Swertiajaponin remt huidpigmentatie door dubbele mechanismen om tyrosinase te onderdrukken Deel 2

Cistancheis een veel voorkomend kruid dat bekend staat als "het wonderkruid dat het leven verlengt". Het belangrijkste bestanddeel is cistanoside, dat verschillende effecten heeft, zoals antioxiderende, ontstekingsremmende en immuunfunctiebevordering. Het mechanisme tussen cistanche en het bleken van de huid ligt in het antioxiderende effect van cistanche-glycosiden.

Melanine in de menselijke huid wordt geproduceerd door de oxidatie van tyrosine gekatalyseerd door tyrosinase, en de oxidatiereactie vereist de deelname van zuurstof, dus de zuurstofvrije radicalen in het lichaam worden een belangrijke factor die de melanineproductie beïnvloedt.Cistanchebevat cistanoside, een antioxidant en kan de vorming van vrije radicalen in het lichaam verminderen, waardoor de melanineproductie wordt geremd.

Klik op Cistanche Tubulosa om het bleken van de huid te verbeteren

Vraag voor meer:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

In aanvulling,cistancheheeft ook de functie om de productie van collageen te bevorderen, wat de elasticiteit en glans van de huid kan verhogen en beschadigde huidcellen kan helpen herstellen.

CistancheFenylethanol Glycosiden hebben een significant neerwaarts regulerend effect op de tyrosinase-activiteit, en het effect op tyrosinase blijkt een competitieve en omkeerbare remming te zijn, wat een wetenschappelijke basis kan vormen voor het ontwikkelen en gebruiken van de witmakende ingrediënten in Cistanche.

Daarom,cistancheheeft daarin een sleutelrolbleken van de huid. Het kan de productie van melanine remmen om verkleuring en dofheid te verminderen; en bevordert de collageenproductie om de elasticiteit en glans van de huid te verbeteren. Vanwege de wijdverbreide erkenning van deze effecten van cistanche, zijn veel producten voor het bleken van de huid begonnen met het infuseren van kruideningrediënten zoals Cistanche om aan de vraag van de consument te voldoen, waardoor de commerciële waarde van Cistanche in producten voor het bleken van de huid is toegenomen.

Samengevat, de rol van cistanche bij het bleken van de huid is cruciaal. Het antioxiderende effect en het collageenproducerende effect kunnen verkleuring en dofheid verminderen, de elasticiteit en glans van de huid verbeteren en zo eenblekend effect. Ook toont de brede toepassing van Cistanche in producten voor het bleken van de huid aan dat de rol ervan in commerciële waarde niet kan worden onderschat.

Swertiajaponine remt door UVB geïnduceerde MAPK-activering

Van oxidatieve stress is aangetoond dat het melanogenese stimuleert door opregulering van microphthalmia-associated transcription factor (MITF), een transcriptiefactor die tyrosinase-genexpressie induceert [4, 14]. We hebben onderzocht of het antioxidatieve effect van swertiajaponin de MITF-activiteit kan reguleren. Western-blottinggegevens toonden aan dat UVB-blootstelling de gefosforyleerde MITF verhoogde, een actieve vorm van MITF, terwijl behandeling met swertiajaponine bij 10 μM dit verminderde (Figuur 6A). Consequent werd een UVB-gemedieerde toename van het tyrosinase-eiwitniveau verminderd door behandeling met swertiajaponine (Figuur 6A). Omdat is aangetoond dat oxidatieve stress MITF activeert via mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) [15, 16], werd onderzocht of swertiajaponin de MAPK-signalering kan controleren. Blootstelling aan UVB zorgde voor een dramatische toename van de fosforylering van ERK, JNK en p38 (Afbeelding 6B), wat verband houdt met de door UVB geïnduceerde ROS- en ONOO-productie in B16F10-cellen (Afbeelding 5C- 5D). Swertiajaponin-behandeling alleen bij 10 μM verlaagde de eiwitniveaus van MAPK's (Figuur 6B). Dit resultaat komt overeen met de antioxidatieve activiteit van swertiajaponine omdat de afname van UVB-geïnduceerde cellulaire oxidatieve stress pas duidelijk was bij 10 μM swertiajaponine (Figuur 5C-5D).

