Terahertz Spectroscopie met hoge resolutie van thermische ontledingsgasproducten van diabetische en niet-diabetische bloedplasma en nierweefselpellets
Mar 28, 2022
Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstract
Betekenis:Een van de moderne trends in de medische diagnostiek is gebaseerd op metabolomics, een benadering die het mogelijk maakt om metabolieten te bepalen die de specifieke kenmerken van de ziekte kunnen zijn. Gasspectroscopie met hoge resolutie maakt onderzoek mogelijk van het gehalte aan gasmetabolieten van monsters van biologische oorsprong. We presenteren de uitwerking van een methode voor het bestuderen van diabetische en niet-diabetische biologische monsters, bereid als pellets, door terahertz (THz) hoge resolutie spectroscopie.
Doel:Het belangrijkste idee van het werk is het bestuderen van de inhoud van thermische ontledingsgasproducten van diabetische en niet-diabetische gedroogdebloed plasmaennierweefselsvoor het onthullen van de reeks gasmarkers die diabetes kenmerkten door de THz-spectroscopiemethode met hoge resolutie.
Nadering:We presenteren een benadering om de diabetische en niet-diabetici te bestuderenbloed plasma(mens en ratten) ennierweefsels(ratten), met behulp van spectroscopie met hoge resolutie op basis van het niet-stationaire effect van het THz-frequentiebereik. De methoden voor het bereiden van de bloed- en nierweefselmonsters als pellets en voor het verdampen van de monsters werden ontwikkeld.
Resultaten:De metingen van roterende absorptiespectra van dampen bij het verwarmen van de pellets bereid uit bloed ennierweefselwerden uitgevoerd in het frequentiebereik van 118 tot 178 GHz. De absorptielijnen die in de spectra van de monsterdampen verschenen, werden gedetecteerd en geïdentificeerd. De moleculaire inhoud van thermische ontledingsproducten verschilde voor niet-diabetische en diabetische monsters; de belangrijkste marker is bijvoorbeeld aceton dat voorkomt in het diabetische bloed (mens en ratten) en in de diabetischenier weefsel.
Conclusies: Ons artikel illustreert het potentiële vermogen voor het bepalen van het metabolietgehalte van biologische monsters voor diagnostiek en de prognose van ziekten voor klinische geneeskunde. © De auteurs. Gepubliceerd door SPIE onder een Creative Commons Attribution 4.0 Unported-licentie. Distributie of reproductie van dit werk, geheel of gedeeltelijk, vereist volledige toeschrijving van de originele publicatie, inclusief de DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Trefwoorden: terahertz-spectroscopie met hoge resolutie; thermische ontleding; zakdoek;bloed plasma; suikerziekte; vriesdrogen.
trefwoorden:terahertz-spectroscopie met hoge resolutie; thermische ontleding; bloed plasma; suikerziekte; vriesdrogen, nierweefsel.
1. Inleiding
Tegenwoordig trekt het probleem van de diagnostiek van maatschappelijk belangrijke ziekten (diabetes, kankerziekten, enz.), inclusief de vroege stadia, de grote aandacht van wetenschappelijke groepen in de wereld.Een van de nieuwe benaderingen die nieuwe mogelijkheden bieden in de diagnostiek en behandeling van verschillende ziekten is metabolomics. Metabolomics is een wetenschapsgebied dat de uiteindelijke en intermediaire metabolische producten van een biologisch systeem (cel, organen of het hele organisme) onderzoekt. De metabolomics kunnen de metabolieten onthullen die de specifieke kenmerken van de ziekte kunnen zijn en een grote rol kunnen spelen bij de diagnose en prognose van een ziekte. De media, die de laatste en intermediaire metabolische producten in het menselijk organisme bevatten en nuttig zijn voor het onthullen van de metabolieten die verband houden met ziekten en pathologieën, zijn uitgeademde adem, bloed, urine, speeksel, enz.
