De oorzaak van polycysteuze nierziekte

voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

Overexpressie van PKD1 veroorzaakt polycysteuze nierziekte

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté en Marie Trude

De pathogenetische mechanismen die ten grondslag liggen aanautosomaal dominantpolycysteuze nierziekte(ADPKD) moeten nog worden opgehelderd. Hoewel er bewijs is dat Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen-haplo-insufficiëntie en verlies van heterozygotie kunnen cystevorming bij muizen veroorzaken, paradoxaal hoge niveaus van Pkd1(polycysteuze nierziekte) expressie zijn gedetecteerd in de nieren van ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte) patiënten. Om te bepalen of Pkd1(polycysteuze nierziekte)functiewinst kan een pathogeen proces zijn, een Pkd1-bacterieel kunstmatig chromosoom (Pkd1-BAC) werd gemodificeerd door homologe recombinatie om alleen een aanhoudende Pkd1-expressie te richten, bij voorkeur op de volwassen nier. Er werden verschillende transgene lijnen gegenereerd die specifiek de Pkdl-transgen in de nieren 2- tot 15-vouw over endogene Pkd1-spiegels. Alle transgene muizen ontwikkelden reproduceerbaar tubulaire en glomerulaire kosten en nierinsufficiëntie en stierven aan nierfalen. Dit model toont aan dat overexpressie van wildtype Pkd1 alleen voldoende is om cystogenese te veroorzaken die lijkt op menselijke ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte). Onze resultaten onthulden ook een opvallende verhoogde renale c-myc-expressie bij muizen van alle transgene lijnen, wat aangeeft dat c-myc een kritische in vivo stroomafwaartse effector van Pkd1 is.(polycysteuze nierziekte)moleculaire Dathwavs, Deze studie leverde niet alleen een onschatbare en eerste PKD . op(polycysteuze nierziekte)model om moleculaire pathogenese en therapieën te evalueren, maar levert ook bewijs dat gain of function een pathogeen mechanisme kan zijn bij ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte).

Klik om Cistanche voor nierziekte

Autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte(ADPKD) is een van de meest voorkomende genetische ziekten bij de mens. Het wordt gekenmerkt door de progressieve ontwikkeling van meerdere niercysten die alle segmenten van de nefron aantasten. Andere manifestaties zijn onder meer de vorming van cysten in de lever en pancreas, evenals intracraniële aneurysma's en cardiovasculaire defecten. ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)leidt doorgaans tot nierinsufficiëntie met progressie tot nierziekte in het eindstadium op late middelbare leeftijd.

Ongeveer 85 procent van ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)gevallen zijn geassocieerd met mutaties in de PKD1(polycysteuze nierziekte)gen. Deze PKD1(polycysteuze nierziekte)gen is groot, beslaat 54 kb en bestaat uit 46 exons. Het genereert een 14.2-kb transcript en codeert voor een 4., een 302-aminozuur eiwit genaamd polycystine-1(4, 9-11). Menselijke PKD1- en polycystine-1-expressie zijn geanalyseerd in normale en ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)nieren. Tijdens de ontwikkeling van de nieren wordt polycystine-1 gemakkelijk gedetecteerd in glomerulaire en tubulaire epitheelcellen (beoordeeld in referentie 37 en referenties daarin). Bij normale volwassenen hebben wij en anderen aangetoond dat PKD1(polycysteuze nierziekte)RNA en eiwit worden in matige tot lage niveaus tot expressie gebracht in de verzamelende en distale tubuli, terwijl niveaus stegen (~2-voudig) in ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)nieren (22, 39). Interessant is dat aanhoudende of versterkte polycystine-1-expressie wordt gedetecteerd in de meeste nierepitheelcysten, hoewel kleuring afwezig was in een significante minderheid van cysten(29). Naast de nieren, PKD1(polycysteuze nierziekte)expressie is normaal gesproken wijdverbreid in andere volwassen weefsels, waaronder epitheliale en niet-pitheliale celtypen (6,14,18,29,30,39).

Meer dan 200 verschillende PKD1(polycysteuze nierziekte)mutaties zijn beschreven, waarvan de meeste deletie-insertie-, frameshift- of nonsense-mutaties zijn. Er wordt voorspeld dat deze resulteren in afgeknotte vormen van het eiwit, consistent met de inactivatie van één allel.

Een aanzienlijk deel is echter een missense of in-frame mutaties die door het hele gen worden gevonden en vaak uniek zijn voor een bepaalde familie (33, 34). Zoals de naam al aangeeft, ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)is dominant en het overgedragen gemuteerde PKD1(polycysteuze nierziekte)allel is voldoende om de ziekte te veroorzaken. De focale aard van de niercysten in ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)suggereert dat het mutatiemechanisme voor PKD1(polycysteuze nierziekte)kan een twee-hit of een verlies van heterozygotie zijn. Ondersteuning voor dit mechanisme werd verkregen door de detectie van PKD1(polycysteuze nierziekte)klonale somatische mutaties in cellen van een aanzienlijk deel van cysten (3, 21, 32). Een mechanisme van verlies van heterozygotie zou het sterk variërende fenotype kunnen verklaren dat vaak wordt waargenomen in individuele families.