Hoewel swertiajaponin de belangrijkste verbinding is van het hele kruid Swertia japonica dat als een Japans medicijn is gebruikt, heeft ons onderzoek geen sluitend bewijs opgeleverd over de veiligheid van swertiajaponin voor toepassing op de menselijke huid. Swertiajaponine vertoonde echter geen cytotoxiciteit in cellijnen van Hs27 (menselijke fibroblast), HaCat (menselijke keratinocyt) en B16F10 (muismelanoom) in onze experimentele setting. Bovendien waren er geen zichtbare tekenen van cytotoxiciteit, waaronder vorming van celresten of celloslating op basis van microscopische observatie toen swertiajaponin werd behandeld in het model van de menselijke huid met concentraties die geen cytotoxiciteit in de cellijnen vertoonden. Aangezien veiligheidskwesties de belangrijkste zorgen zijn van huidblekende verbindingen die momenteel beschikbaar zijn, zijn verdere in vivo studies nodig om hun veiligheid in fysiologie te onderzoeken.

Samen remde swertiajaponine de ophoping van melanine tot een bevredigende limiet, zowel in de cel- als in de menselijke huidmodellen door dubbele mechanismen om tyrosinase te onderdrukken door directe binding aan en competitieve remming van tyrosinase en door oxidatieve stress-gemedieerde MAPK/MITF-signalering te onderdrukken (Figuur 7). Gezien de nadelige effecten en het gebrek aan effectiviteit op lange termijn van bekende huidbleekmiddelen zoals kojiczuur en arbutine [17], kan swertiajaponine veiliger worden toegepast om huidpigmentatie te onderdrukken en zou het een nieuw additief zijn voor bleekcosmetica.

MATERIALEN EN METHODES

Tyrosinase-activiteitstest met behulp van paddestoeltyrosinase

Swertiajaponine en kojiczuur (50 μM) werden geladen in een 96-well-microplaat (Nunc, Denemarken) in tyrosinasebuffer (200 μl) die paddestoeltyrosinase (1000 U), 1 mM L-tyrosine-oplossing en 50 mM fosfaat bevatte buffer (pH 6,5) [5]. De plaat werd gedurende 15 minuten bij 37°C geïncubeerd en dopaquinon werd geëvalueerd door middel van spectrofotometrie (450 nm). Op basis van de meting werd de IC50 berekend met behulp van log-lineaire krommen en hun vergelijkingen.

Docking-simulatie van swertiajaponine en tyrosinase

AutoDock Vina werd gebruikt voor de in silico eiwit-ligand docking-simulatie. De driedimensionale structuur van tyrosinase werd gebruikt in de kristalstructuur van Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). De vooraf gedefinieerde bindingsplaats van tyrosine werd aangebracht als een dockingpocket. Nadat koppelingssimulaties tussen tyrosinase en swertiajaponine of kojiczuur waren uitgevoerd, werd de LigandScout 3.0-software gebruikt om bindingsresiduen tussen verschillende verbindingen en tyrosinase te voorspellen.

Kinetische analyse van tyrosinaseremming door swertiajaponine

L-DOPA werd bereid in concentraties van 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 en 0.0625 mM, en swertiajaponin werd bereid bij 20, 40 en 80 μM. De oplossing van het reactiemengsel werd bereid in een 96-putjesplaat, waarin 20 μl tyrosinasesubstraat (L-DOPA), 10 μl van een waterige champignontyrosinaseoplossing (200 U) en 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 6.5) zijn toegevoegd. De productiesnelheid van dopachrome van het reactiemengsel werd gemeten bij een golflengte van 450 nm met behulp van een microplaatlezer. De tyrosinase-remmingssnelheid van swertiajaponine werd vervolgens berekend met behulp van Lineweaver-Burk-plotanalyse. De Michaelis-constante (Km) en maximale snelheid (Vmax) werden ook berekend door Lineweaver-Burk-plots met verschillende concentraties L-DOPA-substraat [3].