Een van de maatschappelijk belangrijke ziekten die de kwaliteit van leven van mensen bedreigen, is diabetes. Diabetes mellitus type 2 was vroeger een ziekte van middelbare leeftijd, maar wordt nu gediagnosticeerd bij volwassenen, jongeren en kinderen. De resultaten van metabolomisch onderzoek van bloed- en urinemonsters van diabetespatiënten van 18 jaar en kinderen van 1 tot 13 jaar worden gepresenteerd in de Human Metabolome Database (HMDB).1 Voornamelijk bloed (21 chemische stoffen waaronder isomeren), urine ( 30 chemische stoffen waaronder isomeren) en cerebrospinale vloeistof (1 chemische stof) werden onderzocht. Zo werd (R)-3-hydroxyboterzuur gedetecteerd in alle drie de soorten vloeistoffen. In beide vloeistoffen (bloed en urine) werden enkele stoffen (acetoazijnzuur, D-fructose en D-glucose) aangetroffen. Het meer karakteristieke kenmerk van diabetes (aceton, CH3COCH3) was alleen aanwezig voor urine. De vloeistofmonsters, de resultaten van de onderzoeken gepresenteerd in HMDB, zijn onderzocht met verschillende methoden: gaschromatografie;2 gaschromatografie met massaspectrometrie;3,4 gas-vloeistofchromatografie met massaspectrometrie;5 hoge resolutie spectroscopie van nucleaire proton magnetische resonantie;6 en methoden met behulp van de speciale apparaten voor monitoring van de toestand van diabetespatiënten, het continue glucosemonitoringsysteem
De ontwikkeling van chronische nierziekte is een belangrijke complicatie van diabetes mellitus. Hoewel de bepaling van geglycosyleerd albumine de gebruikelijke benadering van de screening is, kan nierbeschadiging beginnen lang voordat klinisch significante veranderingen in urine-albumine optreden. Gezien de multifactoriële pathogenese van chronische nierziekte zijn verschillende markers overwogen voor screening.8,9 De diagnostische waarde ervan zonder nierbiopsie bleek echter twijfelachtig.
De spectroscopische benadering kan informatie opleveren over de inhoud van de biologische monsters die kunnen worden gebruikt voor medische diagnostiek. Het terahertz (THz) frequentiebereik is erg belangrijk voor het bestuderen van gassen, vloeistoffen en weefsels van levende organismen. Er zijn enkele recensies gewijd aan toepassingen van methoden van het THz-frequentiebereik, waaronder THz-tijddomeinspectroscopie, THz-reflectometrie en THz-beeldvorming voor biologie en geneeskunde.10
Met THz-tijddomeinspectroscopie kunnen de spectra worden gedetecteerd, waarbij de absorptiecoëfficiënt of brekingsindex enkele spectrale kenmerken heeft die overeenkomen met de aanwezigheid van bepaalde biomoleculen (eiwitten, suikers, enz.) in de monsters of hun verschillende concentraties.11
Moleculaire absorptiespectroscopie en in het bijzonder THz-gasspectroscopie is een veelbelovende benadering voor onderzoek naar multicomponent-gasmengsels van verschillende oorsprong.12 De monsters in vloeibare en vaste toestand kunnen worden onderzocht door verdamping of thermische ontleding. De metabolieten-markers van sociaal belangrijke ziekten (diabetes, kanker, enz.) kunnen worden onthuld door de spectraallijnen ervan in de absorptiespectra die worden uitgevoerd bij transmissie van straling door gasmonsters.
Het acetongehalte in monsters van uitgeademde lucht en urine van diabetespatiënten (12 personen) werd gemeten met behulp van een terahertz-spectrometer met faseverschuivingstoetsing van de werkende straling. Experimenten werden uitgevoerd in samenwerking met het Almazov National Medical Research Centre. De metingen zijn uitgevoerd aan de acetonabsorptielijnen met centrale frequenties van 150.537 en 151.647 GHz. De metingen zijn uitgevoerd zonder verwarming. Gelijktijdige analyse van de monsters van uitgeademde lucht en urine van diabetespatiënten bracht aan het licht dat het acetongehalte in de urine veel hoger was dan in de uitgeademde lucht, in sommige gevallen een orde van grootte hoger.13,14
De resultaten van THz hoge-resolutie gasspectroscopie-onderzoeken vanbloed plasmavan patiënten en ratten (conditioneel gezond en met diabetes) evenals de rattennierweefsel(gezond en met diabetes) gedroogd en geperst tot korrels worden gepresenteerd. de weefsels ofbloed plasmavan levende organismen, zonder enige voorbereiding, moeten onmiddellijk na de bemonstering worden onderzocht. Bereiding als pellets maakt onderzoek mogelijk na voldoende lange tijd na bloedafname of nierbiopsie.
