Onderzoek naar de neuro-endocriene immuunfunctie van Cistanche Deserticola en zijn rijstwijn-stoomproducten in door glucocorticoïden geïnduceerd rattenmodel-Ⅰ

1. Inleiding

Cistanche deserticola, dat 'woestijnginseng' wordt genoemd, is een traditioneel Chinees medicijn dat al eeuwenlang wordt gebruikt als een yang-tonic kruid voorhet stimuleren van de nier en het versterken van de yang[1]. Acht soorten en één variant ervanCistanche Herba zijn opgenomen in China en alleenCistanche deserticolaYC Ma enCistanche tubulosa(Schenk) Wight zijn opgenomen in de Chinese Farmacopee [2]. Farmacologische onderzoeken hebben dat aangetoondCistanches Herbavertoonde neuroprotectieve [3], immuunmodulerende [4], cardioprotectieve [5], antivermoeidheid [6], ontstekingsremmende [7], hepatoprotectieve [8], antioxidatieve [9], antibacteriële [10], laxerende [11] en antitumorale eigenschappen effecten [12]. Het brede spectrum van gerapporteerde biologische activiteiten van dit geslacht wordt toegeschreven aan de complexe en gevarieerde fytochemische samenstelling.Cistanche deserticolabevat fenylethanolglycosiden, iridoïden, polysachariden [13], enz. Het gehalte aan fenylethanoïdeglycosiden is het hoogste in de originele medicinale materialen [14].

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERSTERKEN VAN DE NIEREN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Verwerking van Chinese Materia Medica (CMM) is een traditionele farmaceutische techniek om te voldoen aan de verschillende vereisten voor het behandelen, verstrekken en bereiden van preparaten volgens de traditionele Chinese geneeskundetheorie. Deze verwerkte producten worden afkooksels genoemd en worden in klinieken gebruikt. De verwerking heeft tot doel de werkzaamheid te vergroten en de toxiciteit van ruwe medicijnen te verminderen. In de Chinese Farmacopee uit 2015 werd vermeld dat dikke plakjes Cistanche (CD) en met rijstwijn gestoomde Cistanche (WCD) als afkooksel in de kliniek konden worden gebruikt. Onze onderzoeksgroep toonde aan dat het laxerende effect werd verlicht en dat de anti-verouderings- en nier-yang-versterkende effecten werden versterkt nadat Cistanche werd gestoomd met rijstwijn [15].

De functie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier-thymus (HPAT)-as is verstoord bij het nier-yang-deficiëntiesyndroom [16]. Patiënten met nier-yang-deficiëntie hebben ook uitgebreide immuundisfunctie. Dysfunctie van de HPA-as hangt nauw samen met immuundeficiëntie. De theorie van het neuro-endocriene-immuunnetwerk (NEI) laat zien dat het immuunsysteem en het neuro-endocriene systeem veel liganden en receptoren delen [17], en de hypothalamus wordt beschouwd als de spil die het neuro-endocriene systeem met het immuunsysteem verbindt.

In deze studie repliceerden we nier-yang-deficiëntie bij modelratten met exogene corticosteroïde-injectie en onderzochten we het mechanisme van de nier-yang-deficiëntie als reactie op verschillende verwerkte producten van Cistanche deserticola vanuit het perspectief van de endocriene immuunfunctie.

2. Materialen en methoden

2.1. Materialen en reagentia

Cistanche deserticola werd in 2019 verzameld bij Alashan Neimenggu en geïdentificeerd als de gedroogde, vlezige stengels van Cistanche deserticola YC Ma door prof. Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, China). De voucher-exemplaren werden bewaard in het Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Standaardverbindingen van ajugol werden gekocht bij Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanoside F,echinacoside, cistanoside A en isoacteosidewerden gekocht bij Must Company (Sichuan China); acteoside werd gekocht bij Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). Acetonitril en methanol van MS-kwaliteit werden gekocht bij Merck KGaA (Darmstadt, Duitsland). Mierenzuur van HPLC-kwaliteit werd gekocht bij Merck KGaA (Darmstadt, Duitsland). Rijstwijn werd gekocht bij Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Corticosteron (CAS: 50-22-6, zuiverheid > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin cheesean-pillen (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rat ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 en IL-10 ELISA-detectiekits werden gekocht bij Nanjing Jiancheng Co., Ltd. De rattencortisol-ELISA-kit werd geleverd door BOSK Co., CD4-antilichaam van de rat, CD8a-antilichaam (nrs. 561833 en 559976), RBC-lysaat (Solarbio, R1010), PBS-bufferoplossing (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM en -actine stroomopwaartse en stroomafwaartse primers werden geleverd door de Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (nr. RR037A) en cDNA Synthesis Kit (nr. 10000068167) werden geleverd door Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, isopropanol, 75% ethanol en urethaan oplossingen waren allemaal analytisch zuiver en geproduceerd door Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrapuur water werd geproduceerd door het Milli-Q-systeem (18,2 MΩ, Millipore, MA, VS).