Celkweek en levensvatbaarheidstest

B16F10-melanoomcellen werden gekocht bij de Korea Cell Line Bank. De cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 5 procent foetaal runderserum (FBS) en 1 procent penicilline, streptomycine, L-glutamine en natriumpyruvaat. De cellen werden op 37 graden gehouden in een bevochtigde atmosfeer van 95 procent lucht/5 procent CO2. Voor de cellevensvatbaarheidstest werden cellen geënt in 96-putjesplaten. B16F10-melanoomcellen werden gedurende 48 uur behandeld met swertiajaponine in verschillende concentraties. Ez-Cytox (10 μl) werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 2 uur geïncubeerd. De gevormde formazankristallen werden gemeten door middel van spectrofotometrie bij 450 nm. De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend met behulp van cellen zonder behandeling met swertiajaponine als controlegroep.

Melaninegehalte in B16F10-cellen

Het melaninegehalte werd gemeten met behulp van de eerder beschreven methode met kleine aanpassingen [18]. B16F10-cellen mochten groeien tot 70-80 procent confluentie in 6-well-platen. De cellen werden gedurende 2 uur voorbehandeld met swertiajaponine of kojiczuur. Daarna werd MSH of UVB behandeld met het swertiajaponine- of kojiczuur-bevattende medium en nog eens 48 uur geïncubeerd. Na wassen met PBS werden de cellen losgemaakt met behulp van trypsine en opgelost in 90 ul 1 N NaOH-oplossing die DMSO (5 procent) bevatte. Na incubatie gedurende 1 uur bij 60 graden werd het melaninegehalte bepaald door de absorptie bij 405 nm te meten. Een in de handel verkrijgbare UV-kamer (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea) werd gebruikt voor de UVB-blootstelling van B16F10-cellen.

Western-blotten

Eiwitmonsters geïsoleerd uit B16F10-cellen (30 µg) werden gescheiden door middel van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese met behulp van 10-12 procent acrylamidegels en overgebracht naar polyvinylideenfluoridemembranen, die vervolgens onmiddellijk in blokkeerbuffer werden geplaatst ( 5 procent magere melk) in 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl en 0,1 procent Tween 20. Het membraan werd gewassen in TBS-Tween-buffer gedurende 30 minuten en vervolgens geïncubeerd met specifieke primaire antilichamen (1:1{ {24}} verdunning) aangegeven in de figuurlegenda's bij 4 graden 's nachts. Na wassen met TBS-Tween-buffer werd het membraan geïncubeerd met een mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-muis-antilichaam (Santa Cruz, 1: 10,000), een anti-konijn-antilichaam (Santa Cruz, 1: 10, 000), of een anti-geit-antilichaam (Santa Cruz, 1: 10.000) bij 25 graden gedurende 1 uur. De immunoblots werden gevisualiseerd met behulp van Western Bright Peroxide-oplossing (Advansta, CA, VS) en ChemiDoc Touch-beeldvormingssysteem (Bio-Rad, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Antilichamen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn de volgende: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tyrosinase (celsignalering-104976), pMITF (Abcam{{40 }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (celsignalering-921L), p38 (celsignalering-9212S), pERK (celsignalering-4370L ), ERK (celsignalering-9201L), pJNK (celsignalering-9251L), JNK (celsignalering-9252S) en -actine (Santa Cruz-47778) .

Meting van ROS- en ONOO-niveaus

De antioxidatieve activiteit van swertiajaponine werd onderzocht met fluorescerend 2,{1}}dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFDA) voor ROS en dihydrorhodamine (DHR) 123 voor ONOO-. In het kort, om het ROS-niveau te bepalen, werd DCFDA (25 μM) toegevoegd aan celhomogenaten voor een eindvolume van 250 µl. Om het ONOO-niveau te meten, werd 10 µl celhomogenaten toegevoegd aan een rhodamine-oplossing (50 mM natriumfosfaatbuffer, 90 mM natriumchloride, 5 mM diethyleentriaminepenta-azijnzuur [DTPA] en DHR123). Voor beide assays werd de fluorescentie elke 5 minuten gedurende 30 minuten gemeten op een fluorescentieplaatlezer, met excitatie- en emissiegolflengten ingesteld op respectievelijk 485 en 530 nm.