2 Experimenten en methodologie
2.1 Methode voor de bereiding van bloedplasmapellets en nierpellets
Veneus bloed van patiënten met type 2 diabetes mellitus en voorwaardelijk gezonde deelnemers werd verzameld op de afdeling Endocrinologie van het Almazov National Medical Research Centre; het centrum biedt medische zorg aan diabetespatiënten. Drie patiënten en twee deelnemers waren mannen, van dezelfde leeftijd (39 tot 43 jaar oud). Alle experimentele protocollen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden beoordeeld en goedgekeurd door de patiënten en deelnemers en de Gebruikscommissie van het Medisch Centrum. Veneus bloed werd 's morgens verzameld na 8 tot 12 uur vasten in een buisje met het anticoagulans K3EDTA (Vacutest Kima, Italië). Plasma werd verkregen voor de analyse van biochemische parameters door volbloed gedurende 15 minuten bij 3000 rpm te centrifugeren in een laboratoriumcentrifuge (Eppendorf 5702R, Duitsland) bij een temperatuur van -4 graden. Waarden van biochemische parameters vanbloed plasmamonsters en referentie-intervallen worden weergegeven in Tabel 1 (het niveau van geglycosyleerd hemoglobine werd verkregen op het volbloed). Tabel 1 laat zien dat de concentratie van glucose, triglyceriden en geglyceerde hemoglobine in de monsters van een patiënt met diabetes respectievelijk 1,5, 2 en 2,3 keer toeneemt.
De studie werd ook uitgevoerd met Wistar mannelijke ratten van 8 weken oud en met een gewicht van 180 tot 200 g, volgens het protocol van experimentele studies goedgekeurd door de Animal Care and Use Commission van het Institute of Experimental Medicine Almazov National Medical Research Centre. Het glucosegehalte bij dieren van de experimentele groep was 21 mmol l na 120 minuten na het laden van glucose. Intacte ratten werden gebruikt als controlegroep. Veneus bloed werd verzameld uit de inferieure vena cava voordat de dieren werden geëuthanaseerd. Ook werd de nier geoogst. Bloedmonsters werden verzameld in buisjes die een anticoagulans bevatten.
Testmonsters werden ingevroren bij een temperatuur van −80 graden (koelkast met lage temperatuur DW-86L388A, Haier, China). Daarna werd het gevriesdroogd door Vaco 2 (ZirBus, Duitsland) te vriesdrogen bij een temperatuur van −50 graden en een druk van 3 Pa. Het invriezen wordt uitgevoerd vóór het vriesdrogen, aangezien tijdens het vriesdrogen onder invloed van hoge interne druk biologische componenten kunnen vernietigd worden. Gedroogde monsters waren een spons bestaande uit biologische kristallen. De spons werd vernietigd met een metalen spatel en verpulverd tot kristallen met een grootte van enkele tientallen micrometers. Het gebruik van een vijzel en stamper was onmogelijk, omdat het vermalen van de eiwitten in de samenstelling van de monsters zou leiden tot ongewenste hechting en de vorming van ronde korrels.
Het gevriesdroogde poedermonster werd gewogen (analytische balans OHAUS Discovery, Zwitserland) en vervolgens in een stalen persvorm geplaatst. Met behulp van laboratoriumpersen (Angkor, Rusland en Specac, VK) bij een bepaalde vormdruk,bloed plasmapellets en nierpellets werden verkregen. Elk korrelkristal bevat een bepaald percentage vetten (triglyceriden), eiwitten (albumine) en fibrinogeen - allemaal normaal of geglyceerd (in het geval van diabetes). De korrels van monsters uit de controlegroep worden hierna "niet-diabetische korrel" genoemd en de korrels van monsters uit dediabetische groep wordt hierna "diabetische pellet" genoemd.
