Stx2 induceert differentiële genexpressie en verstoort circadiane ritmegenen in de proximale tubulus Ⅱ

3. Discussie

3.1. De proximale tubulaire pathologie bij STEC-patiënten en diermodellen

Oligurie is een teken vanacute tubulaire necrose(ATN). Vanwege ATN belemmeren afgestorven epitheelcellen het lumen van tubuli om de vloeistofstroom te verminderen, wat lijkt op oligurie. Bij STEC-patiënten zijn oligurie en anurie vaak bevindingen die wijzen op ATN. Vermindering van de proximale tubulusfunctie tijdens eerdere stadia van STEC-infectieziekte is aangetoond als toename van 2MG en NAG in de urine [3,33]. B2MG is een klein eiwit van 12 kDa dat vrij door glomeruli wordt gefilterd en in gezonde toestand volledig wordt geabsorbeerd door de proximale tubuli. Zodra de proximale tubuli echter beschadigd zijn, neemt de hoeveelheid 2MG in de urine toe en dient zo als biomarker voor de proximale tubulaire functie. NAG is een groot lysosomaal enzym van 130 kDa en de belangrijkste glucosidase in de proximale tubulus. Vanwege de grote omvang kan de glomerulus NAG niet filteren, terwijl beschadigde proximale tubuli NAG in de urine afscheiden. Een toename van NAG in de urine is dus een andere biomarker voor proximale tubulaire schade. Glomerulaire histopathologie zoals door fibrine geblokkeerde haarvaten is een frequente bevinding bij STEC-patiënten; de bovenstaande urinegegevens duiden echter op proximale tubulaire schade bij de eerdere ziekte. Ook bevat urine van STEC-patiënten afgietsels bestaande uit tubulair epitheel, dat het gevolg is van het loslaten van beschadigde proximale tubulaire cellen [1]. In diermodellen wordt vaak vervelling van de proximale tubulaire cellen aangetroffen, zowel bij STEC-infectie- als bij Stx-injectiemodellen [25-27,34]. In de huidige studie vonden we vervelling van de proximale tubulaire cellen in met Stx2-geïnjecteerde muizennieren, wat erop wijst dat door Stx2-geïnduceerde proximale tubulaire veranderingen optreden (Figuur 1). Ook hebben we Stx2-receptor Gb3 gedetecteerd in zowel muizen alsproximale tubuli van de menselijke niermet luminale zij-expressie die indicatief is voor een directe interactie van Stx2 met de proximale tubuli (figuren 2 en 3). PDK4 fosforyleert pyruvaatdehydrogenase om de activiteit ervan te remmen, wat resulteert in een afname van het glucosegebruik en een toename van het vetmetabolisme als reactie op langdurig vasten en uithongering. Het beschermt losgeraakte epitheelcellen tegen door loslating geïnduceerde celdood (anoikis) [35]. PDK4 had aanvankelijk een piek na 4 uur, daarna nog een piek na 8 uur (Figuur 5A). Deze werd na 12 uur verlaagd, maar nam daarna geleidelijk toe tot 72 uur met een log2-voudige verandering en eindigde met 3 (12-voudige verandering) (Figuur 5A). Het loslaten van epitheelcellen vond plaats in met Stx2-geïnjecteerde proximale tubulaire cellen van muizen (vervelling) met een relatief intacte morfologie (Figuur 1). Dit kan een weerspiegeling zijn van de opregulatie van PDK4.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACTPOEDER VOOR NIEREN

Omdat NHERF1 (SLC9A3R1) bijdraagt ​​aan de normale celhechting aan de extracellulaire matrix [36], de organisatie van het actine-cytoskelet en het in stand houden van de celmorfologie, kan een verlaagde expressie van dit gen gevolgen hebben zoals het afsterven van cellen (Figuur 5K).

