Onderzoek naar de neuro-endocriene-immuunfunctie van Cistanche Deserticola en de producten voor het stomen van rijstwijn in een door glucocorticoïden geïnduceerd rattenmodel

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Bonan Liu, Ji Shi, Zhe Li, Chao Zhang, Pengpeng Liu, Wei Yao en Tianzhu Jia

1 School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

2 Het tweede ziekenhuis van de medische universiteit van Dalian, Dalian 116600, China

Abstract

De woestijnwoningCistanche kruidwerd voor het eerst opgenomen in de "Shen Nong Herbal Classic" en wordt in deze publicatie vermeld als het hoogwaardige kruidengeneesmiddel. /e Chinese Farmacopee registreert dat stukjes van Cistanche deserticola(CD) en rijstwijn-gestoomdCistanche deserticola(WCD) kan in de kliniek worden gebruikt als de belangrijkste soorten afkooksels. Na te zijn gestoomd met rijstwijn, worden de anti-aging en tonificerende nier-yang-effecten versterkt. In deze studie hebben we de chemische inhoud van Cistanche Deserticola en WCD gedetecteerd en het farmacologische mechanisme van het stimuleren van nier-yang-deficiëntie bij modelratten. Doel. Het doel van deze studie was om de effecten van Cistanche Deseticola en WCD op de neuro-endocrieneimmuunfunctievan nier-yang-deficiëntie bij met glucocorticoïden overgedoseerde modelratten. Materialen en methodes. Sprague Dawley (SD) ratten werden geselecteerd. /e ratten hebben subcutaan geïnjecteerd met corticosteron-watersuspensie voor de modelratten met een overdosis glucocorticoïden. /e ratten met positieve controle kregen een sonde met Jinkuishenqi-pillen en een hoge, gemiddelde en lage dosisCistanche Deserticola/WCD-suspensies (respectievelijk 1,646 g/(kg dag), 5,48 g/(kg dag), 2,74 g/(kg dag) en 1,37 g/(kg dag); de blanco controle (BC) en model controle (MC) groepen kregen hetzelfde volume gedestilleerd water als die in de geneesmiddelgroep gedurende 40 opeenvolgende dagen in een dosis van 1 ml/100 g. Na de laatste toediening werd het bloed verzameld uit de abdominale aorta en werden serumspiegels van T, CRH, ACTH, CORT, cortisol, IL-10, IL-6, IL-2, TNF - en IFN-c werden gemeten. Orgaanindexen van de thymusklier en de milt werden berekend. De expressie van Bax, Bcl-2, caspase-3, Fas en FasL in de bijnier werd gemeten door middel van immunohistochemie. /e pathologische veranderingen in de thymusklier en de bijnier werden waargenomen door HE-kleuring (×200). T-lymfocytensubsets in perifeer bloed werden gedetecteerd door collega-cytometrie en de expressie van CaM-mRNA in de hypothalamus- en hypofyseweefsels werd ook gemeten met RT-PCR. Resultaten. Vergeleken met de MC-groep vertoonden de Cistanche Deserticola- en WCD-groepen een toename in activiteit, de orgaanindex van de thymus en de milt, de serumspiegels van T, CRH, ACTH, CORT, cortisol, IL-2 en IL -10, de verhouding van CD4 plus /CD8 plus en de expressie van Bcl-2, caspase-3, Fas, FasL en CaM in het hypofyseweefsel. /eCistanche Deserticolaen WCD-groepen vertoonden ook verlagingen in de IL-6-, TNF- en IFN-c-niveaus in serum en de expressie van CaM-mRNA in de hypothalamus. Conclusies. Elke dosis Cistanche Deseticola en WCD zou het ontregelde geslachtshormoon en de immuunfactoren in modelratten met een overdosis glucocorticoïden kunnen tegengaan, waardoor de effectiviteit van de hypothalamische zenuwcellen wordt verbeterd en hersteld.immuunfunctie.

