Synergetische immuniteit en bescherming bij muizen door co-immunisatie met DNA-vaccins die coderen voor het piekeiwit en andere structurele eiwitten van SARS-CoV-2

Samenvatting:De opkomst van nieuwe varianten van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS CoV-2) heeft geleid tot terugkerende wereldwijde infectie-uitbraken. Deze sterk gemuteerde varianten verminderen de effectiviteit van de huidige vaccins tegen de ziekte van coronavirus 2019 (COVID-19), die zijn ontworpen om zich alleen op het spike-eiwit (S) van het oorspronkelijke virus te richten. Met uitzondering van de S van SARS-CoV-2 is het immuunbeschermende potentieel van andere structurele eiwitten (nucleocapside, N; envelop, E; membraan, M) als vaccindoelantigenen nog steeds onduidelijk en de moeite waard om te onderzoeken. In deze studie werden synthetische DNA-vaccins ontwikkeld die coderen voor vier structurele SARS-CoV-2-eiwitten (pS, pN, pE en pM), en werden muizen geïmmuniseerd met drie doses via intramusculaire injectie en elektroporatie. Met name induceerde co-immunisatie met twee DNA-vaccins die de S- en N-eiwitten tot expressie brachten hogere neutraliserende antilichamen en was effectiever in het verminderen van de SARS-CoV-2 virale last dan het S-eiwit alleen bij muizen. Bovendien induceerde pS-co-immunisatie met pN of pE + pM een hogere S-eiwitspecifieke cellulaire immuniteit na drie immunisaties en veroorzaakte mildere histopathologische veranderingen dan pS alleen na de prikkeling. De rol van de geconserveerde structurele eiwitten van SARS-CoV-2, inclusief de N/E/M-eiwitten, moet verder worden onderzocht op hun toepassingen in het ontwerpen van vaccins, zoals mRNA-vaccins.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Trefwoorden: COVID-19; SARS-CoV-2}}; co-immunisatie; DNA-vaccin; spike-eiwit; structureel eiwit

1. Inleiding

Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is de oorzaak van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19), die wereldwijd miljoenen infecties en sterfgevallen heeft veroorzaakt en de menselijke gezondheid en de wereldeconomie in gevaar heeft gebracht . Hoewel effectieve therapeutische benaderingen nog steeds niet beschikbaar zijn, hebben ze snel vooruitgang geboekt, waaronder de toepassing van CAR-T-celtherapie en nanotechnologie [1,2]. Vaccinatie is een effectieve manier om de pandemie onder controle te houden, en verschillende vaccins zijn goedgekeurd voor gebruik door verschillende regelgevende gezondheidsinstanties [3,4]. Het coronavirusgenoom codeert voor vier belangrijke structurele eiwitten, namelijk de spike- (S), nucleocapside- (N), membraan- (M) en envelop-eiwitten (E), die verantwoordelijk zijn voor de assemblage van virionen en de onderdrukking van de immuunrespons van de gastheer [5]. ]. Het S-eiwit is samengesteld uit 1273 aminozuurresiduen die twee subeenheden bevatten, namelijk S1 en S2. Het bemiddelt in het binnendringen van virussen en is een belangrijk doelwit voor de ontwikkeling van vaccins tegen het coronavirus [6–11]. Het SARS-CoV-2 S-eiwit heeft echter een hoge mutatiefrequentie. Het is niet verrassend dat bij SARS-CoV-2, een RNA-virus, de mutatie continu en onvermijdelijk is. Er zijn sinds september 2020 vijf zorgwekkende SARS-CoV-2 varianten (VOC) opgedoken, waaronder B.1.1.7 (VK, alfa), B.1.351 (Zuid-Afrika, bèta), P.1 (Brazilië, Gamma), B.1.617.2 (India, Delta) en B.1.1.529 (Zuid-Afrika, Omicron) (Andreano en Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Ze hebben allemaal verschillende mutaties in het spike-eiwit [12]. Deze varianten bedreigen de effectiviteit van de huidige COVID-19-vaccins, die zijn ontworpen om zich alleen op het spike-eiwit te richten.

