Gericht op lactaatdehydrogenase A met catechine maakt SNU620/5FU maagkankercellen opnieuw gevoelig voor 5-Fluorouracil deel 1
Mar 23, 2022
Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie
Abstract:Resistentie tegen geneesmiddelen tegen kanker komt voor bij vrijwel elk type kanker en wordt een groot probleem bij de behandeling van kanker. Hoewel 5-fluorouracil (5FU) de eerste keus is voor antikankertherapie voor maagkanker, is de effectiviteit ervan beperkt vanwege de resistentie tegen geneesmiddelen. Onlangs is een veranderd kankermetabolisme, inclusief het Warburg-effect, een voorkeur voor glycolyse in plaats van oxidatieve fosforylering voor energieproductie, geaccepteerd als een cruciaal mechanisme dat de weerstand tegen chemotherapie reguleert. Daarom hebben we het gedetailleerde mechanisme en het mogelijke nut van antiglycolytica bij het verbeteren van 5FU-resistentie onderzocht met behulp van gevestigde maagkankercellijnen, SNU620 en SNU620/5FU. SNU620/5FU, een maagkankercel die resistentie herbergt tegen 5FU, vertoonde een veel hogere lactaatproductie en -expressie vanglycolyse-gerelateerde enzymen, zoals lactaatdehydrogenase A (LDHA), dan die van de ouder-SNU620-cellen. Om glycolyse te beperken, hebben we catechine en zijn derivaten onderzocht, die bekend zijnontstekingsremmenden natuurlijke producten tegen kanker, omdat epigallocatechinegallaat eerder is gemeld als een suppressor van LDHA-expressie. Catechine, de eenvoudigste verbinding onder hen, had het grootste remmende effect op lactaatproductie en LDHA-activiteit. Bovendien vertoonde de combinatie van 5FU en catechine extra cytotoxiciteit en veroorzaakte door reactieve zuurstofspecies (ROS) gemedieerde apoptose in SNU620/5FU-cellen. Dus, op basis van deze resultaten, stellen we catechine voor als kandidaat voor de ontwikkeling van een nieuw adjuvans medicijn dat chemoresistentie tegen 5FU vermindert door LDHA te beperken.
trefwoorden:5-fluorouracil;chemoresistent; glycolyse; lactaatdehydrogenase; catechine
1. Inleiding
Er is opmerkelijke vooruitgang geboekt bij de behandeling van maagkanker met chirurgische resectie van de primaire tumor en op 5-fluorouracil (5FU) gebaseerde combinatiechemotherapie, zoals epirubicine, cisplatine en fluorouracil en docetaxel, oxaliplatine en 5FU[1] ,21 Tot op heden blijft 5FU, een analoog van uracil die de DNA-synthese blokkeert door thymidylaatsynthase [3] te remmen, een veelgebruikt chemotherapiemedicijn voor de behandeling van maagkanker [1, A4]. De klinische werkzaamheid van chemotherapie was echter onbevredigend vanwege de terugval van primaire of gemetastaseerde kanker die verband houdt met resistentie tegen geneesmiddelen [1,5].
Cistanche kan de immuniteit verbeteren
Verschillende cellulaire processen worden beschouwd als sleutelmechanismen die ten grondslag liggen aan chemoresistentie, waaronder activering of inactivatie van geneesmiddelen, reparatiemachines van DNA-schade, modificaties in geneesmiddeldoelen, inactivering van apoptotische routes en verhoogde autofagie [6,7]. Kanker is heterogeen en verschillende vormen van kanker gebruiken zowel glycolyse als oxidatieve fosforylering voor het energiemetabolisme [8]. Metabole herprogrammering, met name abnormale aerobe glycolyse, is echter gemeld als een belangrijke speler in de ontwikkeling van resistentie tegen chemotherapeutische geneesmiddelen, waaronder 5FU, bij maagkanker [9]. Lactaatdehydrogenase A (LDHA) en pyruvaatdehydrogenasekinasen (PDK's) staan bekend als belangrijke regulatoren van aerobe glycolyse die lactaat uit pyruvaat produceert [10,11]. De combinatie van dichlooracetaat, een gevestigde remmer van PDK, herstelt de gevoeligheid voor 5FU [12]. Bovendien is LDHA, een sleutelenzym dat de omzetting van pyruvaat in lactaat katalyseert, gemeld als een potentieel doelwit voor de behandeling van maagkanker [13,14]. Knockdown van LDHA-expressie in kankercellen remt tumorigeniciteit door de mitochondriale ademhaling te verhogen en de levensvatbaarheid van de cellen te verminderen [15]. Verschillende LDHA-remmers, zoals FX11, PSTMB en GSK 2837808A, verlagen de ATP-niveaus en genereren oxidatieve stress, en veroorzaken uiteindelijk apoptotische celdood [16-18]. Hoewel een studie heeft aangetoond dat de remming van LDHA door microRNA-34a de resistentie tegen 5FU bij darmkanker herstelde [19], heeft geen eerdere studie de effecten van genetische of farmacologische LDHA-remmers op chemoresistentie gerapporteerd.