Het effect van Stx2 op de proximale tubuli lijkt zo'n belangrijke factor voor STEC-infectieziekte; veranderingen in genexpressie die zich richten op in vivo proximale tubulaire cellen waren echter voorheen niet beschikbaar. Keepers et al. [37] toonden differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) aan in de nieren van met Stx2+LPS-geïnjecteerde muizen, zodat de meeste van de eerdere en grotendeels gewijzigde genen het gevolg waren van LPS-invloed en genen die zeer laat werden gewijzigd, het gevolg zijn van het Stx2-effect . Hun gegevens toonden waardevol inzicht in de differentiële genexpressies van de nier, maar maakten geen onderscheid tussen de celtypen die verantwoordelijk waren voor die verandering. In de huidige studie hebben we geprobeerd DEG's op te sporen die geassocieerd zijn met de proximale tubulaire cellen door microarraygegevens van muizen te vergelijkennier- en menselijke primaire proximale tubulairecellen die werden behandeld met Stx2.

3.2. Proximale tubulaire factoren die betrokken zijn bij door Stx2-geïnduceerde pathologie in relatie tot bekende Stx2-activiteiten in cellen die Gb3 tot expressie brengen

3.2.1. Activiteit (I), signaaltransductie geïnduceerd door Stxs-binding aan Gb3

B-subeenheden van Stxs induceren niet-receptor src-tyrosinekinase Ja-fosforylering [4]. Gefosforyleerd Yes activeert stroomafwaartse signaalmoleculen door zijn kinase-activiteit en leidt tot hermodellering van het cytoskelet [5]. Het is bekend dat Yes-geassocieerde eiwit (YAP) fosforylatie in Y357 door Yes nucleaire translocatie van YAP induceert, waarbij het fungeert als een transcriptionele co-activator om doelgenen zoals CTGF te induceren [38]. Matricellulaire eiwitten CYR61 (CCN1) en CTGF (CCN2) worden uitgescheiden naar de extracellulaire matrix (ECM) en dragen bij aan het behoud van cel-ECM-adhesie door receptor-integrines en aan het celoppervlak gehechte heparansulfaatproteoglycanen (HSPG's) te binden [39,40]. Het belangrijkste molecuul van CCN1- en 2-transcriptie is YAP, en het wordt inactief gehouden (gefosforyleerd op serineresidu 127) in een normale toestand onder de Hippo-signaleringsroute. Zodra een lage cel-celadhesie wordt gedetecteerd, wordt YAP (S127) niet langer gefosforyleerd, waardoor het de kern kan binnendringen, en neemt de transcriptie van CCN1 en 2 toe [41-43]. CCN1 en 2 fungeren als wondgenezende moleculen om celverliesweefsel te herstellen [38,44]. In onze dataset hadden CCN1 en 2 kleine pieken op een eerder tijdstip (6 uur). Dit kan een weerspiegeling zijn van door Stx2-binding geïnduceerde Ja-activering. Latere uren kan vervelling verdere YAP-activering hebben veroorzaakt door de Hippo-signaleringsroute uit te schakelen om een ​​grotere expressie van CCN1 en 2 te induceren om 12 uur of later (Figuur 5C).

3.2.2. Activiteit (II), Opwekken van ER-stress/UPR

Stxs bereiken het ER, waar gesplitste A1-fragmenten en B-subeenheden ongevouwen eiwitten nabootsen [9,10,45,46]. Glucose-gereguleerd eiwit 78 kDa (Grp78, bindend immunoglobuline-eiwit (Bip)) verankert drie UPR-sleuteleiwitten Inositol-vereist enzym-1 (Ire-1), proteïnekinase R-achtige endoplasmatisch reticulumkinase (PERK ) en activerende transcriptiefactor 6 (ATF6) in ER-membraan tijdens normale toestand. Vanwege de hogere affiniteit van Grp78 voor ongevouwen eiwitten, komen de verankerde eiwitten vrij. ATF6 wordt geactiveerd na de afgifte en verhoogt de mR NA's van CHOP (DDIT3) en X-box bindend eiwit 1 (XBP-1), terwijl Ire-1 XBP-1 mRNA splitst om XBP{{ te produceren 22}} eiwit, dat bijdraagt ​​aan CHOP (DDIT3)-transcriptie. PERK-activering leidt tot ATF4-activering die ook CHOP (DDIT3) mRNA verhoogt. Daarom is een toename van CHOP (DDIT3) mRNA een kenmerk van UPR [47,48]. Er wordt gerapporteerd dat Stxs UPR induceren en CHOP (DDIT3) wordt opgereguleerd in onze dataset (Figuur 5D – G).