2.2. Experimentele instrumenten

Een enzymmarker (Thermo, model 3530911931), automatische plaatwasmachine (model HBS- 4009), push-pull krachtmeter met digitaal display (model VICTOR- 50N), hogesnelheidsvriescentrifuge (model Sigma 3k15 ), ultramicrospectrofotometer (model B-50Q), genversterker (model L96G), realtime fluorescentie kwantitatieve PCR (model StepOne), flowcytometer (model AC66051710132), paraffinemicrotoom (model Laika), microscoop (Olympus , model BS-53) en een zuiver waterinstrument (model F7JA36507) werden gebruikt.

2.3. Bereiding van monsters voor UPLC-Q-TOF-MS en farmacologische experimenten

WCD werd verwerkt uit dezelfde batchCistanche deserticolain ons laboratorium. Voor de bereiding van WCD werden droge CD-stukken (5 mm dik) (100 g) doordrenkt met rijstwijn (30 ml), gedurende 4 uur bij hoge druk (1,25 kPa) gestoomd en vervolgens bij 55 graden gedroogd.

De grove poeders van CD en WCD werden 0,5 uur in 10 maal 95% ethanol gedrenkt, telkens 1 uur onder terugvloeiing geëxtraheerd en gefiltreerd, en de filtraten werden 3 maal gecombineerd. De ethanol werd onder verminderde druk teruggewonnen en het extract werd verkregen voor toediening. Het extract (1 ml) werd toegevoegd aan 50% methanol, waardoor het totale volume op 20 ml kwam, en bij 4 graden bewaard voor inhoudsanalyse.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Voorwaarden voor analyse van CD- en WCD-extracten

2.4.1. LCThMS analytische omstandigheden

Het UPLC-MSThMS-systeem met MassLynx 4.1 Analyst-software werd gebruikt om de data-acquisitie en -verwerking uit te voeren. De analytische kolom was een Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm x 2,1 mm, 1,7 μm) bij een temperatuur van 40 graad C. De mobiele fase was 0,1% waterige mierenzuuroplossing (A) en acetonitril dat 0,1% mierenzuur bevatte (B). De elutiegradiënt was 0.00–1.00 min met 3% B, 1,01–2.00 min met 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min met 12% B, 3,01–4.00 min met 15% B, 4,01–5.00 min met 20% B, 5,01–6.00 min met 22 % B, 6,01–8.00 min met 25% B, en 8,01–9.00 min met 10% B. De stroomsnelheid was 0,3 mlTh min en het injectievolume was 1,0 μl.

De Waters drievoudige viervoudige massaspectrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, VS) uitgerust met een elektrospray-ionisatie (ESI) bron werd gebruikt in de negatieve ionenmodus. Het desolvatiegas was stikstof met een stroomsnelheid van 500 LThh bij een temperatuur van 250 graden. Alle gedetecteerde verbindingen werden gemeten in de modus voor meervoudige reactiemonitoring (MRM); Tabel 1 toont de energieparameters en Tabel 2 toont de kalibratiecurven voor de geanalyseerde componenten.

2.4.2. Bereiding van referentiestoffen

Tubuloside A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2′-acetylacteoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside F ( 2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geniposidinezuur (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) en catalpol (2,39 mg) werden opgelost in methanol om een ​​voorraadoplossing te bereiden. De voorraadoplossing werd verdund met methanol om de geschikte concentraties voor de werkende standaardoplossingen te verkrijgen. Alle bereide oplossingen werden vóór gebruik bij 4 graden bewaard.