Invoering

Cistanche deserticola, dat 'woestijn-ginseng' wordt genoemd, is een traditioneel Chinees medicijn dat al eeuwenlang wordt gebruikt als een yang-tonisch kruid om de nieren te stimuleren en de yang te versterken [1]. Acht soorten en één variatie van Cistanches Herba zijn geregistreerd in China en alleen Cistanche deserticola YC Ma en Cistanche tubulosa (Schenk) Wight zijn opgenomen in de Chinese Farmacopee [2]. Farmacologische studies hebben aangetoond dat Cistanches Herba neuroprotectief [3], immunomodulerend [4], cardioprotectief [5], antivermoeidheid [6], ontstekingsremmend [7], hepatoprotectief [8], antioxidatief [9], antibacterieel [10], laxeermiddel vertoonde. [11] en antitumoreffecten [12]. Het brede spectrum van gerapporteerde biologische activiteiten van dit geslacht is toegeschreven aan de complexe en gevarieerde fytochemische samenstelling. Cistanche deserticola bevat fenylethanoïde glycosiden, iridoïden, polysachariden [13], enz. Het gehalte aan fenylethanoïde glycosiden is het hoogste in de oorspronkelijke medicinale materialen [14]. Verwerking van Chinese Materia Medica (CMM) is een traditionele farmaceutische techniek om aan de verschillende vereisten te voldoen voor het behandelen, verstrekken en bereiden van bereidingen volgens de theorie van de traditionele Chinese geneeskunde. Die verwerkte producten worden afkooksels genoemd, die in klinieken worden gebruikt. /e doelen van verwerking zijn om de werkzaamheid te vergroten en/of de toxiciteit van ruwe geneesmiddelen te verminderen. In de Chinese Farmacopee uit 2015 werd vastgelegd dat dikke plakken van Cistanche (CD) en met rijstwijn gestoomde Cistanche (WCD) als afkooksel in de kliniek konden worden gebruikt. Onze onderzoeksgroep toonde aan dat het laxerende effect werd verlicht en dat de anti-aging en nier-yang-versterkende effecten werden versterkt nadat Cistanche was gestoomd met rijstwijn [15].

De functie van de as hypothalamus-hypofyse-bijnier-thymusklier (HPAT) is verstoord bij het nier-yang-deficiëntiesyndroom [16]. Patiënten met nier-yang-deficiëntie hebben ook uitgebreide immuundisfunctie. De disfunctie van de HPA-as hangt nauw samen met immunodeficiëntie. De theorie van het neuro-endocriene-immuunnetwerk (NEI) laat zien dat het immuunsysteem en het neuro-endocriene systeem veel liganden en receptoren delen [17], en de hypothalamus wordt beschouwd als de spil om het neuro-endocriene systeem te verbinden met het immuunsysteem.

In deze studie repliceerden we nier-yang-deficiëntie in modelratten met exogene corticosteroïd-injectie en onderzochten we het mechanisme van de nier-yang-deficiëntie in reactie op verschillende verwerkte producten van Cistanche deserticola vanuit het perspectief van endocrieneimmuunfunctie.

Materialen en methodes

Materialen en reagentia.

Cistanche deserticolawerd in 2019 verzameld bij Alashan Neimenggu en geïdentificeerd als de gedroogde vlezige stengels van Cistanche deserticola YC Ma door Prof. Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, China). De voucher-exemplaren werden bewaard in het Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Standaardverbindingen van een jugol werden gekocht bij Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanoside F, echinacoside, cistanoside A en iso-acteoside werden gekocht bij Must Company (Sichuan China); acteoside werd gekocht van Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). Acetonitril en methanol van MS-kwaliteit werden gekocht bij Merck KGaA (Darmstadt, Duitsland). Mierenzuur van HPLC-kwaliteit werd gekocht bij Merck KGaA (Darmstadt, Duitsland). Rijstwijn werd gekocht van Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Corticosteron (CAS: 50-22-6, zuiverheid > 98 procent , TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan-pillen (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rat ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 en IL-10 ELISA-detectiekits werden gekocht bij Nanjing Jian cheng Co., Ltd. /e rattencortisol ELISA-kit werd geleverd door BOSK Co ., rat-CD4-antilichaam, CD8a-antilichaam (nrs. 561833 en 559976), RBC-lysaat (Solarbio, R1010), PBS-bufferoplossing (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM en -actine stroomopwaarts en stroomafwaartse primers werden geleverd door de Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (nr. RR037A) en cDNA Synthesis Kit (nr. 10000068167) werden geleverd door Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, isopropanol, 75 procent ethanol, en urethaanoplossing waren allemaal analytisch zuiver en geproduceerd door Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrapuur water werd geproduceerd door het Milli-Q-systeem (18,2 MΩ, Millipore, MA, VS).

Experimentele instrumenten

Een enzymmarker (Thermo, model 3530911931), automatische plaatwasser (model HBS- 4009), digitale display push-pull krachtmeter (model VICTOR- 50N), high-speed vriescentrifuge (model Sigma 3k15 ), ultramicrospectrofotometer (model B-50Q), genversterker (model L96G), real-time fluorescentie kwantitatieve PCR (model StepOne), flowcytometer (model AC66051710132), paraffinemicrotoom (model Laika), microscoop (Olympus , model BS-53) en een instrument voor zuiver water (model F7JA36507) werden gebruikt.

Voorbereiding van monsters voor UPLC-Q-TOF-MS en farmacologische experimenten.

WCD werd in ons laboratorium uit dezelfde partij Cistanche deserticola verwerkt. Voor de bereiding van WCD werden droge CD-stukjes (5 mm dik) (100 g) doordrenkt met rijstwijn (30 ml), 4 uur gestoomd bij hoge druk (1,25 kPa) en vervolgens gedroogd bij 55 graden.