GDF15 behoort tot de familie van transformerende groeifactoren bèta (TGF). Onlangs is aangetoond dat GDF15 het door diabetesmedicatie metformine geïnduceerde gewichtsverlies bemiddelt [49]. Bij oraal toegediende metformine-muizen was het mRNA van GDF15 in de darmen en de nieren verhoogd, wat resulteerde in een verhoging van serum-GDF15. Het circulerende GDF15 werkt via een in de hersenstam beperkte receptor om de voedselinname te onderdrukken en het lichaamsgewicht te verminderen [50]. Bij de met metformine toegediende muizen wordt de verhoogde renale GDF15 tenminste gedeeltelijk gereguleerd door CHOP (DDIT3). In onze dataset van met Stx2-geïnjecteerde muizennieren nam CHOP (DDIT3) aanvankelijk toe na 4 uur met een zeer kleine piek en begon daarna een stijgende trend te vertonen richting 48 uur, waar het het niveau van een log handhaafde{{16 }}vouw de verandering rond 1,3 (Figuur 5E). Volgens STRING-clusteranalyse ontvangt GDF15 actieve input van transcriptiefactoren CHOP (DDIT3) en ATF3 (Figuur 5E) [51,52]. Het met Stx2-geïnjecteerde muizengewicht begon na 24 uur af te nemen of af te wijken van de zoutoplossingcontrole (Figuur S3B). Een toename van GDF15-mRNA in de nier na 12 uur kan de hersenstam hebben beïnvloed om de voedselinname te verminderen, wat op zijn beurt verscheen als een gewichtsverlies (figuren 5E en S3B). Omdat het GDF15-expressieniveau na 24 uur hoog bleef, bleven muizen afvallen (figuren 5E en S3B).

Bij ER-stress wordt PERK vrijgegeven uit Grp78 (Bip) en oligomeriseert om eIF2 te fosforyleren en te remmen, wat leidt tot globale translatierepressie, met uitzondering van enkele UPR-responsieve eiwitten zoals ATF4, CHOP en Grp78. GADD34 (eiwitfosfatase 1 regulerende subeenheid 15A (PPP1R15A)) is een van de verhoogde eiwitten onder gefosforyleerde eIF2 (eIF2 (P))-geassocieerde remming en opgereguleerd in onze dataset (Figuur 5D,G). GADD34 is een eiwitfosfatase-1 die eIF2 (P) defosforyleert om de door UPR geïnduceerde remming van de eiwitsynthese negatief te reguleren [53]. De GADD34-expressie (PPP1R15A) wordt een log2-voudige verandering groter dan 1 na 12 uur Stx2 in onze dataset en blijft toenemen tot 24 uur wanneer deze stabiel blijft (log2-voudige verandering is gelijk aan 2,1) en handhaaft deze niveau tot het einde (Figuur 5D,G). Dit suggereert dat de door Stx2-geïnduceerde UPR na 12 uur een negatieve feedback had. Verhoogde transcriptie en vertaling van CHOP (DDIT3, GADD153) is een kenmerk van ER-stress en het differentiële expressiepatroon lijkt op GADD34, behalve dat log2 groter dan 1 optreedt na 24 uur en daarna geleidelijk plateaus bereikt (log2 is gelijk aan 1,3) (Figuur 5D,G). Ook wordt CEBPB, de overheersende dimeriserende partner van CHOP, opgereguleerd in onze dataset (Figuur 5D,G). Deze resultaten suggereren dat hoewel door Stx2-geïnduceerde ER-stress al heel vroeg in het tijdsverloop begint, het effect tot 24 uur toeneemt en dit niveau van ER-stress tot het einde wordt gehandhaafd, terwijl een negatieve feedbackarm zichzelf tegelijkertijd ook in evenwicht brengt

3.2.3. Activiteit (III), Ribosoom-inactiverende proteïne (RIP) activiteit

Door een adenine van rRNA te splitsen, remmen Stxs de novo eiwitsynthese. Gedepurineerd rRNA beïnvloedt de verandering van de ribosomale morfologie, die signaaltransductie activeert [11], bekend als een ribotoxische stressrespons (RSR), wat leidt tot karakteristieke genactivatie (zie volgende paragraaf).