Melanine-accumulatie in een menselijk huidmodel

Een levensvatbare, gereconstitueerde, driedimensionale menselijke epidermis (Neoderm-ME, Tego Science) werd gebruikt om het anti-melanogene effect van swertiajaponine in een menselijk huidmodel te onderzoeken. Het model van de menselijke huid werd gedurende 1 uur voorbehandeld met DMSO (vehiculum) of swertiajaponin en gedurende 5 dagen gekweekt in de door het bedrijf geleverde onderhoudsmedia met behandeling met DMSO of swertiajaponin. Microscopische analyse werd uitgevoerd van dag 1 tot dag 5 om huidpigmentatie waar te nemen. De microscopische beelden werden geanalyseerd door Image J-software om het donker worden van de huid semi-kwantitatief te maken. Voor Fontana-Masson-kleuring werden huidmonsters 's nachts bij kamertemperatuur gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde en de monsters werden geanalyseerd door een in de handel verkrijgbaar bedrijf (Garam Meditech, Zuid-Korea).

statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Verschillende groepen werden vergeleken met behulp van een eenzijdige variantieanalyse gevolgd door Dunnett's post-test. P < 0.05 werd als statistisch significant beschouwd.

BELANGENCONFLICTEN

Er zijn geen belangenconflicten om te melden.

FINANCIERING

Dit werk werd ondersteund door Grant K17281 van het Korea Institute of Oriental Medicine, Ministry of Education, Science and Technology (MEST), Republiek Korea.

REFERENTIES

1. Bradford PT. Huidkanker in de huid van kleur. Dermatol verpleegsters. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Chemische en instrumentele benaderingen om hyperpigmentatie te behandelen. Pigmentcel Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Zoon S, Yun HY, Maan KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Maan HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5- (gesubstitueerde benzylideen)thiazol-4(5H)-on-derivaten als nieuwe tyrosinaseremmers. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, et al. (Z)-5-(2,4-dihydroxybenzylideen)thiazolidine- 2,4-dion voorkomt door UVB geïnduceerde melanogenese en rimpelvorming door oxidatieve stress in HRM te onderdrukken{{7} } haarloze muizen. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, et al. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihydroxyfenyl)thiazolidine- 4-carbonzuur voorkomt door UV veroorzaakte rimpelvorming door NF-kappaB-gemedieerde ontsteking te remmen. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonols van Heterotheca omvatten: tyrosinase-remmende activiteit en structurele criteria. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identificatie van residuen van de actieve plaats die betrokken zijn bij metaalcofactorbinding en stereospecifieke substraatherkenning in zoogdiertyrosinase. Implicaties voor de katalytische cyclus. Biochemie. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoïden als paddenstoelentyrosinaseremmers: een fluorescentie-dovende studie. J Agric Food Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoïde-derivaten als krachtige tyrosinaseremmers - een overzicht van recente bevindingen tussen 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Studies over de bestanddelen van Swertia japonica. II. Isolatie en structuur van nieuwe flavonoïde, swertiajaponin. Chem Pharm Bull (Tokio). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Effecten van Swertia japonica-extract en de belangrijkste verbinding swertiamarin op maaglediging en gastro-intestinale motiliteit bij muizen. Fitotherapie. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Remmend effect van 2-methyl-nafto[1,2,3-de]chinoline-8-one op melanosoomtransport en huidpigmentatie. Wetenschappelijk Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. De rol van flavonoïden bij oxidatieve stress. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Jonge bladeren van riet (Phragmites communis) onderdrukken melanogenese en oxidatieve stress in B16F10-melanoomcellen. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signaalroutes in melanogenese. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihydromyricetin van Ampelopsis grossedentata remt melanogenese door de neerwaartse regulatie van MAPK-, PKA- en PKC-signaalroutes. Chem Biol-interactie. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Extract van Ganoderma formosanum mycelium als een zeer krachtige tyrosinaseremmer. Wetenschappelijk Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimuleert genexpressie van tyrosinase en melanogenese in gedifferentieerde melanocyten. Pigmentcel Res. 2001; 14: 328-36.