De grove poeders van CD en WCD werden gedurende 0,5 uur geweekt in 10 keer 95 procent ethanol, 3 keer onder terugvloeikoeling geëxtraheerd gedurende 1 uur, en gefiltreerd, en de filtraten van 3 keer werden gecombineerd. /e ethanol werd onder verminderde druk gewonnen en het extract werd verkregen voor toediening. /e-extract (1 ml) werd toegevoegd aan 50 procent methanol, waardoor het totale volume op 20 ml kwam, en bij 4°C bewaard voor inhoudsanalyse.

UPLC-QqQ-MS Voorwaarden voor analyse van CD- en WCD-extracten

Het UPLC-MS/MS-systeem met MassLynx 4.1 Analyst-software werd gebruikt om de data-acquisitie en -verwerking uit te voeren. /e analytische kolom was een Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 m) bij een temperatuur van 40 graad C. /e mobiele fase was 0,1 procent mierenzuur waterige oplossing (A) en acetonitril met 0,1 procent mierenzuur (B). /e elutiegradiënt was 0.00–1.00 min met 3 procent B, 1,01-2.00 min met 3 procent –11,5 procent B, 2,01-3.{{ 29}} min met 12 procent B, 3,01–4.00 min met 15 procent B, 4,01–5.00 min met 20 procent B, 5,01–6.00 min met 22 procent B, 6,01–8.00 min met 25 procent B, en 8,01–9.00 min met 10 procent B. /e stroomsnelheid was 0,3 ml/min, en het injectievolume was 1,0 L.

De Waters drievoudige viervoudige massaspectrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, VS) uitgerust met een elektrospray-ionisatiebron (ESI) werd gebruikt in de negatieve ionenmodus. /e desolvatiegas was stikstof met een stroomsnelheid van 500 L/h bij een temperatuur van 250 graden. Alle gedetecteerde verbindingen werden gemeten in de modus voor monitoring van meerdere reacties (MRM); Tabel 1 toont de energieparameters en Tabel 2 toont de kalibratiecurves voor geanalyseerde componenten.

Bereiding van referentiestoffen

Tubuloside A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2′-acetylacteoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cis-tanoside F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geniposidinezuur (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) en catalpol (2,39 mg) werden opgelost in methanol om een ​​voorraadoplossing te bereiden. /e voorraadoplossing werd verdund met methanol om de juiste concentraties voor de werkende standaardoplossingen te krijgen. Alle bereide oplossingen werden vóór gebruik bij 4 graden bewaard.

Voorbereiding en groepering van diermodellen

Mannelijke SD-ratten (180-220 g) werden gekocht bij Liaoning Chang sheng Biotechnological Co., diervergunningsnummer: SCXK (Liao) 2015-0001. Alle ratten werden gehouden met vrije toegang tot voedsel en water bij 25 graden en een relatieve vochtigheid van 30-50 procent. De dieren werden voor de experimenten 7 dagen gehuisvest.

Honderd ratten werden willekeurig verdeeld in 1{{30}} groepen: blanco controlegroep (BC), modelcontrolegroep (MC), positieve controlegroep (PC), rijstwijncontrolegroep (WC), CD hoge dosis (CD-HD) groep, CD middelste dosis (CD-MD) groep, CD lage dosis (CD-LD) groep, WCD hoge dosis (WCD-HD) groep, WCD middelste dosis (WCD-MD ) groep en WCD lage dosis (WCD-LD) groep. /e doses CD-HD/WCD-HD, CD-MD/ WCD-MD en CD-LD/WCD-LD waren 5,48 g/(kg d), 2,74 g/ (kg ∙ d) en 1,37 g /(kg ∙ d), respectievelijk. /e dosis voor de PC-groep was 1,646 g/(kg ∙ d), en voor de WC-groep, 1 ml/100 g gedurende 40 dagen. /e 6e dag na toediening werden de ratten subcutaan geïnjecteerd met het corticosteron-watersuspensie (corticosteron plus 0,1 procent dimethylsulfoxide plus 0,1 procent Tween-80 plus 0,9 procent natrium chloride) behalve de BC-groep [18]. De corticosteronconcentratie was 5 g/l en de dosis was 0,1 ml/100 g. /e ratten in de BC-groep kregen via injectie in dezelfde dosis normale zoutoplossing plus 0,1 procent dimethylsulfoxide plus 0,1 procent Tween- 80 plus 0,9 procent natriumchloride.

Bepaling van HPA-asfuncties

Gewicht, temperatuur en houdkrachttest:Om de 3 dagen werd een gewichtstest uitgevoerd en om de 6 dagen werd de temperatuur gemeten. tijdens het experiment. Op de 39e dag werd de maximale kracht van de achterpoot gemeten met een gripmeter. /e ratten werden op gladde platforms geplaatst, waardoor hun achterpoot de paal greep. /e ratten grijpen instinctief elk object om te voorkomen dat ze achteruit bewegen wanneer aan de staart wordt getrokken totdat de trekkracht groter is dan de greep. Wanneer de rat zijn grip verloor, kon de voorversterker automatisch de maximale gripkracht registreren.