Het N-eiwit van SARS-CoV-2 bindt aan viraal RNA via een 140-aminozuurlang RNA-bindend domein in de kern ervan, op een 'kraal aan een touwtje'-manier. Het is sterk geconserveerd onder de coronavirussen en deelt een sequentie-identiteit van ~90% met die van SARS-CoV, en het is ook het enige structurele eiwit in het virion [13]. Bovendien speelt het een belangrijke rol bij het verpakken van viraal RNA in het ribonucleo-capsidecomplex en is het noodzakelijk voor de replicatie van viraal RNA, de assemblage van virionen en de afgifte uit gastheercellen [14]. Gebaseerd op de hoge sequentie-overeenkomst van het N-eiwit in coronavirussen, kan het worden voorgesteld als kruisbeschermingsvaccindoelwit. We hebben eerder ontdekt dat co-immunisatie met twee DNA-vaccins die E- en M-eiwitten tot expressie brengen gedeeltelijke bescherming biedt tegen SARS-CoV-2, en deze methode moet worden overwogen tijdens de vaccinontwikkeling [15]. Afhankelijk van het landschapsdocument van de WHO zijn er gewoonlijk zeven strategieën voor SARS-CoV-2-vaccinkandidaten, die verder kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën: ten eerste, op eiwitten gebaseerde vaccins, inclusief geïnactiveerde virusvaccins, virusachtige deeltjes en eiwitsubeenheidvaccins; ten tweede, op genen gebaseerde vaccins, waaronder vaccins met virusvectoren, DNA-vaccins en mRNA-vaccins; ten derde een combinatie van zowel op eiwitten gebaseerde als op genen gebaseerde benaderingen, zoals levend verzwakte virusvaccins. DNA-technologieën kunnen, als nieuwe, op genen gebaseerde vaccinstrategieën, snel meerdere vaccinkandidaten en -strategieën vergelijken tijdens preklinische tests [16,17]. Theoretisch zijn bijna alle virale eiwitten potentiële immunogenen en vaccindoelen. Voor zover wij weten moeten de immunogeniciteit en het beschermende potentieel van synthetische DNA-vaccins bij het coderen van SARS-CoV-2 S-eiwitten en andere structurele eiwitten echter nog niet systematisch worden gerapporteerd. Vier DNA-vaccins die SARS-CoV-2 S-, N-, E- en Ml-eiwitten tot expressie brengen, werden geëvalueerd op hun immunogeniciteit en beschermende werkzaamheid bij muizen om de immunologische effecten van S in combinatie met andere structurele eiwitten te onderzoeken.

2. materialen en methoden

2.1. Cellen

Huh7.5-cellen en menselijke embryonale nier-293T-cellen werden gedurende het hele onderzoek bij 37 ◦C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gekweekt. De cellen werden gekweekt in DMEM-medium (HyClone, Logan, UT, VS), aangevuld met 10% FBS (GEMINI Co., Shanghai, China) en 1% penicilline-streptomycine (Gibco, New York, NY, VS). Van alle cellijnen werd bevestigd dat ze negatief waren voor besmetting met mycoplasma.

2.2. Constructie van DNA-vaccins die SARS-CoV coderen-2 S/N/E/M

Het voor SARS-CoV-2 S/N-eiwit coderende gen, dat een N-terminale Kozak-sequentie (GCCACC) bevat gevolgd door een initiatiecodon (ATG), werd gesynthetiseerd met behulp van een voor zoogdieren geoptimaliseerd codon (GenScript Co., Nanjing , China). Het werd vervolgens via EcoRI- en XbaI-digestie in de expressievector pcDNA3.1 (+) gekloond en pS/pN (DNA-vaccins) genoemd (Figuur 1A). Het pE/PM-eiwit werd geconstrueerd en geïdentificeerd zoals eerder beschreven [15]. Vaccins werden bereid met behulp van endotoxinevrije Maxiprep-kits (Qiagen, Beijing, China) en sequenties werden bevestigd met behulp van Sanger DNA-sequencing. De expressie van het S/N-eiwit werd bevestigd met behulp van Western-blotting en anti-S (Sino Biological, Beijing, China)/anti-N-antilichamen verdund tot 1:1000. Deze experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [15,18].

Figuur 1. Ontwerp en expressie van op recombinant DNA gebaseerde SARS-CoV-2 S/N-eiwitvaccinconstructen. (A) Schematisch diagram van de op recombinant DNA gebaseerde vaccins die coderen voor SARS-CoV-2 piek- (PS), nucleocapside- (pN), envelop- (pE) en/of membraan- (PM) eiwitten. (B) De doeleiwitexpressie in DNA-vaccins werd gevalideerd via de Western blot-analyse van 293T-cellen getransfecteerd met de pS/pN/pE/pM-plasmiden.

2.3. Immunisatie en uitdaging

Vrouwelijke BALB/c-muizen (Charles River Laboratories, Frankrijk) werden op de leeftijd van 6 weken gehuisvest bij het National Institute of Occupational Health and Poison Control in een omgeving met gecontroleerde vochtigheid van 21 °C en een licht/donkercyclus van 12 uur. Ondertussen werden voedsel en water ad libitum verstrekt en werden alle dierproeven goedgekeurd door de Commissie voor de Ethiek van Dierproeven van het Chinese Centrum voor Ziektecontrole en Preventie (China CDC). Het onderzoek voldeed aan de relevante ethische regelgeving.

Muizen werden willekeurig in vijf groepen verdeeld en geïmmuniseerd met pS/pN alleen of gecoïmmuniseerd met pS + pN of pS + pE + PM op dagen 0, 21 en 42 via intramusculaire injectie plus elektroporatie (35 mg/50 ml) (Figuur 2) [19,20]. In het kort werden DNA-vaccins geïnjecteerd in de tibialis anterior (TA) spier en onmiddellijk gepulseerd met elektriciteit met behulp van een 5 mm uit elkaar geplaatste twee-naalds array-elektrode (ECM830; BTX) met naalden. Sera van de muizen werden verzameld voor analyse van de humorale immuunrespons, en de milten van muizen werden verwerkt om de cellulaire immuunrespons te meten (Figuur 2).

Figuur 2. Schematische voorstelling van de immunisatie en SARS-CoV-2-uitdaging. Tijdsverloop van vaccinatie, challenge en bloed-/weefselmonstername. BALB/C-muizen werden willekeurig in groepen verdeeld.