2.5. Voorbereiding en groepering van diermodellen

Mannelijke SD-ratten (180-220 g) werden gekocht bij Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Diervergunningsnummer: SCXK (Liao) 2015-0001. Alle ratten kregen vrije toegang tot voedsel en water bij een temperatuur van 25 graden en een relatieve vochtigheid van 30-50%. De dieren werden vóór de experimenten 7 dagen gehuisvest.

Honderd ratten werden willekeurig verdeeld in 10 groepen: blanco controlegroep (BC), modelcontrolegroep (MC), positieve controlegroep (PC), rijstwijncontrolegroep (WC), CD hoge dosis (CD -HD) groep, CD middendosis (CD-MD) groep, CD lage dosis (CD-LD) groep, WCD hoge dosis (WCD-HD) groep, WCD middendosis (WCD-MD) groep, en WCD lage dosis (WCD-LD) groep. De doses CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD en CD-LDThWCD-LD waren respectievelijk 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) en 1,37 gTh (kg ∙ d). De dosis voor de PC-groep was 1,646 gTh (kg ∙ d) en voor de WC-groep 1 mlTh100 g gedurende 40 dagen. Op de zesde dag na toediening werden de ratten subcutaan geïnjecteerd met de corticosteron-watersuspensie (corticosteron + 0.1% dimethylsulfoxide + 0.1% Tween-80 + 0.9% natriumchloride), behalve voor de BC-groep [18]. De concentratie corticosteron was 5 gThL en de dosis was 0,1 mlTh100 g. De ratten in de BC-groep kregen via injectie een normale zoutoplossing + 0.1% dimethylsulfoxide + 0.1% Tween- 80 + 0.9% natriumchloride in dezelfde dosis.

2.6. Bepaling van HPA-asfuncties

2.6.1. Gewicht, temperatuur en houdkrachttest

Elke 3 dagen werd een gewichtstest uitgevoerd en elke 6 dagen werd de temperatuur gemeten. tijdens het experiment. Op de 39e dag werd de maximale kracht van het achterbeen gemeten met een gripmeter. De ratten werden op gladde platforms geplaatst, waardoor hun achterpoten de paal vastpakten. De ratten zullen instinctief elk voorwerp vastgrijpen om te voorkomen dat ze naar achteren bewegen wanneer aan de staart wordt getrokken totdat de trekkracht groter is dan de greep. Toen de rat zijn grip verloor, kon de voorversterker automatisch de maximale grijpkracht registreren.

2.6.2. Bepaling van het niveau van T, CRH, ACTH, CORT en Cortisol in serum

Eén uur na de laatste toediening werden de ratten verdoofd door intraperitoneale injectie van een urethaanoplossing (20 gTh100 ml). Vervolgens werden de bloedmonsters verzameld, gedurende 15 minuten bij 3500 r gecentrifugeerd om het serum te verkrijgen, en bij -20 graden bewaard. De concentraties van T, CRH, ACTH, CORT en cortisol werden gemeten met ELISA-kits van ratten volgens de instructies van de fabrikant.

2.6.3. Microscoopobservaties

De morfologische structuur van bijnierweefsel werd waargenomen door HE-kleuring. Bijnierweefsel werd gefixeerd in 10% paraformaldehyde, gedehydrateerd in ethanol, transparant gemaakt door een xyleenoplossing, ingebed met conventionele methoden, gesneden tot plakjes van 4 μm dik, ontwast met xyleenoplossing, gehydrateerd met de ethanolgradiënt en vervolgens gekleurd met hematoxyline en eosine. kleuroplossing. Nadat de plaat transparant was gemaakt met xyleen, werd deze afgesloten met neutrale gom en onder een microscoop bekeken.

