm-1 en 1738 cm-1. De hierboven genoemde variaties hebben geen invloed op de classificatie van fibrillen in het ene of het andere subtype.

De 5-dag-, 10-dag- en 15-dagrijpe fibrillen vertonen geen enkele spectrale heterogeniteit en voor elk geval wordt een enkele polymorf waargenomen (Afbeelding 3). Het 5-dagfibrillenspectrum is enigszins verschoven (~6cm−1) naar hogere golfgetallen in vergelijking met type 2- en type 3-fibrillen en vertoont ook een grotere lijnbreedte. De 10-dag en 15-dag gerijpte fibrillen hebben spectra die vergelijkbaar zijn met die van de type 2 fibrillen, waarbij de laatste verschoven is naar hogere golfgetallen met ~4cm−1. Alle 5-dag-, 10-dag- en 15-dagfibrillen missen een duidelijke piek boven 1700 cm-1.

Het belangrijkste inzicht uit de fibrilspectra is dat tijdens de vroege stadia van rijping er aanzienlijke heterogeniteit in fibrilstructuur kan zijn, en na rijping evolueren de fibrillen naar een enkele structuur. Het is echter moeilijk om de exacte onderliggende structurele veranderingen precies te begrijpen door alleen de spectra te inspecteren. Om meer inzicht te krijgen in de spectrale en structurele variaties tussen de waargenomen polymorfen, werden de spectra gedeconvolueerd door de spectrale aanpassing. Amide I-spectra van eiwitten bevatten meestal bijdragen van verschillende secundaire structuren41-42.

Omdat de secundaire structuur die bijdraagt ​​​​aan elk van de waargenomen spectra niet precies a priori bekend is, hebben we ons gericht op de tweede afgeleide spectra om het aantal pieken te bepalen (Figuur S8). Het gebruik van de tweede afgeleide van spectrale gegevens om onderliggende pieken te bepalen, is een bekende praktijk in spectroscopie43-44. We gebruikten het aantal pieken in de tweede afgeleide spectra en hun overeenkomstige frequenties als uitgangspunt voor spectrale aanpassing. De fitresultaten voor de gemiddelde spectra van de 3-dag, 5-dag, 10-dag en 15-dag volgroeide fibrillen worden weergegeven in afbeelding 4A-F. De procentuele bijdragen van de gemonteerde pieken aan de totale spectra worden weergegeven in figuur 4G-L. De spectra zijn genormaliseerd naar maximale intensiteit, maar dat schaalt elke subband gelijk voor een bepaald spectrum. Daarom worden de relatieve populaties van de banden, zoals weergegeven in figuren 4G-L, niet beïnvloed door normalisatie. De pasvormparameters worden gegeven in ondersteunende tabel 1.

Voor de type-1 3-dagfibrillen passen drie Gauss-banden beide spectra met hoge getrouwheid, met middenfrequenties op 1628 cm-1, 1659 cm-1 en 1670 cm-1. Het type-2 3-day fibril-spectrum past op vijf onderliggende banden, met frequenties 1626 cm-1, 1642 cm-1, 1662 cm-1, 1680 cm-1 en 1694 cm-1. Zoals verwacht op basis van de spectrale gelijkenis, past het type -3 fibril in dezelfde vijf banden, maar heeft het ook een extra piek nodig op 1736 cm-1. Als we onze analyse van spectrale deconvolutie uitbreiden naar meer volwassen fibrillen, zien we dat 5-dag-, 10-dag- en 15-dagfibrillen in wezen allemaal dezelfde verdeling van secundaire structuren bevatten. De 5-dag-, 10-dag- en 15-dag-fibrilspectra hebben allemaal zes banden nodig voor een optimale aanpassing, waarbij de piek met hoog golfgetal verschuift naar ~1725 cm−1, en de andere vijf pieken zijn vergelijkbaar met het type-2 fibrillen.