Er werden SARS-CoV-2-uitdagingsexperimenten uitgevoerd zoals eerder beschreven [15,21]. In het kort werden de muizen verdoofd en vervolgens intranasaal getransduceerd met 2,5 x 108 PFU Ad5-hACE2 in een totaal volume van 45 µl. Vijf dagen na de transductie werden de muizen verdoofd en vervolgens intranasaal uitgedaagd met 1 x 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVC HB-02/2019) in een totaal volume van 50 µl zoutoplossing buffer. Al het werk met live SARS-CoV-2 in muismodellen werd uitgevoerd in laboratoria van Animal Biosafety Level 3 (ABSL-3).

2.4. Enzym-gekoppelde immunosorbenttest

Enzym-linked immunosorbent assays (ELISA) werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [15]. In het kort werden S (gekocht bij Sino Biological)/N-eiwitten (een geschenk van Song) verdund in carbonaatbuffer (0.1 M, pH 9,6) gecoat op 96-well EIA/RIA-platen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) gedurende de nacht bij 4 ◦C. De platen werden gedurende 2 uur bij 37 °C geblokkeerd met 200 µl 10% geitenserum in PBS, gevolgd door vijf keer wassen met PBST. Vervolgens werden serummonsters serieel verdund in 2% geitenserum in PBS toegevoegd en gedurende 2 uur bij 37 °C geïncubeerd, gevolgd door vijf wasbehandelingen met PBST. HRP-geconjugeerd geit-anti-muis IgG Ab (1:5000) werd gedurende 1 uur bij 37 °C toegevoegd. Een totaal van 100 µl TMB-substraat werd aan elk putje toegevoegd en geblust met 50 µl 2M H2S04. De absorptie werd afgelezen bij een golflengte van 450 nm met behulp van SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, China).

cistanche plantverhogend immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Experimenten met pseudovirusinfectie en neutralisatie

De pseudovirusneutralisatietest werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [21,22]. Er werd eerder een plasmide geconstrueerd dat het voorouderlijke virus-S-eiwit tot expressie bracht [22]. Het Omicron-variant SARS-CoV-2 spike-eiwitgen (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) werd gesynthetiseerd (een geschenk van Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) met behulp van een voor zoogdieren geoptimaliseerd codon en gekloond in de pcDNA3.1-vector, zoals eerder beschreven [22]. In het kort werden plasmiden die een luciferase-reporter tot expressie brengen en plasmiden die het S-eiwit tot expressie brengen, gecotransfecteerd in HEK 293T-cellen met behulp van het X-treme GENE HP DNA-transfectiereagens. De celcultuur werd 6 uur na transfectie ververst en het pseudovirusbevattende supernatant werd na 48 uur geoogst en bewaard bij -70 ◦C. In de pseudovirusneutralisatietest werd vervolgens een gelijk serum-virusmengsel geïncubeerd bij 37 volumes van het pseudovirusbevattende supernatant en vervolgens aan het verdunde serum toegevoegd. ◦C gedurende 1 uur. De Huh7.5-celkweekmedia werden vervolgens vervangen door 100 µl van het serum-virusmengsel en werden 12 uur bij 37 °C geïncubeerd. Cellen gekweekt met alleen SARS-CoV-2 pseudovirussen werden parallel gelopen. De media werden vervolgens vervangen door DMEM (2% FBS) en de incubatie werd 48 uur bij 37 °C geïncubeerd. Vervolgens werd het luciferasesignaal gemeten met behulp van de Bright-Glo vuurvliegluciferasekit (Promega).

2.6. SARS-CoV-2 neutralisatietest

In dit experiment werd SARS-CoV-2 (Wuhan/IVC-HB-02/2019) gebruikt. In het kort werden de sera tweevoudig verdund vanuit een startverdunning van 1:10, gemengd met een gelijk volume (10–15 pfu/putje) levend SARS-CoV-2, en gedurende 1 uur bij 37 ◦C geïncubeerd, waarna ze werden toegevoegd aan de geplaatste Vero-cellen. Na 48 uur incubatie bij 37 °C werd een cytopathisch effect (CPE) waargenomen en werd 100 µl van het kweeksupernatant geoogst voor nucleïnezuurextractie en real-time fluorescentie reverse transcriptie PCR (RT-PCR). De mediane neutralisatiedosis (ND50) werd berekend met behulp van de Reed-Munch-methode [15].

2.7. IFN-ELISpot-test

De peptidepools die het gehele S/N/E/M-eiwit omspannen als opeenvolgende 15-meren over 10 aminozuren heen, werden gesynthetiseerd door Scilight Biotechnology, LLC. Per flesje was ongeveer 2,5 mg van elk gezuiverd peptide in de peptidepool aanwezig. Het experiment werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [18]. In het kort werden platen met 96-putjes (BD ELISPOT Set, VS) gecoat met anti-IFN-capture Ab en een nacht bij 4 ◦C geïncubeerd. Na driemaal wassen werden de platen geblokkeerd met het volledige kweekmedium. Splenocyten werden geoogst nadat de muizen op dag 35 en 120 waren geëuthanaseerd. Verse eencellige suspensies van elke groep werden uitgeplaat met 5 x 106 per putje, en peptiden werden toegevoegd. De platen werden vervolgens 22 uur bij 37 °C in 5% CO2 geïncubeerd en gedetecteerd met behulp van een ELISpot-plaatlezer (Biosys, So. Pasadena, CA, VS). Een spotvormende eenheid (SFU) vertegenwoordigt een T-cel-uitscheidende IFN-.