Bepaling van het niveau van T, CRH, ACTH, CORT en Cortisol in serum: Een uur na de laatste toediening werden de ratten verdoofd door intraperitoneale injectie van een urethaanoplossing (20 g/100 ml). /en werden de bloedmonsters verzameld, gedurende 15 minuten bij 3500 r gecentrifugeerd om het serum te verkrijgen en bij -20 graden bewaard. De concentraties van T, CRH, ACTH, CORT en cortisol werden gemeten met ratten-ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.

Microscoopwaarnemingen: De morfologische structuur van bijnierweefsel werd waargenomen door HE-kleuring. Bijnierweefsel werd gefixeerd in 10 procent paraformaldehyde, gedehydrateerd in ethanol, transparant gemaakt door een xyleenoplossing, ingebed met conventionele methoden, gesneden tot 4 μm dikke plakjes, van was ontdaan met xyleenoplossing, gehydrateerd met de ethanolgradiënt en vervolgens gekleurd met hematoxyline en eosine kleuroplossing. Na transparant gemaakt te zijn met xyleen, werd de plaat afgesloten met neutrale gom en bekeken onder een microscoop.

Immunohistochemische kleuring van Bax-, Bcl-2-, Caspase-3-, Fas- en FasL-eiwitexpressie in de bijnieren

In formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde bijniersecties van ratten werden van paraffine ontdaan en gerehydrateerd nadat ze waren gesneden tot een dikte van 4 m. Voor het blokkeren van endogene peroxidase-activiteit werden de coupes gedurende 10 min voorgeïncubeerd in waterstofperoxideblok. Secties werden ondergedompeld in 0,01 M citraat (pH 6,0) en tot koken verwarmd. /e-proces werd na 5-10 minuten herhaald. Na afkoeling werden de secties 1-2 keer gewassen met PBS (pH 7,2-7,6), ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur gelaten en 2-3 keer gewassen met PBS (pH 7,2-7,6). /e 5 procent BSA-blokkerende oplossing werd bij kamertemperatuur toegevoegd en de overmaat vloeistof op de sectie werd 20 minuten later afgeschud. Verdunde primaire antilichamen die specifiek zijn voor Fas/FasL, Bcl-2/Bax en caspase-3 (1:100 verdund met PBS) werden toegevoegd en gedurende 1 uur of 4 graden 's nachts bij 37°C geïncubeerd. /e secties werden 2-3 keer gewassen met PBS (pH 7,2-7,6). / nl, gebiotinyleerd geit-anti-muis-IgG werd toegevoegd en de secties werden gedurende 20 minuten bij 20-37 graden gedroogd en 4 keer gedurende 5 minuten gewassen met PBS (pH 7,2-7,6). Na grondig wassen in PBS werden de coupes 30 minuten geïncubeerd met een mengsel van reagentia A en B, 45 minuten geïncubeerd met PBS en uiteindelijk ontwikkeld met DAB-substraat (DAKO) gedurende 30 minuten voordat ze lichtjes tegengekleurd werden met hematoxyline, gedehydrateerd, en gemonteerd.

Bepaling van immuunfuncties

Berekening van de immuunorgaanindex:Eén uur na de laatste toediening werden de ratten verdoofd door intraperitoneale injectie van urethaanoplossing (20 g/100 ml), en vervolgens werden de milt en thymusklier verwijderd en onmiddellijk gewogen in een steriele kap. De gewichtscoëfficiënten van de milt of de thymus (procent) milt of thymusgewicht (mg)/lichaamsgewicht (g).

Experimentele resultaten

UPLC-QqQ-MSAnalyse:Om de beste scheiding, piekvorm en een korte analysetijd te bereiken, werden de chromatografische omstandigheden, waaronder kolom, mobiele fase en gradiëntprogramma, bestudeerd in ons voorlopige experiment. /e typische chromatogrammen met MRM-modus worden weergegeven in figuur.Uit tabel 4 konden we zien dat het gehalte aan fenylethanolglycosiden in WCD toenam in vergelijking met die van CD, vooral voor echinacoside en acteoside, terwijl het gehalte aan iridoïden verlaagd was in WCD.

Regelgeving voor HPA-asfunctie: De ratten van de MC-groep en experimentele groepen vertoonden geleidelijk nier-yang-deficiëntiesymptomen na toediening van corticosteron. /e symptomen, zoals gewichtsverlies, onderkoeling, verlies van haarglans, hangende geest, vertraging in reactie, de significante afname van waterverbruik en activiteit, verbeterden sterk in de CD- en WCD-groepen. Figuur 2(a) toont de gewichtsveranderingen. /e gewicht van elk van de geneesmiddelgroepen nam toe, vooral in de CD-HD- en WCD-HD-groepen. De gewichtstoename in de MC-groep was het laagst. Figuur 2 (b) toont de veranderingen in temperatuur, die het laagst waren in de MC-groep, en de temperatuur steeg in de WCD-HD-, WCD-MD- en WCD-LD-groepen.