De 1626-1628cm−1-piek in alle passingen kan worden toegeschreven aan beta-sheets, wat aangeeft dat alle fibrillaire polymorfen een beta-sheetstructuur bevatten28, 30, 41-42. De piek van 1642 cm-1 komt meestal voort uit willekeurige spoelen, terwijl de pieken bij ~1660 cm−1 en 1682 cm−1 meestal worden toegewezen aan bèta-windingen 41-42. Alles bij elkaar geeft de spectrale deconvolutie aan dat er bij rijping meer wanorde in de fibrilstructuur is, zoals blijkt uit de toename van de piek van de willekeurige spoel ten opzichte van de piek van de bètalaag. De aanwezigheid van beta-windingen en hun relatieve toename, blijkt uit de intensiteit van de 1660 cm−1 gemonteerde piek, komt overeen met de verwachte cross beta-structuur van de fibrillen. De aanwezigheid van banden bij ~1694cm−1 en ~1725cm−1 is echter enigszins onverwacht. Het eerste wordt doorgaans toegeschreven aan antiparallelle bètasheets41-42, 45 en is waargenomen in bèta-amyloïde45-46- en alfa-synucleïne-oligomeren38. Hoewel antiparallelle beta-sheetstructuren bekend staan ​​om oligomere amyloïde-assemblages, is hun bestaan ​​in fibrillen zelden waargenomen. 2D IR-onderzoeken hebben antiparallelle beta-sheet-handtekeningen geïdentificeerd in synucleïnefibrillen47; specifieke mutanten van beta-amyloïde vertonen ook een antiparallelle beta-sheetstructuur47. Onze resultaten zijn, voor zover ons bekend, de allereerste observatie van antiparallelle beta-sheets voor tau-aggregaten. De antiparallelle beta-sheet piek is opvallend afwezig in de type-1 polymorf. Dit suggereert dat fibrillen ofwel een rigide, goed geordende structuur kunnen aannemen (polymorf type-1) die voornamelijk bestaat uit parallelle bèta-vellen, maar dat verhoogde structurele flexibiliteit en/of wanorde kan leiden tot de vorming van anti-parallelle bèta-vellen.

Het is echter belangrijk op te merken dat de piek van ~1626 cm−1 typisch niet significant verschuift tussen parallelle en antiparallelle bètabladen. Onze resultaten sluiten daarom niet de mogelijkheid uit van parallelle bètavellen in een van de fibrillen waar de piek van ~1694 cm−1 wordt waargenomen. De piek bij ~1725 cm−1 kan niet worden toegeschreven aan een backbone-amidetrilling en komt hoogstwaarschijnlijk voort uit het COOH-gedeelte van zijketencarbonzuren41-42. Recent werk van Pinto en collega's heeft strategieën aangetoond voor het berekenen van het IR-spectrum van de carbonylband van de COOH-groep van asparaginezuur met behulp van hybride kwantum/klassieke computationele methoden48. Hun bevindingen hebben aangetoond dat de geprotoneerde zijketen verschijnt in het gebied van 1700-1780 cm−1 en een frequentieverschuiving van 5-10 cm−1 kan worden gebruikt als een sonde voor de interactie tussen de zijketen en de ruggengraat. De Tau 441-peptidesequentie heeft meerdere carbonzuren, waaronder in de microtubuli-bindende herhalingsdomeinen, waarvan is aangetoond dat ze een grote neiging hebben tot het vormen van bèta-vellen5-6.

AFM-IR-metingen van andere amyloïde-aggregaten hebben vergelijkbare pieken geïdentificeerd36, die zijn toegeschreven aan carbonzuren. Deze carbonzuurband is echter prominenter aanwezig in sommige fibrillen dan in andere: zijn bijdrage aan de algehele piek is alleen het meest significant voor het type-3 3-dagfibrillen en de 5-dagfibrillen, zoals te zien is in Figuur 4. Bij infraroodspectroscopie leidt dipolaire uitlijning in geordende structuren vaak tot een verhoogde intensiteit van absorptiebanden; een relevant voorbeeld is de vorming van geordende bètavellen uit ongeordende peptiden, wat leidt tot scherpe intense banden bij ~1625 cm−1. De aanwezigheid van intense carbonzuurbanden komt dus mogelijk voort uit de structurele ordening van glutamine- en asparaginezuurzijketens. Er zijn echter meerdere carboxylaatzijketens in tau-446 en hun specifieke moleculaire interacties en oriëntaties zijn niet precies bekend voor de hierin waargenomen structuren.

Bovendien is de intensiteit in AFM-IR-spectra evenredig met FTIR32-33, maar de numerieke correlatiefactor tussen AFM-IR en FTIR is niet gerapporteerd voor carbonzuurtrillingen. Daarom zou het correleren van de piekintensiteit met specifieke carboxylzijketens theoretische berekeningen / overwegingen van de AFM-IR-respons nodig hebben die buiten het bestek van dit werk vallen. Het is in deze context ook belangrijk op te merken dat AFM-IR-metingen verschillen van isotrope infraroodspectra die in oplossing zijn verkregen, en dat de spectra gemeten in AFM-IR een convolutie zijn van laserpolarisatie en verlichtingsconfiguratie49-50. Daarom is het moeilijk om de structurele onderbouwing van deze piek precies te identificeren en is er meer onderzoek nodig om hun exacte oorsprong te bepalen. We streven ernaar om dit in toekomstige werkzaamheden aan te pakken.

De aggregatie van tau-isomeren in vitro is in detail onderzocht; de structuur van vroege en/of tijdelijke tussenproducten is echter niet erg goed bekend. Van oligomere soorten in de aggregatie van amyloïde-eiwitten is vastgesteld dat ze zich op of buiten de weg naar fibrilvorming bevinden. Aangezien wordt aangenomen dat fibrillen het eindpunt van aggregatie zijn, worden fibrilstructuren, waaronder verschillende polymorfen daarvan, in het algemeen niet beschouwd als voorbijgaand of afwijkend. Het is bekend dat er heterogeniteit in de fibrillaire structuur bestaat, maar het is bekend dat deze gelijktijdig met morfologische variaties optreedt2, 8, 26, 51. Onze resultaten zijn uniek omdat ze wijzen op variaties in de secundaire structuur van fibrillen, zelfs als er geen waarneembare morfologische verschillen zijn. . We merken op dat behalve fibriltype-1, alle fibrillaire spectra dezelfde set onderliggende banden bevatten, wat aangeeft dat het type -1 fibril een tijdelijk tussenproduct is dat uiteindelijk structurele reorganisatie ondergaat met rijping. Een andere mogelijkheid is dat deze geordende parallelle beta-sheet-polymorfen een 'off-pathway'-structuur vertegenwoordigen, het moet desintegreren in monomere of prefibrillaire aggregaten om opnieuw te worden geïntegreerd in' on-pathway'-fibrillen. We vonden geen significante aanwezigheid van niet-fibrillaire afzettingen in de bestudeerde monsters; de aanwezigen hadden echter een spectrum dat meer lijkt op de ongeordende fibrillen (Figuur S9). Dit is in overeenstemming met de off-pathway-hypothese en suggereert dus dat de andere 3-dag-polymorfen die zijn waargenomen, kunnen worden gezien als on-pathway-aggregaten.