2.8. Evaluatie van de bescherming bij muizen na SARS-CoV-2 Uitdaging

De experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [15,21]. In het kort werden de longen geoogst nadat de muizen waren geëuthanaseerd. De helft van de weefsels werd gebruikt voor nucleïnezuurextractie, realtime fluorescentie RT-PCR en TCID50. De andere helft werd voor pathologische evaluatie naar het College of Veterinary Medicine van de China Agricultural University gestuurd.

2.9. Statistische analyse

Ongepaarde t-tests, tweeweg-ANOVA-tests en de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-waarden < 0.05 werden als statistisch significant beschouwd (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Resultaten

3.1. Karakterisering van DNA-vaccins

E- en M-eiwitniveaus werden gedetecteerd met behulp van Western-blotting. We maten de expressie van de gecodeerde S/N/E/M-eiwitten van SARS-CoV-2 in HEK-293T-cellen getransfecteerd met pS/pN/pE/pM-plasmiden via Western blot-analyse, met behulp van anti -S/anti-N-antilichamen en een anti-6 x His-antilichaam, in de cellysaten. De banden benaderden het voorspelde molecuulgewicht van de S (140-142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) en M (22-25 kDa) eiwitten (Figuur 1B).

3.2. Robuuste en aanhoudende productie van anti-S en/of anti-N IgG geïnduceerd door pS en/of pN DNA

Vaccins Serum werd verzameld uit BALB/c-muizen na 35, 56, 96 en 120 dagen (Figuur 2). Anti-S/anti-N IgG-niveaus werden gedetecteerd met behulp van ELISA. De omvang van de S- of N-specifieke IgG-respons geïnduceerd door pS of pN was in het serum toegenomen na de eerste en tweede boosts. De anti-S- en anti-N-IgG-titers waren hoger in de pS + pN-groep dan in de andere groepen; het verschil was echter niet statistisch significant (Figuur 3A, B). Er werden geen robuuste E/M-eiwitspecifieke antilichaamreacties gedetecteerd, wat consistent is met de resultaten van een eerder onderzoek (gegevens niet getoond) [15].

Figuur 3. B-celreacties op SARS-CoV-2 in BALB/c-muizen. (A) Serum IgG-bindende eindpunttiters voor de SARS-CoV-2 S (A) en N-eiwitten (B). (C) Neutralisatietiters werden bepaald op basis van een SARS-CoV-2 pseudogetypeerd virussysteem. (D) Anti-SARS-CoV-2 neutralisatietiters werden bepaald met behulp van een SARS-CoV-2-virus. (E) Neutralisatietest gebaseerd op een SARS-CoV-2 Omicron-pseudogetypeerd virussysteem. De remmingsverhoudingen voor de sera uit de nep- (blauw), pS (rood), pS + pN (groen), pS + pE + pM (roze) en pN (oranje) groepen worden weergegeven. Foutbalken vertegenwoordigen de SEM en p-waarden werden berekend met behulp van een tweeweg-ANOVA en de post-hocanalyse van Sidak, waarbij * p < 0.05

3.3. Hoge niveaus van neutraliserende antilichamen geïnduceerd door gelijktijdige immunisatie met pS- en pN-vaccins

De neutraliserende titers van serieel verdunde serummonsters werden bepaald met behulp van het pseudogetypeerde SARS-CoV-2-virus. De hoogste niveaus van neutraliserende antilichamen (nAbs) werden waargenomen in de pS + pN-groep, waarbij de wederzijdse EC50 geometrisch gemiddelde titers 2988 (op dag 35) en 3578 (op dag 56) bereikten (Figuur 3C). Soortgelijke resultaten werden waargenomen met behulp van de microneutralisatietest (MN) met levend virus, waarbij de niveaus van nAbs in de pS + pN-groep hoger waren dan die in de S-groep op dagen 56 en 96 (p < 0.05; Figuur 3D). Bovendien waren de niveaus van nAbs in de pS + pN-groep op dag 56 (tweede boost) significant hoger dan die op dag 35 (p <0,05; Figuur 3D).

De neutraliserende activiteit van elk vaccinregime tegen de SARS-CoV-2 Omicron-variant werd verder bepaald met behulp van het pseudogetypeerde platform en serummonsters. Het neutralisatieprofiel tegen het Omicron-virus op dagen 35 en 56 was vergelijkbaar met dat tegen het voorouderlijke virus (Figuur 3E), wat suggereert dat de PS + pN-behandeling een kruisneutraliserend vermogen had.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

3.4. T-celreacties geïnduceerd door DNA-vaccinatie

Zoals eerder beschreven werden de T-celreacties tegen de SARS-CoV-2 S/N/E/M-antigenen geschat met behulp van IFN-ELISpot, zoals eerder beschreven [15]. Zoals verwacht induceerden zowel het PS + pN- als het pS + pE + pM-regime significant hogere niveaus van IFN + T-cellen specifiek voor het S-eiwit op dag 120 dan op dag 35 (p < 0. 05; Figuur 4A). Bovendien was het aantal IFN+T-cellen specifiek voor het N-eiwit op dag 120 (tweede boost) significant hoger dan dat op dag 35 in de pS+pN-groep (p < 0,05; Figuur 4B). Tenslotte was het aantal IFN+T-cellen specifiek voor het M-eiwit op dag 120 (tweede boost) significant hoger dan dat op dag 35 in beide groepen (p < 0,05; Figuur 4D).