Groene thee polyfenolen, waaronder catechine (CA), epicatechine (EC), gallocatechine (GC), epigallocatechine (EGC), epicatechine-3-gallaat (ECG) en epigallocatechine-3-gallaat (EGCG), bevorderen de menselijke gezondheid door verschillende ziekten te voorkomen en te behandelen, waaronder ontstekingen, diabetes, hart- en vaatziekten en kwaadaardige kanker [20,21]. Van de polyfenolen verbetert EGCG de 5FU-chemogevoeligheid bij colorectale kanker en hepatocellulaire carcinoomcellen door AMPK-routes te activeren en de kankerstamheid te beperken [22,23]. Bovendien is gemeld dat EGCG LDHA remt door de expressie ervan in de borst- en pancreaskankercellen te onderdrukken [24,25].
In deze studie veronderstelden we dat CA een kandidaat zou kunnen zijn voor een adjuvans medicijn voor het verminderen van de resistentie tegen 5FU in maagkankercellen. Er werd onderzocht dat het remmende effect van CA, en/of de combinatie ervan met 5FU, op de LDHA-activiteit, daardoor mitochondriale reactieve zuurstofspecies (ROS) en apoptotische celdood in 5FU-resistente cellen induceerde.
2. Resultaten
2.1. Glycolytische kenmerken van 5FU-resistente cellen
Verbeterde proliferatie is een kenmerk van chemoresistentie, waaronder 5FU-resistente kankercellen [26,27]. Ten eerste bevestigden we de resistentie tegen 5FU en de groeisnelheden op lange termijn van SNU620- en SNU620/5FU-cellen. Toen deze cellen 48 uur werden gekweekt met de aangegeven concentraties van 5FU, was de geschatte dosis die 50 procent groeiremming (Gl50) veroorzaakte in SNU620/5FU-cellen (100,63 uM) veel hoger dan de dosis die GIso veroorzaakte in zijn ouderlijke SNU620-cellen （28,88 μM ）（Figuur 1A en aanvullende figuur S1）. Bovendien waren de groeisnelheden van SNU620 / 5FU-cellen sneller dan die van SNU620-cellen (Figuur 1B en Aanvullende Figuur S2). Omdat chemoresistentie en snelgroeiende eigenschappen verband konden houden met verhoogde glycolytische eigenschappen in maagkankercellen [28], werden extracellulaire verzuringssnelheden (ECAR) en zuurstofconsumptiesnelheden (OCR) gemeten in beide cellen in aanwezigheid van oxamaat, een bekende glycolyse-remmer, of niet. De resultaten toonden aan dat SNU620 / 5FU-cellen significant meer lactaat afscheidden dan dat uitgescheiden door SNU620-cellen en vervolgens het kweekmedium verzuurden (Figuur 1C en Aanvullende Figuur S3). Er werd echter geen significante verandering in OCR waargenomen tussen deze cellen (Figuur 1D). De mRNA- en eiwitexpressieniveaus van LDHA werden gemeten. LDHA-expressie was hoger in SNU620/5FU-cellen dan in SNU620-cellen (Figuur 1E, F). Verder onderzochten we de mRNA- en eiwitexpressieniveaus van PDK-isotypen en ontdekten dat die van PDK2 en PDK3 hoger waren in SNU620 / 5FU-cellen dan in SNU620-cellen (aanvullende figuur S4A, B). De fosforylering van de El-subeenheid van pyruvaatdehydrogenase (PDHA1), die werd verhoogd door PDK's, werd ook geëvalueerd en bleek hoger te zijn in SNU620 / 5FU-cellen dan in SNU620-cellen (aanvullende figuur S4C). Bovendien gebruikten we oxamaat als LDHA-remmer om 5FU-resistentie in SNU620/5FU-cellen te overwinnen. Deze verbinding remde de celgroei in zowel SNU620- als SNU620/5FU-cellen (aanvullende figuur S5). Verder onderdrukte gelijktijdige behandeling met oxamaat en 5FU de celgroei, vergeleken met individuele behandeling met oxamaat of 5FUin SNU620/5FU-cellen (Figuur 1G). Deze gegevens suggereren dat SNU620/5FU-cellen LDHA in hoge mate tot expressie brengen en dat remming van LDHA-activiteit de weerstand van SNU/5FU-cellen tegen 5FU kan overwinnen.