Er moet echter worden opgemerkt dat de hierin gerapporteerde fibrilspectra niet noodzakelijkerwijs het gehele conformatie-ensemble weergeven dat heerst tijdens de aggregatie van tau. Om de structurele evolutie van aggregaten in een vroeg stadium tot volwassen fibrillen precies te verhelderen, is een meer gedetailleerde analyse van aggregatiekinetiek nodig, die we in de toekomst willen aanpakken. De andere intrigerende observatie die mogelijk wordt gemaakt door AFM-IR is de identificatie van antiparallelle beta-sheets in gerijpte fibrillen. Algemeen wordt aangenomen en dit is door vele onderzoeken bewezen, dat amyloïde-aggregaten in een vroeg stadium een ​​antiparallelle structuur kunnen bevatten, die wordt omgezet in parallelle beta-sheet secbeta-sheetuctuur in volwassen aggregaten. We zien een tegenovergestelde trend: aggregaten in een vroeg stadium kunnen geordende parallelle beta-sheets bevatten, terwijl meer volwassen fibrillen antiparallelle beta-sheet beta-sheets bevatten, wat blijkt uit de relatieve populaties van de overeenkomstige piek (figuren 4G-L).

Samenvattend hebben we met behulp van AFM-IR-spectroscopie op nanoschaal aangetoond dat tau-fibrillen aanzienlijke structurele variaties kunnen hebben, vooral in de vroege stadia van aggregatie. De heterogeniteit komt tot uiting in de vorm van structureel verschillende polymorfen, die een vergelijkbare morfologie vertonen maar een andere secundaire structuur. Concreet identificeren we een voorbijgaande geordende parallelle beta-sheebeta-sheete in fibrillen in een vroeg stadium, die na rijping evolueert naar een meer ongeordende fibrilstructuur die antiparallelle beta-sheets bevat. Deze resultaten onderstrepen de noodzaak om spectroscopie te koppelen aan een ruimtelijk opgeloste techniek zoals AFM, aangezien het niet mogelijk is om deze bepaling ondubbelzinnig te maken met ruimtelijk gemiddelde technieken zoals FTIR. De experimentele resultaten die in deze studie worden beschreven, tonen aan dat de tau-fibrillaire aggregaten heterogeen zijn en toekomstig werk zal onderzoeken of deze polymorfen blijven bestaan ​​onder verschillende aggregatieomstandigheden en in gezaaide aggregatie van hersenlysaten om hun betekenis in de context van verschillende tauopathieën te begrijpen.

Aanvullend materiaal

Raadpleeg de webversie op PubMed Central voor aanvullend materiaal.

ERKENNING

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (Award 1 R35 GM138162 aan AG).

REFERENTIES

1. Šimić G; Babić Leko M; Wray S; Harrington C; Delalle I; Jovanov-Milosevic N; Bažadona D; Buée L; de Silva R; Di Giovanni G; Wischik C; Hof PR Tau-eiwithyperfosforylering en -aggregatie bij de ziekte van Alzheimer en andere tauopathieën, en mogelijke neuroprotectieve strategieën. Biomoleculen 2016, 6 (1), 6–6. [PubMed: 26751493]

2. Li D; Liu C Hiërarchische chemische bepaling van amyloïde polymorfen bij neurodegeneratieve ziekten. Natuur Chemische Biologie 2021, 17 (3), 237-245. [PubMed: 33432239]

3. Kametani F; Hasegawa M Heroverweging van amyloïde hypothese en tau-hypothese bij de ziekte van Alzheimer. Grenzen in neurowetenschap 2018, 12 (25).

4. Iadanza MG; Jackson-parlementslid; Hewitt EW; Ranson NA; Radford SE Een nieuw tijdperk voor het begrijpen van amyloïde structuren en ziekte. Nature Reviews Moleculaire celbiologie 2018, 19 (12), 755-773. [PubMed: 30237470]

5. Ballatore C; Lee VMY; Trojanowski JQ Tau-gemedieerde neurodegeneratie bij de ziekte van Alzheimer en aanverwante aandoeningen. Nature Reviews Neuroscience 2007, 8 (9), 663-672. [PubMed: 17684513]

6. Kolarova M; Garc; #00ED; a-Sierra F; Bartos A; Ricny ​​J; Ripova D-structuur en pathologie van Tau-eiwit bij de ziekte van Alzheimer. Internationaal tijdschrift voor de ziekte van Alzheimer 2012, 2012, 13.