2.2 THz Hoge-Resolutie Spectroscopie Experimentele Opstelling
THz-spectroscopie met hoge resolutie op basis van niet-stationaire effecten maakt het mogelijk om de samenstelling van de componenten van gas- en dampgasmengsels met meerdere componenten te analyseren. Spectrometers bieden een gevoeligheid die dicht bij de theoretische limiet ligt met een resolutie die alleen wordt beperkt door het Doppler-effect en kunnen snelle processen registreren. De gevoeligheid blijft behouden, zelfs bij een aanzienlijke afname van de gasdruk en is ongeveer 0,2 ppb in de scanmodus voor sommige gassen (bijv. ammoniak bij de metingen van de absorptielijn nabij de frequentie van 572 GHz). Bovendien maakt het het mogelijk om met hoge betrouwbaarheid de componentsamenstelling van een gasmengsel te bepalen.12 Een studie van de thermische ontledingsproducten van pellets werd uitgevoerd met behulp van de methode van THz niet-stationaire gasspectroscopie van het 118 tot 178 GHz-bereik. De spectrometer gebruikt een fasevergrendelde lus voor automatische regeling van de frequentie van de achterwaartse golflamp en faseverschuiving, registratie in het tijddomein, middeling en verwerking van het spectroscopische overgangssignaal. Het apparaat registreert een signaal in het tijdsdomein. De damp van de monsters werd geanalyseerd met behulp van de volgende procedure. Pellets werden in een reageerbuis geplaatst, gebruikmakend van vacuümgepompt, een reageerbuis geleidelijk verwarmd (tot 240 graden) en het resulterende mengsel van thermische ontledingsproducten van het monster werd in de meetcel gelaten. Een gegevensbestand bevat meestal opnames van een geselecteerde of van het totale werkbereik van de spectrometer. Stoffen kunnen daarom worden geïdentificeerd door absorptielijnen die in het totale spectrum van het monster verschijnen en de dynamiek van concentraties in een mengsel kan worden getraceerd door verschillende gegevensbestanden te vergelijken. Stoffen werden geïdentificeerd door ze te doorzoeken in open source MW-, mmw- en THz-databases.15,16
3 Analyse van bloedplasmadampen en nierdampen met behulp van een hoge-resolutie Terahertz-spectrometer
Met onze THz-TDS-systemen hebben we de transmissie van pellets gemeten in het spectrale bereik van 0,2 tot 1,4 THz,17 maar we weten dat biomoleculen en in het bijzonder de afbraakproducten ervan in de gastoestand een informatieve respons hebben (rotatieabsorptie spectra) bij deze frequenties en ook lager, dus hebben we een aanvullend onderzoek uitgevoerd op een THz-gasspectrometer met hoge resolutie. De gedetecteerde absorptielijnen van stoffen bij diabetische mensenbloed plasmasamenvallen met stoffen van niet-diabetische mensenbloed plasma, behalve voor aceton. Er zijn veel absorptielijnen van aceton die in het werkfrequentiebereik van de spectrometer (118 tot 178 GHz) liggen. Meestal is het meer dan voldoende om een absorptielijn van één stof te detecteren voor een eenduidige bepaling van de aanwezigheid van de stof in het meercomponenten gasmengsel. Een voorbeeld van het opnemen van delen van de absorptiespectra met de absorptielijn van aceton is weergegeven in Fig. 1. Aceton kan in het bloed verschijnen bij een koolhydraatstofwisselingsstoornis. Zoals in de literatuur vermeld, bevatte het bloed van patiënten met diabetes -OH-butyraat en acetoacetaat, maar deze stoffen vielen later uiteen in aceton en kooldioxide.18 Kooldioxide heeft geen dipoolmoment; daarom heeft het geen roterende overgangen. Het verhoogde gehalte kan alleen worden gedetecteerd door het trillingsspectrum van het monster in het IR-bereik te bestuderen.