Figuur 4. T-celreacties op SARS-CoV-2 individuele structurele eiwitten in BALB/c-muizen. (A) T-celreacties werden gemeten met behulp van IFN-ELISpot in splenocyten die gedurende 20 uur werden gestimuleerd met overlappende peptidepools die de SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, omspannen en (D) M-eiwitten. Staven vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een tweeweg-ANOVA en de post-hoc-test van Sidak, waarbij * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 en **** p < 0,0001.

3.5. Synergetische bescherming geïnduceerd door gelijktijdige immunisatie met pS/pN of pS/pE/pM

Vervolgens evalueerden we de beschermende werkzaamheid van DNA-vaccins met behulp van hACE2-muizen die na provocatie waren geïmmuniseerd met het voorouderlijke SARS-CoV-2-virus. Na de uitdaging vertoonden de muizen in de nepgroep een geleidelijk gewichtsverlies. Daarentegen vertoonden de muizen die waren geïmmuniseerd met pS of pS+ een mild gewichtsverlies onmiddellijk na infectie, gevolgd door herstel (Figuur 5A). Er werd geen levend virus gedetecteerd in de muizen die waren gevaccineerd met pS, pS + pN of pS + pE + pM. Bovendien verminderde de pS + pN-vaccinatie significant de aantallen virale RNA-kopieën in vergelijking met die verkregen met pS-vaccinatie alleen (p=0.0228; Figuur 5B). Bovendien toonde longhistopathologie aan dat muizen in zowel de nep- als de pN-groep focale plekken van ontsteking, pleurale invaginatie, alveolaire collaps, hoge niveaus van inflammatoire celinfiltratie en hemorragische gebieden vertoonden. Ter vergelijking: muizen behandeld met pS + pN of pS + pE + pM vertoonden mildere histopathologische veranderingen en lagere INHAND-scores na de uitdaging dan de andere groep (Figuur 5C).

Figuur 5. Beschermende werkzaamheid van immunisatie na de uitdaging met levend SARS-CoV-2-virus. (A) Muizen werden dagelijks gewogen (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), n=4) gedurende drie dagen na de uitdaging. (B) Besmettelijke SARS-CoV-2-titer in longhomogenaten op dag drie na de provocatie, zoals bepaald via de TCID5{{10}}-test en het RNA-kopienummer. Statistisch significante verschillen tussen groepen werden bepaald met behulp van een eenrichtings-ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingscorrectie van Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, en **** p < 0,0001). (C) Histopathologische analyse van de longen met behulp van H&E-kleuring.

4. Discussie

In deze studie induceerde co-immunisatie met twee DNA-vaccins die de S- en N-eiwitten tot expressie brengen hoge niveaus van nAbs en was zeer effectief bij het verminderen van de SARS-CoV-2 virale lading bij muizen. DNA-vaccins die het S-eiwit tot expressie brachten, induceerden verhoogde S-eiwit-specifieke cellulaire immuniteitsniveaus na drie immunisaties wanneer muizen werden gecoïmmuniseerd met N/E- en M-eiwitten en verlichtten de histopathologische veranderingen na de prikkeling. Voor zover wij weten is dit het eerste rapport dat de synergetische verbetering van de immuniteit en bescherming bij muizen onthult met behulp van een DNA-vaccin dat codeert voor het S-eiwit, wanneer ze worden geco-immuniseerd met DNA-vaccins die coderen voor andere structurele eiwitten van SARS-CoV.{{8 }}.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

In verschillende onderzoeken zijn immunodominante B-celepitopen in N-antigeengebieden waargenomen. N-gebaseerde vaccins kunnen doorgaans geen nAbs induceren, waarschijnlijk omdat het N-eiwit niet op het virale oppervlak wordt weergegeven. Met name induceerde co-immunisatie met de S- en N-eiwitten hogere niveaus van nAbs tegen het voorouderlijke en Omicron SARS-CoV-2-virus dan de andere groepen. Verhoogde nAb-reacties worden geassocieerd met een betere virale klaring en beschermende werkzaamheid. Onze resultaten toonden aan dat de pS + pN-behandeling effectiever was dan de pS-behandeling alleen bij het verminderen van de SARS-CoV-2 virale last na de besmetting. Een eerder onderzoek meldde dat hamsters die waren geïmmuniseerd met een vaccin dat de M- en N-eiwitten tot expressie bracht, beschermd waren tegen ernstig gewichtsverlies en longpathologie en de virale titers in de orofarynx en longen na SARS-CoV-2-uitdaging aanzienlijk hadden verlaagd. wat consistent is met onze resultaten [23]. Helaas kan de verlaging van de virustiters niet specifiek worden toegeschreven aan het M- of N-eiwit en zijn de nAb-niveaus in dit onderzoek niet geëvalueerd. Eén onderzoek naar het SARS-CoV-2 mRNA-vaccin meldde dat co-immunisatie met S + N een versterkte S-specifieke CD8+ T-celrespons induceerde en de antilichaamactiviteit neutraliseerde, waardoor een betere bescherming in de longen tegen de Delta werd geboden. variant vergeleken met S alleen, wat consistent is met de resultaten van deze studie [24]. Een ander onderzoek meldde dat het N-eiwit van het overdraagbare gastro-enteritiscoronavirus de synthese van neutraliserende antilichamen bevorderde wanneer TGEV-IMMUNE-cellen van varkens in vitro werden gestimuleerd met een combinatie van S- en N-eiwitten, en dit effect zou kunnen worden verklaard door de helper-T-lymfocytenreactie op het N-eiwit [25].