Niveaus van T, CRH, ACTH, CORT en Cortisol: Figuur 3 laat zien dat in vergelijking met die van de BC-groep het niveau van T, CRH, ACTH en CORT in het rattenserum afnam (P <0. 01)="" en="" cortisolspiegel="" daalde="" (p="">< 0.05)="" in="" de="" mc-groep.="" vergeleken="" met="" die="" van="" de="" mc-groep,="" nam="" het="" niveau="" van="" t="" in="" de="" wcd-hd-="" en="" wcd-md-groepen="" toe="" (p=""><0.01), het="" niveau="" van="" crh="" in="" de="" wcd-ld,="" wcd-md="" en="" wc-groepen="" verbeterden="" (p="">< 0.01),="" de="" inhoud="" van="" acth="" nam="" toe="" in="" de="" cd-hd-,="" wcd-md-="" en="" wcd-hd-groepen="" (p=""><0.01), cort-niveau="" verbeterd="" in="" de="" cd-md-,="" wcd-md-="" en="" wcd-hd-groepen="" (p=""><0,01) en="" verbeterd="" in="" de="" cd="" hd-="" en="" wcd-ld-groepen="" (p=""><0,05), en="" het="" cortisolniveau="" nam="" toe="" in="" elk="" van="" de="">

Resultaten van microscoopobservatie: Bijnierweefsel kan worden verdeeld in de corticale laag en de medulla-laag. De corticale lagen omvatten bolvormige, bundel- en reticulaire lagen. De cellen bevatten meer lipiden en de medullalaag bestaat voornamelijk uit feochromocytoomcellen en een kleine hoeveelheid fibreus weefsel. Zoals weergegeven in figuur 4, ontdekten we dat alles normaal was in de BC-groep, terwijl in de MC-groep de bijnierschors duidelijke hyperplasie, cellulaire atrofie en toenemende dichtheid had. De bolvormige strook werd dikker en de doorschijnende fasciculaire zone, de smalle zona reticularis en kleinere cellen vertoonden ongelijkmatige kleuring en capillaire congestie. In de PC-groep waren de corticale en medullaire grenzen zichtbaar. De cellen van de bolvormige en bundelbanden waren gelijkmatig gerangschikt en de morfologische structuur was hersteld. Hetzelfde betere herstel werd waargenomen in de WCD-groepen, en de effecten in de WCD-MD-groep waren beter dan die van de WCD-HD en WCD-LD-groepen. De morfologie van de bijnier in de CD-groepen was niet zo goed als die in de WCD-groepen.

Immunohistochemie: Neuronale apoptose wordt gecontroleerd door veel apoptotische en anti-apoptotische genen, voornamelijk het apoptose-bevorderende gen Bax en de anti-apoptotische genen van de Bcl-2-genfamilie. Bcl-2 is gelokaliseerd in reactieve zuurstofproducerende organellen zoals de mitochondriën, endoplasmatisch reticulum en kernmembranen. Bcl-2 heeft weinig invloed op vrije zuurstofradicalen, maar kan oxidatieve schade in cellen voorkomen. Bax transporteert van het cytoplasma naar het mitochondriale membraan, verandert de mitochondriale membraanstructuur en bevordert de afgifte van cytochroom c en de inductie van apoptose.

Er was een expressie in het bijniercytoplasma van Bax en Bcl{{0}}-eiwit. /e kleuring toonde alle gele deeltjes. Vergeleken met die van de BC-groep nam de gemiddelde optische dichtheid van het Bax-eiwit in de MC-groep significant toe (P < 0.01).="" vergeleken="" met="" die="" van="" de="" mc-groep="" nam="" de="" gemiddelde="" optische="" dichtheid="" in="" de="" cd-ld-="" en="" wcd-ld-groepen="" aanzienlijk="" af="" (p=""><0,01) (figuur="" 5="">De resultaten toonden aan dat CD en WCD apoptose in ontstekingscellen kunnen induceren en adrenale schade kunnen verminderen door de expressie van het FasL-eiwit en binding aan het Fas-eiwit te bevorderen, caspase-3-eiwit te activeren en een caspase-cascade te activeren. Het effect van de WCD-HD-groep was het beste.