7. Tapiola T; Alafuzoff I; Herukka SK; Parkkinen L; Hartikainen P; Soininen H; Pirttilä T cerebrospinale vloeistof -Amyloïde 42 en Tau-eiwitten als biomarkers van pathologische veranderingen van het Alzheimer-type in de hersenen. JAMA Neurologie 2009, 66 (3), 382-389.

8. Mukrasch MD; Biboog S; Korukottu J; Jeganathan S; Biernat J; Griesinger C; Mandelkow E; Zweckstetter M Structureel polymorfisme van 441-residu-tau bij enkelvoudige residu-resolutie. PLOS Biologie 2009, 7 (2), e1000034.

9. Scheres SHW; Zhang W; Valk B; Goedert M Cryo-EM structuren van tau filamenten. Huidige mening in structurele biologie 2020, 64, 17-25. [PubMed: 32603876]

10. Fitzpatrick AWP; Valk B; hij S; Murzin AG; Murshudov G; Garringer HJ; Crowther RA; Ghetti B; Goedert M; Scheres SHW Cryo-EM-structuren van tau-filamenten van de ziekte van Alzheimer. Natuur 2017, 547 (7662), 185-190. [PubMed: 28678775]

11. Makkie A; Bousset L; Madiona K; Melki R Atomic Force Microscopy Imaging en nanomechanische eigenschappen van zes Tau Isoform-assemblages. Biofysisch tijdschrift 2020, 119 (12), 2497-2507. [PubMed: 33217380]

12. Metrick MA; Ferreira NDC; Saijo E; Kraus A; Newell K; Zanusso G; Vendruscolo M; Ghetti B; Caughey BA enkele ultragevoelige test voor detectie en discriminatie van tau-aggregaten van de ziekten van Alzheimer en Pick. Acta Neuropathologica Communications 2020, 8 (1), 22. [PubMed: 32087764]

13. Haili Z; Meng SR; Ventilator JB; Chen J; Liang Y-fibrillatie van menselijke tau wordt versneld door blootstelling aan lood via interactie met His-330 en His-362. PloS one 2011, 6, e25020. [PubMed: 21966400]

14. Von Bergen M; Barghorn S; Li L; Marx A; Biernat J; Mandelkow EM-mutaties van Tau-eiwit bij frontotemporale dementie bevorderen de aggregatie van gepaarde spiraalvormige filamenten door de lokale structuur te verbeteren. The Journal of biologische chemie 2002, 276, 48165-74.

15. Vorst B; Ollesch J; Wille H; Diamond MI conformationele diversiteit van wild-type tau-fibrillen gespecificeerd door templated conformatieverandering. Journal of Biological Chemistry 2009, 284 (6), 3546-3551.

16. Liu W; Hu X; Zhou L; Di Y; Shi-S; Yao T Oriëntatie-geïnspireerd perspectief op moleculaire remmer van Tau-aggregatie door curcumine geconjugeerd met ruthenium (II) complexe steiger. The Journal of Physical Chemistry B 2020, 124 (12), 2343-2353. [PubMed: 32130010]

17. Prokopovich DV; Whittaker JW; Muthee MM; Achmed A; Larini L Impact van fosforylering en pseudofosforylering op de vroege stadia van aggregatie van de microtubule-geassocieerde eiwit-tau. The Journal of Physical Chemistry B 2017, 121 (9), 2095-2103. [PubMed: 28218850]

18. Arya S; Ganguly P; Arsiccio A; Claud SL; Trapp B; Schönfeld GE; Liu X; Lazar Cantrell K; Shea JE; Bowers MT Terminal Capping van een amyloïdogeen tau-fragment moduleert de neiging tot fibrillatie. The Journal of Physical Chemistry B 2020, 124 (40), 8772-8783. [PubMed: 32816481]

19. Rojas AV; Maisuradze GG; Scheraga HA Afhankelijkheid van de vorming van gemengde tau- en A-peptide-aggregaten van de secundaire structuur van het N-terminale gebied van A. The Journal of Physical Chemistry B 2018, 122 (28), 7049-7056. [PubMed: 29940109]

20. Qi R; Luo Y; Wei G; Nussinov R; Ma BA "Stretching-and-Packing" Cross-Seeding-mechanisme kan tau-eiwitaggregatie veroorzaken. The Journal of Physical Chemistry Letters 2015, 6 (16), 3276-3282.