Immunodominante CD4+/CD8+ T-celepitopen in N-antigeengebieden zijn eerder geïdentificeerd. Verschillende onderzoeken hebben gemeld dat vaccins op basis van het SARS-CoV-2 N-eiwit effectief cellulaire immuunreacties induceren. De S+N-groep vertoonde na drie immunisaties verhoogde S-eiwitspecifieke cellulaire immuniteitsniveaus. Eén SARS-CoV-2 mRNA-vaccinonderzoek meldde dat combinatorische S + N een verhoogde S-specifieke CD8+ T-celrespons induceerde vergeleken met S alleen, wat consistent is met onze resultaten [24]. Een ander onderzoek meldde dat T-celreacties op S- en N-antigenen na dual-antigeen hAd5 S + N prime-vaccinatie alleen gelijkwaardig waren aan die van eerder met SARS-CoV-2- geïnfecteerde patiënten, en in silico-voorspellingsmodellen van T-cel epitoop HLA-binding suggereerde dat T-celreacties op het hAd5 S + N-vaccin hun werkzaamheid tegen de B.1.351-variant zullen behouden. Bovendien vertoonde plasma van eerder met SARS-CoV-2-geïnfecteerde patiënten een hogere bindingsaffiniteit voor cellen die het dubbele antigeen S-Fusion + N-ETSD-construct tot expressie brengen dan voor de hAd5 S-Fusion alleen, wat verder suggereert dat de immunogeniciteit van de Het S+N-dubbelantigeenvaccin is beter dan dat van het S-enkelantigeenvaccin [26].

Het levende virus werd niet gedetecteerd in de longen en het gewichtsverlies na de uitdaging werd verminderd in de pS-, pS + pN- en pS + pE + pM-groepen, terwijl de pN-behandeling de virustiter niet effectief verlaagde. Deze bevindingen benadrukken de onmisbaarheid en effectiviteit van het S-eiwit als vaccindoelwit. Met name had co-immunisatie met pS en pN betere effecten op de virale klaring dan pS of pN. De pS + pE + pM-groep duidde op minder histopathologische veranderingen in de longen, wat consistent is met de resultaten van ons vorige onderzoek [15]. De S+N-groep had lage virale RNA-kopieën in de longen, minder gewichtsverlies en een snelle hersteltijd na SARS-CoV-2-uitdaging vergeleken met de groep die alleen met S/N was geïmmuniseerd, wat consistent was met de resultaten van deze studie. Geen van de groepen detecteerde echter de neutraliserende antilichaamtiters, wat verklaard zou kunnen worden door verschillen in vaccinvariëteit en proefdieren [26]. Eén onderzoek naar het SARS-CoV-2 adenovirusvectorvaccin meldde dat het S-vaccin alleen acute hersenbescherming bood wanneer het gelijktijdig werd geïmmuniseerd met een N-vaccin [27]. Een andere studie ontwikkelde Tri: ChAd-, Bi: ChAd- en Mono: ChAd-vaccins die respectievelijk de S1/N/RdRp-, N/RdRp- en S1-eiwitten tot expressie brengen, en testte deze in een B.1.351-diermodel. Uitgebreide grove pathologie werd waargenomen bij de Mono: ChAdlungs, terwijl Bi: ChAd- en Tri: ChAd-longen vrijwel vrij van deze pathologie leken [28].

Bovendien hadden niet-gevaccineerde dieren een hoge virale lading in de longen, terwijl de Tri:ChAd-behandeling de virale lading aanzienlijk verminderde met 3,5 logs. Ter vergelijking: zowel Bi:ChAd- als Mono:ChAd-vaccins verminderden de virale last slechts matig. Deze resultaten suggereren dat het beschermende effect van het S/N-dubbelantigeenvaccin tegen varianten mogelijk beter is dan dat van het S-enkelantigeenvaccin, wat consistent is met onze resultaten [28]. Enkele onderzoeken hebben gemeld dat met N-eiwit geïmmuniseerde muizen ernstige longontsteking ontwikkelen na een SARS-CoV-infectie [29-31]. Eerdere studies hebben ook gemeld dat immunisatie met een adenovirusvectorvaccin dat het N-eiwit van het muizenhepatitisvirus tot expressie brengt, muizen beschermt tegen dodelijke infecties, wat aantoont dat het N-eiwit een beschermend effect zou kunnen genereren [32]. Bovendien had de groep die was geïmmuniseerd met het CRT/N DNA-vaccin een significant verlaagde virale titer na de provocatie, waarbij een vacciniavirus het SARS-CoV N-eiwit tot expressie bracht [33].