Bepaling van de immuunfunctie

Immuunorgaanindex

Vergeleken met die van de BC-groep namen de thymuscoëfficiënt en de miltindex van de MC-groep significant af (P < {{0}}.01).="" vergeleken="" met="" de="" mc-groep="" had="" de="" wcd-md-groep="" het="" grootste="" verschil="" (p=""><0,05). thymuscoëfficiënt="" was="" bijna="" weer="" op="" het="" normale="" niveau.="" voor="" de="" miltindex="" vertoonden="" de="" wcd="" md-,="" wcd-ld-="" en="" cd-md-groepen="" significante="" verschillen="" in="" vergelijking="" met="" die="" van="" de="" mc-groep="" (p=""><0,01) (zie="" figuur="" 6).="" daarom="" zou="" behandeling="" met="" wcd="" en="" cd="" de="" immuunorganen="" kunnen="" beschermen="" en="" waren="" de="" effecten="" van="" wcd="">

Detectie van subsets van T-lymfocyten in perifeer bloed

Het percentage CD4 plus-cellen in het kwadrant linksboven en CD8 plus-cellen in het kwadrant rechtsonder in de BC en elke geneesmiddelgroep was hoger dan dat in de MC-groep. Vergeleken met die van de BC-groep, nam de verhouding CD4 plus /CD8 plus significant af in de MC-groep (P < 0.01).="" vergeleken="" met="" die="" van="" de="" mc-groep,="" nam="" de="" verhouding="" van="" cd4="" plus/cd8="" plus="" significant="" toe="" in="" de="" pc-groep,="" de="" wcd-groep="" en="" de="" cd-hd-groep="" (p=""><0,01) (figuur="" 7).="" bepaling="" van="" het="" niveau="" van="" il{="" {12}},="" il-6,="" il-2,="" tnf-="" en="" ifn-c="" in="">

Figuur 8 laat zien dat in vergelijking met dat van de BC-groep, het niveau van IL-6, TNF- en IFN-c significant toenam (P < 0.01).="" niveau="" van="" il-10="" en="" il-2="" daalde="" in="" de="" mc-groep.="" vergeleken="" met="" die="" van="" de="" mc-groep,="" nam="" het="" niveau="" van="" il-6,="" tnf-="" en="" ifn-c="" af="" en="" il-10="" en="" il-2="" namen="" toe="" in="" serum="" in="" elk="" van="" de="" geneesmiddelgroepen.="" het="" effect="" van="" wcd="" was="" beter="" dan="" het="" effect="" van="" cd,="" vooral="" in="" de="" wcd-md-groep,="" waar="" het="" effect="" dicht="" bij="" dat="" van="" de="" pc-groep="">

Resultaten van Thymus Tissue Microscope Observation Experiment

Figuur 9 laat zien dat in de BC-groep een groot aantal lymfocyten aanwezig was. Lymfocyten en reticulocyten waren losjes in het midden gerangschikt met verspreide ronde of ovale thymocyten. Er was geen necrose, geen infiltratie van ontstekingscellen en geen abnormale veranderingen.

De MC-groep vertoonde een grote hoeveelheid lymfoïde necroseweefsel, met een ongeordende opstelling van lymfocyten en reticulocyten in het midden. Ronde of ovale thymocyten verdwenen, massale celdegeneratie of necrose was duidelijk, en er was infiltratie van inflammatoire cellen met abnormale pathologische veranderingen.

In de CD-groepen waren de morfologische kenmerken van lymfocyten weer normaal en was de rangschikking van centrale lymfocyten en reticulocyten bijna normaal. Ronde of ovale thymocyten waren hersteld, maar er bleef een klein aantal degeneratieve of necrotische lymfocyten en infiltrerende ontstekingscellen over.

In de WCD-groepen en de PC-groep werden de morfologische kenmerken van lymfocyten beter hersteld. De lymfocyten en reticulocyten in het centrum waren goed uitgelijnd, de ronde of ovale thymocyten waren bijna normaal, maar er bleef een klein aantal infiltrerende en degeneratieve lymfocyten over.

CaM-eiwitgenexpressie

RQ-waarde (CaM-mRNA/-actine-mRNA) werd overwogen om de expressie van CaM-mRNA te onderzoeken. De RQ van de BC-groep was 1. De expressie van CaM-mRNA in de hypothalamus in de MC-groep nam significant toe (P <0.01), terwijl="" de="" waarde="" afnam="" in="" de="" wcd-hd,="" wcd-md-,="" wcd="" ld-="" en="" cd-hd-groepen="" (p="">< {{10}}.05)="" (figuur="" 10).="" de="" expressie="" van="" cam-mrna="" in="" de="" hypofyse="" in="" de="" mc-groep="" was="" lager="" dan="" die="" in="" de="" bc-groep="" (p=""><0,01). -expressie="" in="" de="" wcd-hd-,="" wcd-md-,="" wcd-ld-,="" cd-hd-="" en="" cd-ld-groepen="" nam="" toe="" (p=""><0,05), en="" het="" effect="" in="" de="" wcd-groepen="" was="" beter="" dan="" het="" effect="" in="" de="">

Discussie

De Chinese Farmacopee [2] vermeldt dat CD en WCD in de kliniek kunnen worden gebruikt als de belangrijkste soorten afkooksels. Na te zijn gestoomd met rijstwijn, werden de anti-aging en tonificerende nier-yang-effecten versterkt. Via UPLC-QqQ-MS hebben we de kwantitatieve veranderingen in de chemische materiaalbasis gedetecteerd tijdens het stomen van rijstwijn. Iridoïde glycosiden waren onstabiel en het gehalte aan deze glycosiden nam af en werd zelfs ondetecteerbaar. Het gehalte aan fenylethanolglycosiden veranderde ook, wat veranderingen in de farmacodynamiek en het klinische effect zou kunnen veroorzaken.

Het klassieke nier-yang-deficiëntiemodel werd gerepliceerd door subcutane injectie van corticosteron [19]. Een overdosis corticosteron zou het geheim van CRH in de hypothalamus kunnen remmen. Ondertussen werd ook het geheim van ACTH geremd. Het /e-niveau van het bijnierschorshormoon nam af, en dus werd de functie van de HPA-as verminderd. Hypofunctie van de HPA-as is een veelvoorkomend kenmerk van nier-yang-deficiëntie [20]. Dan vertonen de ratten "uitputtingsverschijnselen", en de symptomen komen overeen met die van nier-yang-tekort in de kliniek.

In de MC-groep nam het niveau van CRH, ACTH, T en CORT in rattenserum significant af (P < 0.01).="" na="" te="" zijn="" behandeld="" met="" cd="" en="" wcd,="" nam="" het="" gehalte="" aan="" crh,="" acth,="" t,="" cort="" en="" cortisol="" allemaal="" tot="" op="" zekere="" hoogte="" toe,="" en="" het="" effect="" van="" wcd-md="" was="" het="" beste,="" bijna="" gelijk="" aan="" dat="" in="" de="" pc-groep.="" deze="" resultaten="" gaven="" aan="" dat="" de="" relatieve="" hormoonbalans="" in="" de="" hpa-as="" was="" vernietigd="" in="" de="" mc-groep,="" cd="" en="" wcd="" konden="" het="" functionele="" herstel="" van="" abnormale="" hormoonspiegels="" van="" de="" bijnieras="" verbeteren,="" maar="" het="" effect="" van="" wcd="" was="">

Het moduleren van het aandeel Bcl{{0}}-familieleden is een van de kernmechanismen waarmee Fas/FasL de doodsreceptorroute bemiddelt, en de Bcl-2-familie reguleert de mitochondriale route [21]. Apoptose-remmende factor Bcl-2 en apoptose-inducerende factoren, zoals Bax, behoren allemaal tot de Bcl-2-familie [22]. Celapoptose kan worden bepaald door de relatieve verhouding van apoptose-remmende factoren en apoptose-inducerende factoren [23]. Mitochondriën hadden de functie van centrale controlepunten voor vele vormen van apoptose [24]. De huidige studie toonde aan dat CD-MD en WCD's de expressie van Bax kunnen afleiden en Bcl-2 kunnen verhogen om de nier-yang-deficiëntie te verbeteren. Fas is de belangrijkste doodsreceptor die apoptose induceert door ligatie met het Fas-ligand (FasL) [25]. De expressie van Fas en FasL in de MC-groep nam toe, terwijl deze expressie significant toenam in de WCD-MD-groep (P <0.01) vergeleken="" met="" de="" mc-groep.="" zowel="" fas/fasl-="" als="" bax/bcl-2-systemen="" zetten="" de="" apoptotische="" signalen="" om="" naar="" de="" caspase-familie="" [26].="" caspase-3="" is="" een="" van="" de="" cruciale="" proteïnasen="" die="" celapoptose="" initiëren.="" de="" activering="" van="" caspase-3="" geeft="" aan="" dat="" apoptose="" een="" onomkeerbaar="" stadium="" ingaat="" [27].="" de="" expressie="" van="" caspase-3="" in="" de="" mc-groep="" nam="" toe="" en="" nam="" significant="" toe="" in="" de="" wcd-hd-="" en="" wcd-md-groepen="" (p=""><>

tekort aanimmuunfunctieis een van de belangrijke manifestaties van nier-yang-tekort [28]. In deze studie vonden we dat de index van de milt en thymus van de WCD-MD-groep significant herstelde (P < 0.01,="" p="">< 0.{{3{="" {32}}}}5).="" immuunrespons="" van="" het="" immuunsysteem="" wordt="" voornamelijk="" gereguleerd="" door="" de="" subgroepen="" [29].="" il-2="" is="" de="" groeifactor="" voor="" t-cellen,="" uitgescheiden="" door="" t-cellen="" en="" macrofagen,="" neemt="" deel="" aan="" ontstekingsregulatie,="" reguleert="" de="" immuniteit="" en="" verhoogt="" de="" infectieweerstand="" [30].="" -niveau="" van="" il-2="" in="" de="" mc-groep="" nam="" af="" (p=""><0,01), en="" na="" behandeling="" met="" cd="" en="" wcd="" herstelde="" het="" niveau="" van="" il-2.="" il-6="" en="" tnf-="" zijn="" pro-inflammatoire="" cytokinen.="" verhoogde="" niveaus="" van="" il-6="" en="" tnf-cytokinen="" veroorzaken="" cytokine-onevenwichtigheden="" en="" verergeren="" ontstekingen.="" niveaus="" van="" il-6="" en="" tnf-="" namen="" toe="" in="" de="" mc-groep,="" terwijl="" na="" behandeling="" de="" niveaus="" van="" il-6="" en="" tnf-="" afnamen.="" t-cellen="" zijn="" verdeeld="" in="" cd4-cellen="" en="" cd8-cellen,="" en="" de="" verhouding="" cd4="" plus="" cd8="" plus="" kan="" worden="" gebruikt="" als="" een="" belangrijke="" index="" voor="" immuunregulatie="" [31].="" cd4="" plus="" cd8="" plus="" in="" de="" mc-groep="" nam="" duidelijk="" af="" (p=""><0,01), terwijl="" in="" de="" wcd-="" en="" cd="" hd-groepen="" steeg="" (p=""><>

De HPA-as is het belangrijkste regulerende systeem omdat het de secretie van glucocorticoïden en het endocriene systeem reguleert om de secretoire functie van de bijnierschors te behouden [32]. Overexpressie van CaM-mRNA in hypothalamusweefsel was gerelateerd aan een tekort aan nier-yang. CD en WCD kunnen de calciumkanalen blokkeren, CaM-mRNA-expressie in de hypothalamus remmen en de calciuminstroom verminderen, waardoor de Ca2 plus ·CaM-complexactiviteit wordt verminderd.

De vorming van nier-yang-tekort heeft een chronisch ziekteontwikkelingsproces. De nier is niet langer een puur anatomisch concept, en het is een algemene term voor neuro-endocriene immuniteit en urogenitale systeem. Neuro-endocrien-immuun (NEI) netwerk is een belangrijk geïntegreerd regelsysteem [33]. CD en WCD kunnen de functie van de HPAT-as reguleren en het herstel van nier-yang-tekort verbeteren. Dit resultaat biedt de experimentele basis voor de klinische preventie en behandeling van nier-yang-deficiëntie.

Referenties

[1] Y. Zhang, H. Wu en SN Wang, "Vergelijking van de niervoedende en yang-versterkende functies van drie verschillende soorten Herba Cistanches," China J Chin Mater Med, vol. 19, nee. 3, blz. 169-171, 1994.

[2] Chinese Pharmacopoeia Commission, Pharmacopoeia of People's Republic of China: One Edition, China Medical Science Press, Beijing, China, 2015.

[3] M. Zhu, C. Lu en W. Li, "Voorbijgaande blootstelling aan echinacoside is voldoende om TrK-signalering te activeren en neuronale cellen te beschermen tegen rotenon," Journal of Neurochemistry, vol. 124, nee. 4, blz. 571-580, 2013.

[4] LL Li, XW Wang, XF Wang, et al., "Glycosiden van Cistanche anti-lipideperoxidatie en anti-stralingseffect", Traditionele Chinese Geneeskunde, vol. 22, nee. 6, blz. 364-367, 1997.

[5] E. Preutthipan, CF Ng, CM Koon, ECW Wong, B. Tomlinson en CBS Lau, "/e beschermend effect van Herba Cistanches op statine-geïnduceerde myotoxiciteit in vitro," Journal of Ethnopharmacology, vol. 190, blz. 68-73, 2016.

[6] HS Wong, J. Chen, PK Leong, HY Leung, WM Chan en KM Ko, "Herba vermindert de gewichtstoename bij vetrijke, door een dieet geïnduceerde zwaarlijvige muizen, mogelijk door mitochondriale ontkoppeling," Journal of Functional Foods, vol. 10, blz. 292-304, 2014.

[7] Y. Jia, Q. Guan, Y. Jiang, et al., "Verbetering van dextransulfaat-natrium-geïnduceerde colitis bij muizen door met echinacoside verrijkt extract van Cistanche tubulosa," Phytotherapy Research, vol. 28, nee. 1, blz. 110-119, 2014.

[8] Y. Leung, L. Li, T. Wen en Y.-Q. Li, "Beschermende effecten van echinacoside op tetrachloorkoolstof-geïnduceerde hepatotoxiciteit bij ratten," Toxicology, vol. 232, nee. 1-2, blz. 50-56, 2007.

[9] JH Yang, JP Hu en NS Du, "Structuur-activiteitsrelaties van fenylethanoïde glycosiden in planten van Cistanche salsa op antioxidatieve activiteit", Journal of Chinese Medicine, vol. 32, nee. 7, blz. 1067-1069, 2009.

[10] XQ Han en YP Zhu, "Cistanche-polysaccharide-extractieproces en bacteriostatisch actieonderzoek", J Anhui Agric Sci, vol. 37, nee. 32, blz. 15855-15856, 2009.

[11] PF Tu, ZG Zhang en ZQ Lou, "Analyse van fenylethanoïde glycosiden van Cistanche door RP-HPLC," Acta Pharm Sin, vol. 32, nee. 4, blz. 294-300, 1997.