3.2.4. Activiteit (IV), Ribotoxische Stressrespons (RSR) Activiteit

ZAK (een MAPKKK) is de bekende kinase in RSR en activeert stroomafwaartse JUN N-terminale kinase (JNK) en p38 MAPK-routes [12,15]. Stx1 induceert JUN- en FOS-mRNA-expressie in menselijke darmepitheelcellen en deze gebeurtenis vereiste RIP-activiteit-positieve Stx1 waarvan wordt aangenomen dat deze onder RSR-controle staat [15]. Van een ander RSR-stroomafwaarts molecuul, p38 MAPK, is bekend dat het vroege responsgenen induceert, zoals JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 en ATF3 [54], die allemaal differentieel tot expressie kwamen in onze dataset. Het is ook bekend dat JNK- en p38 MAPK-routes worden geactiveerd stroomafwaartse gebeurtenissen van Ire-1 onder UPR (figuren 4B,D en 5B,E,F) [47]. Hierdoor kunnen Stxs deze twee routes activeren via RSR en/of UPR. Er is ook aangetoond dat de extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK) 1/2-route zich stroomafwaarts van RSR bevindt [55] en het is bekend dat het DUSP1 (MKP1)-gen wordt geïnduceerd door de ERK1/2-route [56]. Stx1 en anisomycine (een andere remmer van de eiwitsynthese) zijn in staat DUSP1-expressie in Caco-2-cellen te induceren [57]. In onze dataset werd DUSP1-expressie geïnduceerd en dit kan duiden op ERK1/2-activering (Figuur 4B,D).

3.2.5. Activiteit (V), specifieke gentranscriptie leidend tot cytokine

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 na respectievelijk 24 en 48 uur (Figuur 5F). Dit suggereert dat hat-genen onder beide NF-KB-routes, IκB (klassiek) en RelB (alternatief), worden geïnduceerd. Omdat de differentiële expressie van CHOP (DDIT3) log2 groter dan 1 na 24 uur overschrijdt, ondergaat de nier van de muis UPR, waardoor geactiveerde PERK eukaryote translatie-initiatiefactor 2-subeenheid alfa (eIF2) fosforyleert om de vertaling van NFKBIA te remmen [60]. Om deze reden is het mogelijk dat een toename van NFKBIA-mRNA niet veel van de NF-KB-route remt, waardoor transcriptie van ontstekingsfactoren is toegestaan ​​(Figuur 5L).

Sobbe et al. [61] toonde aan dat zowel de klassieke (RelA-p50) als de alternatieve (RelB-p52) NF-KB-routes actief waren in met Stx geïnjecteerde muizen en de opregulatie van RelA-doelwitcytokines CCL20, CXCL1 en CXCL10 detecteerden die ook differentieel tot expressie kwamen in onze gegevensset (Figuur 5L).

3.2.6. Activiteit (VI), door Stxs geïnduceerde apoptose

Gesplitst caspase 3 is gevonden bij Stxs-geassocieerde celdood [13,15,62]. Er is aangetoond dat caspase-3 activering of inductie van apoptose door Stxs plaatsvindt in de context van RSR en UPR. Bij door Stxs geïnduceerde RSR zijn zowel p38 MAPK- als JNK-routes betrokken [15] en wordt ERK-activatie gerapporteerd [55]. Het is daarentegen bekend dat UPR NF-KB-, JNK- en p38 MAPK-routes induceert. CHOP (DDIT3) onder UPR blijkt betrokken te zijn bij apoptose [63] en het is ook aangetoond bij Stxs-geassocieerde apoptose [13]. Er is ook melding gemaakt van JNK-betrokkenheid bij door UPR geïnduceerde apoptose [64]. In onze dataset zijn verschillende DEG's zoals CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN en JUNB betrokken bij RSR en UPR (Figuur 5B,F).