Figuur 1. Volgens de resultaten hebben 5-fluorouracil (5FU)-resistente cellen een verhoogde glycolytische eigenschap: (A)SNU620- en SNU620/5FU-cellen werden gedurende 48 uur behandeld met de aangegeven concentraties van 5FU. De levensvatbaarheid van deze cellen werd geëvalueerd via MTT-assay; (B) groeiniveaus van SNU620- en SNU620/5FU-cellen werden elke dag gedurende 4 dagen gemeten met MTT-assay; (C,D)SNU620- en SNU620/5FU-cellen werden behandeld met oxamaat ( 5 mM) of niet gedurende 24 uur, en ECAR- en OCR-waarden werden geëvalueerd door Seahorse XF-analysator; (E, F) de expressies van LDHA in SNU620- en SNU620/5FU-cellen werden gedetecteerd via qRT-PCR en Western-blot-analyse; (G) SNU620- en SNU620/5FU-cellen werden gedurende 48 uur behandeld met oxamaat (25 mM) en/of 5FU（10μM）. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
2.2. CA onderdrukt LDHA-activiteit
De lactaatproductie werd geanalyseerd met CA en zijn derivaten, waaronder EC, GC, EGC en EGCG, in SNU620/5FU-cellen. In vergelijking met deze derivaten verminderde CA de lactaatproductie effectiever (Figuur 2A). Verder werd in vitro de bepaling van de LDHA-activiteit bevestigd en vertoonde CA een sterker remmend effect op de LDHA-activiteit dan die van zijn derivaten (Figuur 2B). De remmende effecten van CA op in vitro LDHA- en LDHB-activiteiten werden op een dosisafhankelijke manier gemeten. CA remde de LDHA-activiteit zonder de LDHB-activiteit te beïnvloeden (Figuur 2C, D). Bovendien werden LDHA- en LDHB-activiteiten gemeten met EGCG, waarvan bekend is dat het de LDHA-activiteit remt, en waarvan werd vastgesteld dat ze dosisafhankelijk waren afgenomen (aanvullende figuur S6A, B). Bovendien werden intracellulaire LDHA- en LDHB-activiteiten geëvalueerd met de aangegeven concentraties CA in SNU620/5FU-cellen. CA remde de LDHA-activiteit op een dosisafhankelijke manier in vitro resultaten, maar niet de LDHB-activiteit (Figuur 2E, F). Eiwitexpressieniveaus van p-PDHA1, PDK2, PDK3 en LDHA werden ook gemeten in SNU620 / 5FU-cellen na CA-behandeling (aanvullende figuur S7), en we hebben waargenomen dat deze niet werden beïnvloed door deze behandeling. Deze resultaten suggereren dat CA LDHA-activiteit reguleert zonder de expressie ervan te beïnvloeden.
2.3. Werkingsmechanisme van LDHA-remming door CA
Om het remmingsmechanisme van de LDHA-activiteit op CA en zijn derivaten te analyseren, hebben we de moleculaire modellering van de bindingsinteractie tussen menselijk recombinant LDHA en CA uitgevoerd (Figuur 3A,B). De resultaten toonden aan dat CA een interactie kan aangaan met de residuen van T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 en T247 van LDHA. Onder hen zijn R105, S136 en R168 van cruciaal belang voor substraat (pyruvaat) binding. We gingen er dus van uit dat CA de substraatbindingsplaatsen zou kunnen verstoren. Integendeel, EGCG is via een andere site aan LDHA gebonden. Om het werkingsmechanisme van LDHA-remming door CA verder te verifiëren, werden de Michaelis-Menten- en Lineweaver-Burk-plots bevestigd met verschillende concentraties pyruvaat en CA. De LDHA-activiteit was op een dosisafhankelijke manier van pyruvaat verhoogd. Het werd echter teruggedraaid door de stijging van CA. Zo toonden de resultaten van Michaelis-Menten en Lineweaver-Burk plots aan dat de CA een niet-competitieve remmer is voor LDHA (Figuur 3C, D). Bovendien toonden isotherme titratiecalorimetrie (ITC) gegevens aan dat CA fysiek bindt aan LDHA door een Kd waarde van 197 uM (aanvullende figuur S8). Deze resultaten geven inzicht dat CA LDHA-activiteit onderdrukt door binding aan de substraatbindingsplaats van LDHA.