2.6.4. Immunohistochemische kleuring van Bax-, Bcl-2-, Caspase-3-, Fas- en FasL-eiwitexpressie in de bijnier

In formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde bijniercoupes van ratten werden van paraffine ontdaan en gerehydrateerd nadat ze waren gesneden tot een dikte van 4 μm. Voor het blokkeren van de endogene peroxidaseactiviteit werden de coupes gedurende 10 min. voorgeïncubeerd in een waterstofperoxideblok. Secties werden in 0.01 M citraat (pH 6,0) gedompeld en tot koken verwarmd. Het proces werd na 5-10 minuten herhaald. Na afkoelen werden de coupes 1 à 2 keer gewassen met PBS (pH 7,2–7,6), ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur bewaard en 2 à 3 keer gewassen met PBS (pH 7,2–7,6). De 5% BSA-blokkeeroplossing werd bij kamertemperatuur toegevoegd en de overtollige vloeistof op de coupe werd 20 minuten later afgeschud. Verdunde primaire antilichamen specifiek voor FasTh FasL, Bcl-2ThBax en caspase-3 (1:100 verdund met PBS) werden toegevoegd en gedurende 1 uur of 4 graden overnacht bij 37 graden geïncubeerd. De coupes werden 2-3 keer gewassen met PBS (pH 7,2-7,6). Vervolgens werd gebiotinyleerd geit-anti-muis-IgG toegevoegd en werden de secties gedurende 20 minuten bij 20-37 graden gedroogd en 4 keer gedurende 5 minuten gewassen met PBS (pH 7,2-7,6). Na grondig wassen in PBS werden de coupes 30 minuten geïncubeerd met een mengsel van reagentia A en B, 45 minuten geïncubeerd met PBS en uiteindelijk 30 minuten ontwikkeld met DAB-substraat (DAKO) voordat ze lichtjes werden tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd. en gemonteerd.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE SENSATIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Bepaling van immuunfuncties

2.7.1. Berekening van de immuunorgaanindex

Eén uur na de laatste toediening werden de ratten verdoofd door intraperitoneale injectie van urethaanoplossing (20 gTh100 ml), en vervolgens werden de milt en de thymus verwijderd en onmiddellijk in een steriele kap gewogen. De gewichtscoëfficiënten van de milt of de thymus (%) milt of thymus gewicht (mg) Lichaamsgewicht (g).

2.7.2. Detectie van subsets van T-lymfocyten in perifeer bloed

Splenocyten en hemocyten werden gedurende 30 minuten in het donker geïncubeerd met de monoklonale antilichamen anti-CD4 (PE) en anti-CD8 (FITC). Er werd 2 ml erytrocytenlysaat toegevoegd en de oplossing werd gemengd door middel van vortexen. De oplossing werd gedurende 10 minuten in het donker gelaten en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd. Het supernatant werd weggegooid en vervolgens werd de oplossing driemaal gewassen met ijskoude PBS en opnieuw gesuspendeerd in een PBS-permeabiliserende oplossing. Ten minste 10000 cellen werden binnen 1 uur na elke Mab-kleuring geanalyseerd met flowcytometrie.

2.7.3. Bepaling van het niveau van IL-10, IL-6, IL-2, TNF- en IFN-c in serum

Eén uur na de laatste toediening werden de ratten verdoofd door intraperitoneale injectie van urethaanoplossing (20 gTh100 ml) en werd bloed uit de abdominale aorta afgenomen. Het bloed werd 15 minuten bij 3500 r gecentrifugeerd om het serum te verkrijgen en bij -20 graden bewaard. De concentraties van IL-10, IL-6, IL-2, TNF- en IFN-c werden gedetecteerd met ELISA-kits van ratten volgens de instructies van de fabrikant.

2.8. Expressie van CaM in hypothalamus- en hypofyse-weefsels

Totaal RNA werd door TRIzol uit de hypothalamus- en hypofyseweefsels geëxtraheerd. Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd op 10 μl totaal RNA volgens de instructies van de fabrikant. Gelijke hoeveelheden cDNA werden geanalyseerd via qPCR in aanwezigheid van dsDNA-bindende kleurstof (Promega, VS) en het CFX 96 Real-time PCR-systeem (Bio-Rad, VS) om naar de verschillende genen te kijken onder de omstandigheden van initiële activering bij 95 graden gedurende 10 minuten, 40 denaturatiecycli bij 95 graden gedurende 15 seconden en uitgloeiverlenging bij 60 graden gedurende 1 minuut.

Primers voor CaM en -actine worden gegeven in Tabel 1, en -actine werd gebruikt als interne controle. Elk monster werd genormaliseerd door gebruik te maken van het verschil in kritische drempels (Ct) tussen het doelgen en -actine. De volgende vergelijking werd gebruikt om het resultaat te beschrijven: ΔΔCt (Ct-doelgen − Ct-actinegen) experimentele groep − (Ct-doelgen − Ct-actinegen) controlegroep. De mRNA-niveaus van elk monster werden vervolgens vergeleken met behulp van het expressie 2- ΔΔCt-doelgen. De resultaten van elke groep werden gemiddeld (Tabel 3).

2.9. Statistische analyse

Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS-software (versie 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met eenzijdige variantieanalyse met herhaalde metingen (ANOVA). De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) met behulp van GraphPad Prism-software (versie 6.0, San Diego, CA, VS). Verschillen met een P-waarde kleiner dan 0.05 werden als statistisch significant beschouwd.

3. Experimentele resultaten

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalyse

Om de beste scheiding, piekvorm en een korte analysetijd te bereiken, werden in ons voorlopige experiment de chromatografische omstandigheden, waaronder de kolom, de mobiele fase en het gradiëntprogramma, bestudeerd. De typische chromatogrammen met MRM-modus worden weergegeven in Figuur 1.

Uit Tabel 4 kunnen we zien dat het gehalte aan fenylethanoïdeglycosiden in WCD toenam in vergelijking met dat van CD, vooral voor echinacoside en acteoside, terwijl het gehalte aan iridoïden in WCD was afgenomen.

3.2. Regeling voor HPA-asfunctie

3.2.1. Gewicht, temperatuur en houdkrachttest

De ratten van de MC-groep en experimentele groepen vertoonden geleidelijk symptomen van nier-yang-deficiëntie nadat ze corticosteron kregen toegediend. De symptomen, zoals gewichtsverlies, onderkoeling, verlies van haarglans, neerhangende geest, vertraagde reactie en een significante afname van het waterverbruik en de activiteit, verbeterden aanzienlijk in de CD- en WCD-groepen. Figuur 2(a) toont de gewichtsveranderingen. Het gewicht van elk van de medicijngroepen nam toe, vooral in de CDHD- en WCD-HD-groepen. De gewichtstoename in de MC-groep was het laagst. Figuur 2(b) toont de temperatuurveranderingen, die het laagst waren in de MC-groep, en de temperatuur steeg in de WCD-HD-, WCD-MD- en WCD-LD-groepen.

Figuur 2(c) laat zien dat de houdkracht toenam voor de BC-groep en elk van de experimentele groepen, en dat de WCD-MD-groep de hoogste was, wat aantoonde dat tekenen van zwakte veroorzaakt door nier-yang-deficiëntie na toediening verbeterden.

3.2.2. Niveaus van T, CRH, ACTH, CORT en Cortisol

Figuur 3 laat zien dat vergeleken met die van de BC-groep de niveaus van T, CRH, ACTH en CORT in het rattenserum daalden (P < 0.01) en de cortisolspiegel daalden (P < 0.05) in de MC-groep. Vergeleken met die van de MC-groep is het niveau van T in de WCD-HD- en WCD-MD-groepen toegenomen (P < 0.01), het niveau van CRH in de WCD-LD, WCD-MD- en WC-groepen verbeterden (P < 0.01), ACTH-inhoud nam toe in de CD-HD-, WCD-MD- en WCD-HD-groepen (P < 0,01), CORT-niveau verbeterde in de CD-MD-, WCD-MD- en WCD-HD-groepen (P <0,01) en verbeterd in de CDHD- en WCD-LD-groepen (P <0,05), en het cortisolniveau nam toe in elk van de medicijngroepen.

3.2.3. Resultaten van microscoopobservatie

Bijnierweefsel kan worden onderverdeeld in de corticale laag en de medullalaag. De corticale lagen omvatten bolvormige, bundel- en reticulaire lagen. De cellen bevatten meer lipiden en de medullalaag bestaat voornamelijk uit feochromocytoomcellen en een kleine hoeveelheid vezelig weefsel. Zoals weergegeven in figuur 4 ontdekten we dat alles normaal was in de BC-groep, terwijl in de MC-groep de bijnierschors duidelijke hyperplasie, cellulaire atrofie en toenemende dichtheid vertoonde. De bolvormige strook werd dikker en de doorschijnende fasciculaire zone, de smalle zona reticularis en kleinere cellen vertoonden ongelijkmatige kleuren en capillaire congestie. In de PC-groep waren de corticale en medullaire grenzen zichtbaar. De cellen van de bolvormige en bundelbanden waren gelijkmatig gerangschikt en de morfologische structuur was hersteld. Hetzelfde betere herstel werd waargenomen in de WCD-groepen, en de effecten in de WCD-MD-groep waren beter dan die van de WCD-HD- en WCD-LD-groepen. De morfologie van de bijnieren in de CD-groepen was niet zo goed als die in de WCD-groepen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%