Plasmadampstoffen, zoals carbonylsulfide (OCS), zwaveldioxide (SO2), mierenzuur (HCOOH), isocyaanzuur (HNCO) en ammoniak (NH3), werden gedetecteerd in zowel menselijke diabetische als menselijke niet-diabetische monsters. In sommige gevallen is er één experimentele lijn gedetecteerd in spectra van het monster die overeenkomt met meer lijnen dan één voor één stof (bijv. isocyaanzuur) in catalogusgegevens (zie tabel 2).15,16
Dit wordt verklaard door het feit dat de catalogi gegevens bevatten over de hyperfijne structuren van stoffen die in dit experiment niet zijn opgelost, aangezien de lijnen een eindige breedte hebben in de orde van enkele honderden kHz. De verkregen absorptielijnen van de bestudeerde stoffen vallen samen met de absorptiespectra van dampen van capillair bloed enbloed plasmavan patiënten met diabetes en voorwaardelijk gezonde deelnemers die werden gepubliceerd in ons vorige werk.19 De gedetecteerde gasvormige stoffen zouden zich tijdens de monstervoorbereiding kunnen hebben gevormd als producten van de chemische transformatie van aminozuren. De vraag of deze verbindingen diagnostische waarde hebben, vereist onderzoek. In de klinische praktijk in de diabetologie wordt de analyse van het gehalte van deze stoffen nog niet gebruikt.
De dampen van debloed plasmavan gezonde ratten bevatte carbonylsulfide (OCS), methaanthiol (CH3SH), butyronitril (C3H7CN), aceetaldehyde (CH3CHO) en mierenzuur (HCOOH). het voorbeeld vanbloed plasmavan diabetische ratten verschilde door de aanwezigheid van aceton. Naast de absorptielijnen van propionitril (C2H5CN) werd methylformiaat (CH3OCHO) gedetecteerd.
De dampmonsters van gedroogde korrels van gezonde en diabetische ratten'nierweefselswerden bestudeerd. de dampen vannierweefselvan gezonde ratten bevatten carbonylsulfide (OCS), zwaveldioxide (SO2), mierenzuur (HCOOH), isocyaanzuur (HNCO), ethylformiaat (C2H5OCHO) en propyleenglycol (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Het dampgehalte van diabetische ratnierweefselverschilde van de gezonde rat door de aanwezigheid van niet alleen carbonylsulfide (OCS) maar ook zijn isotopoloog OCS-34. Het aceetaldehyde (CH3CHO), methaanthiol (CH3SH), ethyleensulfide (C2H4S), methanol (CH3OH) en glycolaldehyde (CH2ðOHÞCHO) werden ook gedetecteerd in de dampen van een pellet van diabetische rattennierweefsel(zie Afb. 2 en Afb. 3).
De aanwezigheid van zwavelverbindingen, zoals methaanthiol, kan worden gespecificeerd door de thermische ontleding van zwavelaminozuren (methionine, cysteïne en cystine) in de samenstelling van bloedeiwitten. Methionine is een essentieel aminozuur dat niet wordt gesynthetiseerd in menselijke organismen. Het wordt verkregen uit voedsel en is een bron van zwavel voor de biosynthese van cysteïne. Bij verhitting van zwavelaminozuren tot temperaturen van ongeveer 240 graden werden methaanthiol en ethyleensulfide (methionine-ontleding) gedetecteerd in het massaspectrum van deze stoffen.20
4. Conclusie
De moleculaire inhoud van mens en ratbloed plasmaen ratnierweefseltijdens thermische ontleding van de monsters werd bestudeerd met behulp van de THz-spectrometer met hoge resolutie. De methode voor het bereiden van de biologische monsters als pellets werd gepresenteerd. Deze methode geeft de mogelijkheid om monsters op te slaan en te transporteren. De gasspectroscopie met hoge resolutie maakt het mogelijk het gehalte te bepalen van gasmengsels met meerdere componenten van elke oorsprong, inclusief biologische met sporenconcentraties van gascomponenten. Aceton werd gedetecteerd bij diabeticibloed plasmamonsters. Informatie over het verschil in inhoud van diabetes en gezondbloed plasmavan mannen en ratten en diabetische en gezonde rattennierweefselswerd verkregen uit absorptie-rotatiespectra van dampen. Het gebruik van THz-spectroscopie met hoge resolutie biedt een kwalitatieve analyse van de componentinhoud van monsters van bloeddampen ennierweefselskorrels. De mogelijkheid om de kwantitatieve schatting van concentraties van belangrijke diabetesgasmarkers uit te voeren, afhankelijk van de toestand van de patiëntenin verder onderzoek moeten worden bestudeerd.