2.4. CA maakt 5FU-resistentie opnieuw gevoelig door LDHA-activiteit te verminderen
We evalueerden de cytotoxische effecten van CA op SNU620- en SNU620/5FU-cellen en ontdekten dat CA de groei in beide groepen cellen onderdrukte (Figuur 4A). Om te verifiëren dat de groeiremming gerelateerd was aan de onderdrukking van LDHA-activiteit, werd de expressie van LDHA opgeheven door korte haarspeld ribonucleïnezuur (shRNA) voor LDHA (shLDHA) en de expressie ervan werd hersteld door transfectie LDHA tot expressie brengend plasmide (aanvullende figuur S9A, B ). In shLDHA-getransfecteerde SNU620/5FU-cellen waren de lactaatproductie en cellevensvatbaarheid niet opmerkelijk veranderd door CA-behandeling, vergeleken met deze van schijngetransfecteerde cellen (Figuur 4B, C). Bovendien was het groeiremmende effect van CA verhoogd door het herstel van LDHA-expressie in LDHA-knockdown SNU620/5FU-cellen (Figuur 4D). Verder werden SNU620- en SNU620/5FU-cellen onderzocht na de behandeling van CA en 5FU afzonderlijk of de combinatie van beide. Gelijktijdige behandeling met CA en 5FU remde significant de groei van SNU620/5FU-cellen (Figuur 4E). Bovendien werden de combinatie-effecten van CA en 5FU onderzocht in verschillende andere cellijnen, zoals maagkanker-AGS bij de mens, pancreaskanker Panic-1, MIA PaCa-2 en colonkanker LS174T- en RKO-cellen, in vergelijking met SNU620 en SNU620/5FUcellen. De lactaatproductie en LDHA-expressie vertoonden een goede correlatie met elkaar, en deze glycolytische eigenschappen zijn relatief hoog in SNU620/5FU, AGS en RKO (aanvullende figuur S10A, B). Bovendien verminderde de combinatiebehandeling van CA en 5FU de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk, vergeleken met een enkele behandeling van 5FU in glycolytische cellen, waaronder AGS en RKO (aanvullende figuur S10C). Gelijktijdige behandeling met CA en 5FU remde echter niet significant de groei in SNU620-, Panic-1-, MIA PaCa-2- en LS174T-cellen, die lage LDHA-expressies vertoonden. Deze resultaten suggereerden dat het sensibiliserende effect van CA op 5FU-resistente cellen verband zou kunnen houden met het remmende effect op de LDHA-activiteit.
Figuur 2. Catechine(CA) remt de LDHA-activiteit, maar niet de expressie ervan: (A)lactaatproductie van SNU620/5FU werd gemeten na behandeling met CA-derivaten （10 M） gedurende 24 uur; （B-in vitro LDHA-activiteit werd geëvalueerd na behandeling met CA-derivaten (10 uM) en oxamaat (20 mM); (C, D) in vitro werden LDHA- en LDHB-activiteiten geschat met de aangegeven concentraties CA; (E, F) de cellen werden gedurende 24 uur behandeld met aangegeven concentraties CA. Intracellulaire LDHA- en LDHB-activiteiten werden gemeten met behulp van de cellysaten als enzymbron. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Figuur 4. De levensvatbaarheid van de cellen werd geremd door gelijktijdige behandeling met catechine (CA) en 5-fluorouracil (5FU) in 5FU-resistente cellen: (A) levensvatbaarheid van SNU620- en SNU620/5FU-cellen werd beoordeeld na behandeling met de aangegeven concentraties van CA gedurende 48 uur; （B）SNU620/5FU-pLKO.1 en SNU620/5FU-shLDHA-cellen werden 24 uur behandeld met CA（10 μM）. De lactaatproductie werd gemeten in de kweekmedia van SNU620/5FU-pLKO.1 en SNU620/5FU-shLDHA-cellen; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV en SNU620/5FU-shLDHA plus LDHA#2-cellen werden 48 uur behandeld met de aangegeven concentraties CA. De levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten met behulp van een MTT-assay; （E） SNU620- en SNU620/5FU-cellen werden 48 uur behandeld met CA （10 M） en/of 5FU（10μM）. De levensvatbaarheid van deze cellen werd gemeten via MTT-assay. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Dit artikel is afkomstig uit Int. J. Mol. Wetenschap. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms