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Eén onderzoek naar het S-eiwit toonde aan dat het gecombineerde DNA/eiwit-vaccin zowel humorale als cellulaire immuniteit beter induceerde dan het DNA/eiwit-vaccin alleen [8]. Vaccins die zich alleen op het S-eiwit richten, hebben een verminderde effectiviteit aangetoond bij de bescherming tegen milde tot matige COVID-19 veroorzaakt door opkomende varianten. De rol van geconserveerde structurele SARS-CoV-2-eiwitten, inclusief de N/E/M-eiwitten, verdient aandacht bij het ontwerp en de toepassingen van vaccins, omdat door vaccins geïnduceerde T-celreacties tegen geconserveerde epitopen over het algemeen niet worden beïnvloed door mutaties. . Eén onderzoek meldde dat SARS-herstelde patiënten (n=23) 17 jaar na de uitbraak van 2003 nog steeds T-cellen met langdurig geheugen hadden die reactief waren op het SARS-CoV N-eiwit, wat een robuuste kruisreactiviteit vertoonde met het SARS CoV{ {15}} N-eiwit, waarmee het gebruik van het N-eiwit als kruisbeschermend vaccindoel verder wordt gevalideerd [34]. Deze studie toonde aan dat de pS/pN-co-immunisatie geassocieerd was met hogere nAb-reacties, betere virale klaring en verbeterde cellulaire immuunreacties en mogelijk een betere bescherming biedt na de SARS-CoV-2-uitdaging vergeleken met pS alleen. Bovendien is aangetoond dat SARS-CoV-2-varianten veel diersoorten infecteren, en bij sommige wilde dieren en huisdieren is overdracht van mens op dier waargenomen [7]. Het veterinaire SARS-CoV-2-vaccin heeft dus meer aandacht nodig. Bovendien kan nanotechnologie een krachtig hulpmiddel zijn bij het optimaliseren van vaccins en verdient het meer aandacht [2].

Deze studie heeft verschillende beperkingen. Ten eerste hebben we de DNA-vaccinstrategie alleen bij BALB/c-muizen waargenomen, en toekomstige studies zouden de immunogene effecten van deze vaccinregimes in andere diermodellen moeten beoordelen. Ten tweede is aanvullend onderzoek nodig om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de verhoogde nAb- en S-specifieke CD8 T-celreacties geïnduceerd door co-immunisatie met behulp van de S- en N-eiwitten volledig te begrijpen en om deze kennis te benutten om COVID te optimaliseren-19 vaccin ontwerp. Tenslotte verdient de functie van N-eiwit-specifieke antilichamen verder onderzoek.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Concluderend evalueerde deze studie het immuunbeschermende potentieel van co-immunisatie met de SARS-CoV-2 S-, N-, E- en M-eiwitten. Verschillende vaccins die zich alleen op het S-eiwit richten, hebben een verminderd beschermend effect op de opkomende variantstammen. Onze resultaten zullen een basis leggen voor de ontwikkeling van een kruisreactief COVID-19-vaccin om huidige en opkomende SARS-CoV-2-varianten onder controle te houden en potentiële pandemieën van het coronavirus te voorkomen.

Referenties

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, ik.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Toepassing van CAR-T-celtherapie buiten de oncologie: auto-immuunziekten en virale infecties. Biogeneeskunde 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanotechnologie tegen het nieuwe coronavirus (ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2): diagnose, behandeling, therapie en toekomstperspectieven. Nanogeneeskunde 2021, 16, 497–516. [Kruisref]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID-19 kudde-immuniteit: waar zijn we? Nat. Ds. Immunol. 20, 2020, 583–584. [Kruisref] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Molenaar, lidstaten; Lichty, BD; Xing, Z. Immunologische overwegingen voor COVID-19-vaccinstrategieën. Nat. Ds. Immunol. 20, 2020, 615–632. [Kruisref] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Structurele analyse van het SARS-CoV-2-genoom en voorspellingen van het menselijke interactoom. Nucleïnezuren Res. 2020, 48, 11270–11283. [Kruisref] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mechanismen van SARS-CoV-2 toegang tot cellen. Nat. Ds. Mol. Cel Biol. 23, 3–20 2022. [Kruisref]

7. Conforti, A.; Sánchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. Een kandidaat-lineair DNA-vaccin dat codeert voor het SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain lokt een krachtige immuunrespons uit en neutraliseert antilichamen bij huiskatten. Mol. Daar. Methoden Klin. Ontwikkelaar 2023. [Kruisref]

8. Borgojakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Immunogeniciteit van het DNA/eiwit-gecombineerde vaccin tegen COVID-19. Stier. Uitv. Biol. Med. 2023, 1–4. [Kruisref]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Circulaire RNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 en opkomende varianten. Cel 2022, 185, 1728–1744.e16. [Kruisref]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. SARS-CoV-2 mRNA-vaccinontwerp mogelijk gemaakt door paraatheid van prototypen voor pathogenen. Natuur 2020, 586, 567–571. [Kruisref]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Loge, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. SARS-CoV-2 piekglycoproteïnevaccinkandidaat NVX-CoV2373-immunogeniciteit bij bavianen en bescherming bij muizen. Nat. Gemeenschappelijk. 12, 372 2021. [Kruisref] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, ik.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, ik; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; et al. Hybride immuniteit verbetert B-cellen en antilichamen tegen SARS-CoV-2-varianten. Natuur 2021, 600, 530–535. [Kruisref]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammed, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Inzichten in het SARS-CoV-2-genoom, de structuur, de evolutie, de pathogenese en therapieën: structurele genomica-benadering. Biochim. Biofysiek. Acta Mol. Basis. Dis. 2020, 1866, 165878. [Kruisref] [PubMed]

14. Abbasi, J. India's nieuwe COVID-19 DNA-vaccin voor adolescenten en volwassenen is een primeur. JAMA 2021, 326, 1365. [Kruisref] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Hand.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. DNA-vaccins die de envelop- en membraaneiwitten tot expressie brengen, bieden gedeeltelijke bescherming tegen SARS-CoV-2 bij muizen. Voorkant. Immunol. 13, 2022, 827605. [Kruisref]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morgen, parlementslid; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Intradermaal SynCon®Ebola GP DNA-vaccin is temperatuurstabiel en toont veilig cellulaire en humorale immunogeniciteitsvoordelen aan bij gezonde vrijwilligers. J. Infecteren. Dis. 2019, 220, 400–410. [Kruisref]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, NL; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. Immunogeniciteit van een kandidaat-DNA-vaccin voor COVID-19. Nat. Gemeenschappelijk. 11, 2020, 2601. [Kruisref]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Lied, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. Co-immunisatie met CHIKV VLP en DNA-vaccins induceert een veelbelovende humorale respons bij muizen. Voorste immunol. 12, 2021, 655743. [Kruisref]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Primen met twee DNA-vaccins die het NS3-eiwit van het hepatitis C-virus tot expressie brengen dat zich richt op dendritische cellen, lokt een superieur heteroloog beschermend potentieel uit bij muizen. Boog. Virol. 2015, 160, 2517-2524. [Kruisref]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Verbeterd effect van DNA-immunisatie plus in vivo elektroporatie met een combinatie van kern-PreS1- en S-PreS1-plasmiden van het hepatitis B-virus. Klin. Vaccin Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [Kruisref]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et al. Een core-shell gestructureerd COVID-19 mRNA-vaccin met een gunstig biodistributiepatroon en veelbelovende immuniteit. Signaaloverdracht. Doel Ther. 6, 213 2021. [Kruisref] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Ontwikkeling en effectiviteit van een pseudogetypeerd SARS-CoV-2-systeem zoals bepaald door in vitro neutraliserende efficiëntie en toegangsremmingstest. Biosaf. Gezondheid 2020, 2, 226–231. [Kruisref] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Kuiper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Een replicerend bacteriumvectorvaccin dat SARS-CoV-2 membraan- en nucleocapside-eiwitten tot expressie brengt, beschermt tegen ernstige COVID-19--achtige ziekten bij hamsters. NPJ-vaccins 2021, 6, 47. [Kruisref] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. Combinatorische mRNA-vaccinatie verbetert de bescherming tegen de SARS-CoV-2 delta-variant. bioRxiv 2021. [Kruisref]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Samenwerking tussen structurele eiwitten van het overdraagbare gastro-enteritis coronavirus (TGEV) bij de in vitro inductie van virusspecifieke antilichamen. Virusres. 1996, 46, 111–124. [Kruisref]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Kleermaker, N.; Vorst, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et al. Enkelvoudige immunisatie met recombinante ACAM2000-vacciniavirussen die de piek- en nucleocapside-eiwitten tot expressie brengen, beschermen hamsters tegen door SARS-CoV-2-veroorzaakte klinische ziekten. bioRxiv 2021. [Kruisref]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Klasse, J.; Verdorie.; Richner, JM Een SARS CoV-2 nucleocapsidevaccin beschermt tegen distale virale verspreiding. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Ja, G.; Luo, X.; et al. De toediening van het nieuwe generatie COVID-19-vaccin aan de luchtwegen biedt robuuste bescherming tegen zowel voorouderlijke als variante stammen van SARS-CoV-2. Cel 2022, 185, 896–915.e19. [Kruisref]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Verhoogde expressie van het SARS-CoV-nucleocapside-eiwit in tabak en de immunogeniciteit ervan bij muizen. Vaccin 2009, 27, 5001-5007. [Kruisref]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Voorafgaande immunisatie met het nucleocapside-eiwit van het ernstige acute respiratoire syndroom (SARS)-geassocieerd coronavirus (SARS-CoV) veroorzaakt ernstige longontsteking bij muizen die zijn geïnfecteerd met SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337-6348. [Kruisref]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; et al. De werkzaamheid van het vaccin bij senescente muizen die zijn uitgedaagd met recombinante SARS-CoV-dragende epidemische en zoönotische spike-varianten. PLoS Med. 2006, 3, e525. [Kruisref] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Mouse hepatitisvirus-spike- en nucleocapside-eiwitten die tot expressie worden gebracht door adenovirusvectoren beschermen muizen tegen een dodelijke infectie. J. Generaal Virol. 1993, 74, 2061–2069. [Kruisref] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Opgehangen, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Hij, L.; Chen, PJ; et al. Generatie en karakterisering van DNA-vaccins gericht op het nucleocapside-eiwit van het ernstige acute respiratoire syndroom-coronavirus. J. Virol. 2004, 78, 4638-4645. [Kruisref] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-specifieke T-celimmuniteit in gevallen van COVID-19 en SARS, en niet-geïnfecteerde controles. Natuur 2020, 584, 457–462. [Kruisref]