21. Doe WL; Economou NJ; Chamas A; Buratto SK; Shea JE; Bowers MT Interacties tussen amyloïde- en tau-fragmenten bevorderen afwijkende aggregaten: implicaties voor amyloïde toxiciteit. The Journal of Physical Chemistry B 2014, 118 (38), 11220-11230. [PubMed: 25153942]

22. Buée L; Bussiere T; Buée-Scherrer V; Delacourte A; Hof PR Tau-eiwitisovormen, fosforylering en rol bij neurodegeneratieve aandoeningen. Hersenonderzoek beoordelingen 2000, 33 (1), 95-130. [PubMed: 10967355]

23. Luo Y; Ma B; Nussinov R; Wei G Structureel inzicht in de paradox van Tau Protein van intrinsiek gestoord gedrag, zelfacetyleringsactiviteit en aggregatie. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (17), 3026-3031. [PubMed: 25206938]

24. DongX; Bera S; Qiao Q; Tang Y; Lao Z; Luo Y; Gazit E; Wei G vloeistof-vloeistof fasescheiding van tau-eiwit is gecodeerd op monomeer niveau. The Journal of Physical Chemistry Letters 2021, 12 (10), 2576–2586. [PubMed: 33686854]

25. Goux WJ; Koplin L; Nguyen AD; Lek K; Rutkofsky M; Shanmuganandam VD; Sharma D; Inouye H; Kirschner DA De vorming van rechte en gedraaide filamenten van korte tau-peptiden. Journal of Biological Chemistry 2004, 279 (26), 26868-26875.

26. Fändrich M; Nyström S; Nilsson KPR; Böckmann A; LeVine H 3e; Hammarström P Amyloïde fibrilpolymorfisme: een uitdaging voor moleculaire beeldvorming en therapie. J Intern Med 2018, 283 (3), 218-237. [PubMed: 29360284]

27. Härd T-amyloïde fibrillen: vorming, polymorfisme en remming. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (3), 607-614. [PubMed: 26276617]

28. Martial B; Lefèvre T; Auger M Inzicht in de vorming van amyloïde fibrils met behulp van eiwitfragmenten: structureel onderzoek via vibratiespectroscopie en vaste stof NMR. Biophys Rev. 2018, 10 (4), 1133-1149. [PubMed: 29855812]

29. Eisenberg DS; Sawaya MR structurele studies van amyloïde eiwitten op moleculair niveau. Jaaroverzicht van de biochemie 2017, 86 (1), 69–95.

30. MoranSD; Zanni MT Hoe u inzicht krijgt in de structuur en vorming van amyloïden door middel van infraroodspectroscopie. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (11), 1984–1993. [PubMed: 24932380]

31. Tycko R Solid-State NMR-onderzoeken van amyloïde fibrilstructuur. Jaaroverzicht van de fysische chemie 2011, 62 (1), 279-299.

32. Dazzi A; Prater CB AFM-IR: technologie en toepassingen in infraroodspectroscopie op nanoschaal en chemische beeldvorming. Chemische beoordelingen 2017, 117 (7), 5146-5173. [PubMed: 27958707]

33. Dazzi A; Prater CB; Hu Q; Achtervolg DB; Rabolt JF; Marcott C AFM-IR: combinatie van atoomkrachtmicroscopie en infraroodspectroscopie voor chemische karakterisering op nanoschaal. Appl. spectrosc. 2012, 66 (12), 1365. [PubMed: 23231899]

For more information:1950477648nn@gmail.com