3.3. Circadiane ontregeling door Stx2

Een toename van serum-endotheline-1 (ET-1, EDN1) treedt op bij STEC-HUS-patiënten [65]. Ook induceert Stx2 experimenteel EDN1-expressie door signaaltransductiecascades te activeren waarbij MAPK's betrokken zijn [66], terwijl bekend is dat UPR EDN1-transcriptie induceert [67]. In onze dataset induceerde de Stx2-behandeling EDN1-expressie in zowel muizennieren als menselijke proximale tubulaire cellen (Figuur 5G). Omdat EDN1-genexpressie een gemeenschappelijke noemer was van proximale tubulaire epitheelcellen van muizennieren en menselijke proximale tubulaire epitheelcellen, toont dit aan dat EDN1-expressie, althans gedeeltelijk, in vivo voorkomt in de proximale tubulaire epitheelcellen naast endotheelcellen. Ook induceert uitgescheiden ET-1 EGR1-expressie via MAPK-activering [68]. Onze gegevens bevestigen de opregulatie van EGR1 in de timing waarop EDN1 wordt opgereguleerd (Figuur 5H). EGR1 induceert de circadiane ritme-sleutelfactor PER1-expressie [69], waardoor de amplitude van andere circadiane factoren wordt aangepast (Figuur 5H).

Bij circadiane regulatie reguleert de heterodimeer van CLOCK-BAML1 (ARNTL) PER1 en CRY1. In ruil daarvoor bindt PER1-CRY1 heterodimeer aan CLOCK-BAML1 (ARNTL) om verdere transcriptie van hun eigen transcriptie te onderdrukken, waardoor een negatieve lus van het circadiane ritme ontstaat. Expressiepieken van positieve regulerende genen (CLOCK en BAML1 (ARNTL)) en negatieve regulerende genen (PER1 en CRY1) vinden dus plaats in een afwisselend uur dat wanneer CLOCK en BAML1 (ARNTL) een toename in expressie hebben, PER1 en CRY1 worden verlaagd, en het patroon verandert in de volgende uren. Toen we log{14}}voudige veranderingswaarden van CLOCK en BAML1 (ARNTL) aan de grafiek toevoegden (Afbeelding 5J), vertoonden PER1 en BAML1 (ARNTL) tijdens de eerdere tijdstippen een tegengesteld ritmisch patroon met scherpe/smalle pieken, na 24 uur begonnen de pieken echter dof te worden en voortdurend toe te nemen zonder ritme. Dit impliceert dat Stx2 het circadiane ritme van de nieren beïnvloedde, ook in de proximale tubuli. Hoewel een verder bevestigend experiment nodig is, suggereren onze gegevens, gecombineerd met gepubliceerde literatuur die het PER1-effect op de renale circadiane regulatie op stimuli beschrijft [70,71], mogelijke betrokkenheid van Stx2 bij circadiane ritmestoornissen en effecten op proximale tubulaire functies door het verminderen van nierklokgenen. gereguleerde factoren zoals SGLT1 (SLC5A1) (Figuur 5K). We hebben inderdaad glucosurie waargenomen bij met Stx2-geïnjecteerde muizen die zich voortplanten in een ander onderzoek met Stx1-geïnjecteerde muizen [21], wat wijst op SGLT1 (SLC5A1)-disfunctie in de proximale tubuli (Tabel 3). Voor zover ons bekend is dit het eerste rapport dat aangeeft dat Stx2 betrokken is bij verstoring van het circadiane ritme in de nieren.

4. Conclusies

We hebben belangrijke genen bepaald met betrekking tot proximale tubulus-geassocieerde expressies die werden veranderd door Stx2. Aangenomen wordt dat de differentiële expressie van deze genen het resultaat is van Stx2-activiteiten zoals UPR-inductie, rRNA-depurinatie-geassocieerde RSR en signaaltransductie geïnduceerd door plasmamembraanreceptor Gb3-binding. Het meest tot expressie gebrachte gen, GDF15, kan het gewichtsverlies veroorzaakt door Stx2 beïnvloeden via door de hersenstam beperkte receptoren door de voedselinname te verminderen. Extracellulaire matrix en celadhesie kunnen worden beïnvloed door PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 en CTGF die Stx2-specifieke histopathologie en vervelling veroorzaken. Bovendien kan een verstoring van het circadiane ritme van de nieren door Stx2 resulteren in proximale tubulaire functionele defecten zoals glucosereabsorptie.

5. Materialen en methoden

5.1. Dieren Muizen

(C57BL/6, mannelijk, 19-22 g, specifiek pathogeenvrij) werden gekocht bij Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japan). Voedsel en water werden ad libitum gegeven. Muizen werden gehouden met een standaard licht-donkercyclus van 12 uur: 12 uur, waarbij het licht om 7.00 uur aan is en om 19.00 uur uit. De kamertemperatuur van het dier werd rond de 24 °C gehouden. Alle procedures werden goedgekeurd door het Universitair Dierenzorgcomité.

5.2. Menselijk nierweefsel

In dit onderzoek werd kadaverweefsel zonder enige persoonlijke identificatie gebruikt, en dit wordt door de menselijke onderzoeksrichtlijnen van de universiteit als vrijgesteld beschouwd.

5.3. Cel cultuur

De primaire kweek van menselijke proximale tubulaire tubulaire epitheelcellen (RPTEC) werd gekocht bij Clonetics (Walkersville, MD, VS) en gehandhaafd op 37 °C, 5% CO2-atmosfeer. Cellen werden gekweekt in een groeimedium voor nierepitheelcellen aangevuld met menselijke epidermale groeifactor, hydrocortison, epinefrine, insuline, tri-joodthyronine, transferrine, GA-1000 en FBS.

5.4. Zuivering van LPS-vrij Stx2 LPS-verwijdering uit Stx2 werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [72]. In het kort werd de anti-Stx2 11E10 antilichaam-geconjugeerde kolom gebruikt om de Stx2-fractie te verkrijgen, en de fractie werd vervolgens door Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, VS) geleid. om LPS te verwijderen. De Stx2-fractie werd gefilterd met een 0.2 µm-filter en het LPS-niveau werd getest met Limulus amebocyte-lysaattest (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, VS). Er werd bepaald dat de Stx2-fractie minder dan 0,03 endotoxine-eenheden (EU)/ml bevatte. Het Stx2-varianttype was Stx2a.

5.5. Toediening van Stx2 aan muizen Een dosis 2LD50 (5 ng Stx2/20 g lichaamsgewicht), die muizen binnen vier dagen doodt (Figuur S3A), werd intraperitoneaal bij muizen geïnjecteerd in een volume van 0,1 ml in LPS-vrije zoutoplossing (Otsuka farmaceutisch, Japan). Toxine-injectie werd uitgevoerd tussen 7 en 9 uur 's ochtends, waarbij muizen met een langere tijdsduur om 7 uur Stx2 kregen, gevolgd door bemonstering na 24, 48 en 72 uur om 7 uur 's ochtends.

5.6. Urineverzameling en urineglucosemeting Na 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 en 84 uur Stx2-injectie werd urine afgenomen en werd 10 µl op het Fuji dry chem-glaasje GLU- gedruppeld. P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japan) en urineglucose werden gemeten met Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) in de faciliteit beheerd door. Urine van vóór Stx2-injectie werd gebruikt als 0-uurmonster. Urineverzameling werd uitgevoerd met twee muizen

5.7. Weefselverwerking Na 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 en 72 uur Stx2-injectie werden drie muizen per tijdstip geëuthanaseerd met CO2 en werden de nieren verzameld. De helft van één nier werd gedurende 7 dagen bij 4 ◦C gefixeerd met 4% paraformaldehyde/fosfaatgebufferde zoutoplossing en verwerkt voor de paraffinesectie. Een andere helft van de nier werd gebruikt om RNA te extraheren voor microarray-analyse. Drie muizen zonder enige behandeling werden gebruikt als normale (naïeve of 0 uur) controle. Drie muizen werden geïnjecteerd met PBS (vehikel) en na 72 uur opgeofferd en dienden als vehikelcontrole om aan te tonen dat er verwaarloosbare veranderingen in genexpressies zijn vergeleken met normale controle.

5.8. Periodic Acid-Schiff (PAS) Stain Paraffinecoupes werden gehydrateerd en gekleurd met 0,5% perjoodzuuroplossing, gevolgd door spoelen met gedestilleerd water. Secties werden overgebracht naar Schiff-reagens. Nadat de coupes grondig waren gewassen met 0,6% natriumbisulfietoplossing, werden ze tegengekleurd met hematoxyline.

5.9. Stx2-behandeling in menselijke RPTEC RPTEC-cellen werden behandeld met 10 ng/ml Stx2 gedurende 6, 13 en 19 uur onder 37 °C, 5% CO2. RPTEC zonder Stx2-behandeling werd als controle gebruikt. Per tijdstip werden twee biologische replica's uitgevoerd. Na wassen met PBS werden de cellen gebruikt voor RNA-extractie.

5.10. Vrij zwevende immunofluorescentiekleuring Voor het verwerken van vrij zwevende coupes werd een normale muis geperfuseerd en gefixeerd zoals beschreven in Obata et al. [69]. Vervolgens werden de nieren van muizen uitgesneden en gedurende 3 uur bij 4 °C onder zacht schudden ondergedompeld in 4% PFA/PBS. Weefsels werden gewassen met PBS en cryobeschermd met 30% sucrose/PBS bij 4 °C gedurende de nacht of totdat ze naar de bodem zonken. Dikke bevroren secties (50 µm) werden gesneden met een glijdende microtoom met bevroren instellingen. Secties werden geblokkeerd met 1:50 geit-anti-ratten-IgM-antilichaam in PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, VS) gedurende 1 uur en geïncubeerd met anti-Gb3 / CD77-antilichaam 1:100 in de blokkering. oplossing of isotypecontrole (ratten-IgM) in een aangepaste concentratie als het primaire antilichaam voor een nacht bij 4 ◦C. Na het wassen werden de coupes gedurende 2 uur bij 4 °C geïncubeerd met een secundair antilichaam (anti-rat IgM Alexa Fluor 488, 1:2000 verdunning in PBS). Secties werden gekleurd voor andere probes AQP1 (1:1000 verdunning, Sigma-Aldrich Japan, Tokio, Japan) en CD31 (550274, 1:50 verdunning, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS) met secundaire antilichamen anti-konijn IgG Alexa Fluor 546 (1:2000 verdunning in PBS) en anti-muis IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 verdunning in PBS), respectievelijk. Na wassen met PBS werd de kleuring met 40,6-Diamidino-2-fenylindool (DAPI, D21490, Thermo Fisher) gedurende 15 minuten bij 4 °C uitgevoerd. De secties werden ondergedompeld in vloeistoffen in een putje van de 96-putjesplaat (U-vormig) met een kleine verfblush telkens wanneer de oplossing werd verwisseld. De wasstap werd uitgevoerd in grotere putten, zoals in 12- of 6-putjesplaten. Voor het afdekken werd een waterig montagemedium gebruikt. Voor de preparatie van menselijk weefsel werd de postmortale nier gedurende 2 weken gefixeerd in 20% formaline en verwerkt voor een vrij zwevende preparatie zoals gedaan voor muizenweefsel, met één uitzondering het anti-menselijke CD31-antilichaam (CBL468, 1:20 verdunning, Merck KGaA, Darmstadt , Duitsland) werd gebruikt.

5.11. Microarray-analyse

De helft van de nier wordt ondergedompeld in 2 ml RNALater (Ambion, Austin, TX, VS) bij 4 °C en totaal RNA werd geëxtraheerd met de Rneasy Midi-kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, VS). Muisgenoom 430A 2.0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, VS) werden gebruikt. CEL-bestanden werden verkregen en genormaliseerd met robuuste multi-chip averaging (RMA), berekening van RNA-kopieaantallen, en vouwveranderingen tegen 0 h werden uitgevoerd in R (v.3.6.0) met het bijbehorende pakket affy [73] en RankProd 2.0 [74]. Gegevens worden weergegeven in logboek2-voudige wijzigingswaarden. De dataset is gedeponeerd bij Gene Expression Omnibus (GEO) (toegangsnummer GSE172465). Uit RPTEC-cellen werd totaal RNA geëxtraheerd met RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tokyo, Japan). Oligonucleotide-microarray van het hele menselijke genoom (44K oligonucleotide DNA-microarray, Agilent Technologies, Tokyo, Japan) werd gebruikt voor microarray-experimenten. De totaal-RNA-monsters werden gebruikt voor de bereiding van met Cy5- en Cy3-gelabelde cDNA-probes. Met fluorofoor gelabelde monsters werden op elk glasplaatje gehybridiseerd en gewassen, en vervolgens gescand met een DNA-microarrayscanner (model G2505A; Agilent Technologies). De Feature Extraction and Image Analysis-software (Agilent Technologies) werd gebruikt om elke plek in de array te lokaliseren en af ​​te bakenen en om de intensiteiten te integreren, die vervolgens werden gefilterd en genormaliseerd met behulp van de lokaal gewogen scatterplot-afvlakkingsmethode. De reproduceerbaarheid van microarray-analyse werd beoordeeld door twee herhalingen van kleurstofwisseling in elk experiment. Verschillen in mRNA-expressie tussen controle en met Stx2-behandelde RPTEC geoogst na 6, 10 of 19 uur werden vergeleken. Gegevens in TXT-formaat van GeneSpring-software werden gebruikt om gennamen te bepalen op basis van de probe-ID en om vouwveranderingen om te zetten in log2-vouwveranderingen. De dataset is gedeponeerd bij GEO (toegangsnummer GSE172466).

5.12. Bio-informaticaanalyse van microarraygegevens en visualisatie In zowel muizennier- als RPTEC-microarraygegevens nemen genen die voor beide gemeenschappelijk zijn en waarbij de verandering in expressie meer dan een 2-voudig was toe of af (of een log2-voudige verandering is ofwel kleiner dan −1 of groter dan 1) op elk tijdstip geselecteerd door R. Bovendien, in microarraygegevens van muizennieren. Genveranderingen die in kubieke curven passen, werden gekozen met behulp van R-pakket maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (laatst geraadpleegd op 4 januari 2022)] [75]. De kubieke curve is geschikt om de toename of afname van die genen gedurende een tijdsverloop op te vangen. Een hogere polynomiale graad, zoals een kubieke curve, maakt het mogelijk om genen met meerdere veranderingen gedurende het tijdsverloop beter te selecteren dan een kwadratische curve. Genen die zich volgens een vergelijkbaar traject gedroegen, werden geclusterd en hun afname-/toenamepatronen werden gevisualiseerd door een heatmap met behulp van R-pakket-gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (laatst bezocht op 4 januari 2022)] [76]. Genontologie (GO) werd toegewezen en functies van GO onder gemeenschappelijke genen werden verrijkt met behulp van Metascape [//metascape.org (laatst geraadpleegd op 4 januari 2022)] [77]. De verbinding/relatie van gemeenschappelijke genen werd geanalyseerd met behulp van STRING [https://string-db.org/ (laatst geraadpleegd op 4 januari 2022)] [78]. De associatie tussen gemeenschappelijke genen werd handmatig gezocht en met behulp van de tekstminingfunctie van STRING.

Referenties

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. Het hemolytisch-uremisch syndroom.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [KruisRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. Het hemolytisch-uremisch syndroom: een onderzoek naar nierpathologische veranderingen.Ben. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Doe zijn.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Vermindering door verotoxine van de tubulaire functie draagt ​​bij aan de nierschade die wordt waargenomen bij hemolytisch uremisch syndroom.J. Infecteren.1993, 27, 339–341. [KruisRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Activering van Src-familiekinase ja geïnduceerd door binding van Shiga-toxine aan globotriaosylceramide (Gb3 / CD77) in in wasmiddel onoplosbare microdomeinen met lage dichtheid.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [KruisRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga-toxinebinding aan globotriaosylceramide induceert intracellulaire signalen die de hermodellering van het cytoskelet in van menselijke niercarcinoom afgeleide cellen bemiddelen.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [KruisRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Furine-geïnduceerde splitsing en activering van Shiga-toxine.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [KruisRef] 

7. Majoul, ik.; Ferrari, D.; Söling, HD Reductie van eiwitdisulfidebindingen in een oxiderende omgeving. De disulfidebrug van de A-subeenheid van choleratoxine is gereduceerd in het endoplasmatisch reticulum.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [KruisRef] 

8. Lepeler, RA; Watson, politie; Marsden, CJ; Smith, gelijkstroom; Moore, KAH; Kok, JP; Heer, JM; Roberts, LM Eiwitdisulfide-isomerase reduceert ricine tot zijn A- en B-ketens in het endoplasmatisch reticulum.Biochem. J.2004, 383, 285–293. [KruisRef] 

9. Yu, M.; Haslam, DB Shigatoxine wordt getransporteerd vanuit het endoplasmatisch reticulum na interactie met de luminale chaperonne HEDJ / ERdj3.Infecteren. Immuun.2005, 73, 2524–2532. [KruisRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga-toxine B-subeenheid bindt aan de chaperonne BiP en het nucleolaire eiwit B23.Biol. Cel2006, 98, 125–134. [KruisRef]