Studies over de muis Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen kan waardevolle inzichten verschaffen in de PKD1-functie(s) vanwege de sterke gelijkenis tussen het gen en het genproduct van de mens en de muis. Bij normale ontwikkeling wordt murine Pkd1 vanaf het morula-stadium in hoge concentraties tot expressie gebracht en wordt het gedetecteerd in alle neurale lijstcelderivaten. inclusief de volwassen hersenen, aortaboog, kraakbeen en mesenchymale condensatie (16, 17). Van homozygote mutante muizen die het doelwit zijn van Pkd1-deletie is gemeld dat ze in utero sterven en nier- en pancreascysten ontwikkelen (2,19,24-26, 40). Deze eerdere pogingen om muismodellen te genereren leverden helaas postnataal geen levensvatbare dieren op. Desalniettemin zou het optreden van niercysten in deze homozygote Pkd1-mutante muizen consistent zijn met de hypothese van een mutatiemechanisme met twee treffers bij mensen dat een kiembaanmutatie en somatische inactivatie van het normale allel omvat. Muizen die heterozygoot waren voor de Pkd1-gerichte deletie, vertoonden echter ook PKD met af en toe lever- en pancreascysten, ondanks een late aanvang in de volwassenheid, wat een mechanisme van haplo-insufficiëntie of verlaging van de gendosering ondersteunt. Bovendien is verlies van heterozygotie of haplo-insufficiëntie mogelijk niet het enige mechanisme voor ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)pathogenese. Deze mechanismen zijn inderdaad in strijd met de aanhoudende of verbeterde expressie van PKD1(polycysteuze nierziekte)gezien in de meeste menselijke niercysten, tenzij niet-functionele eiwitten worden geproduceerd. Deze bevinding van aanhoudende of verhoogde PKD1-expressie roept de vraag op of een versterking van de functie of overexpressie operant kan zijn. Om het pathogenetische Pkd1 gain-of-function mechanisme te onderzoeken, hebben we een murine Pkd1 bacterieel kunstmatig chromosoom (Pkd1-}BAC) geïsoleerd en gekarakteriseerd dat vervolgens werd gemodificeerd door homologe recombinatie in Escherichia coli om de expressie van Pkd1 te targeten.(polycysteuze nierziekte)specifiek voor de nieren. We rapporteren de productie van drie transgene lijnen die het Pkd1-transgen op verschillende niveaus tot expressie brachten. Alle muizen vertoonden reproduceerbaar een aantal overeenkomsten met menselijke ADPKD en ontwikkelden consequent een vroege aanvang met snelle progressie van niermorfologische en functionele veranderingen en stierven op middelbare leeftijd aan nierfalen. Bovendien beschrijft de huidige studie een in vivo mechanisme waarmee Pkd1 dit PKD-fenotype kan mediëren. Deze muizen vertegenwoordigen het eerste model van PKD dat wordt geproduceerd door de enige renale overexpressie van de orthologe PKD1(polycysteuze nierziekte)gen.

MATERIALEN EN METHODES

Isolatie van BAC-klonen die de Pkd1 . bevatten(polycysteuze nierziekte)plaats. Pkd1-BAC-klonen van de bacteriële gastheerstam E. coli DH10B (RecA; RecBC) werden geïsoleerd uit een 129Sv-muis pBelollBAC-bibliotheek (Research Genetics). Screening van BAC-superpools werd uitgevoerd door PCR met de volgende primers: 5 regio's, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (forward Pkd1 exon 1) en 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (reverse Pkd1 exon 1); en 3 regio's, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (voorwaartse Pkd1 exon 39) en 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (omgekeerde Pkd1 exon 40). Eén positieve kloon voor beide amplificatie werd geïdentificeerd en geanalyseerd op standaardgel- en gepulseerde-veldgelelektroforese (PFGE) gevolgd door Southern-blotting. Voor Southern-blot-analyse zijn zeven muis Pkd1-probes ontworpen: genomisch exon 1 (516 bp; nucleotiden [nt] 1 tot 516; NCBI-toegangsnummer U70209), genomisch exon 2-3 (220 bp), genomisch exon {{ 31}} (8.479 bp), cDNA-exon 15-20 (1.724 bp; nt 6455 tot 8179), cDNA-exon 25-34 (1.315 bp; nt 9415 tot 10730), cDNA-exon 36-45 ( 1.655 bp; nt 10963 tot 12618), en genomisch exon 45-46 (1640 bp) (16). Van verschillende regio's, waaronder de BAC-insertie-uiteinden van deze muizen-Pkd1-BAC, is ook de sequentie bepaald en er werd bevestigd dat ze ortholoog zijn aan het menselijke PKD1-gen en aangrenzende regio's.

RESULTATEN

Productie van SBPkdl(polycysteuze nierziekte) rAc-BAC door homologe recombinatie. Om te bepalen of Pkd1-versterking van de functie alleen voldoende is om de ADPKD . te produceren (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)fenotype isoleerden we eerst een genomische kloon die het volledige Pkdl-gen bevatte in een BAC-vector 129/Sv-bibliotheek. Deze bibliotheek werd gescreend door PCR met twee sets primers voor het Pkdl-gen dat zich uitstrekte over exon 1 aan het 5'-uiteinde en exons 39 tot 40 naar het 3'-uiteinde (Fig. 1). Er werd een positieve BAC-kloon voor het Pkd1-gen geïdentificeerd die het gehele aangrenzende Tsc2-genlichaam omvatte. De Pkd1-insertie werd in detail gekarakteriseerd om ervoor te zorgen dat de genomische structuur overeenkwam met die van de endogene Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen van de 129/Sv-muisstam waarvan de insertie was afgeleid en van de C57BL/6J-inteeltstam. Genomische kaarten van de Pkd1-locus in de BAC en in deze ingeteelde stammen door Southern-blot-analyse, met vier restrictie-enzymdigesties en zeven probes die het gehele Pkdl-gen bestrijken, leken identiek zonder bewijs van herschikkingen (Fig. 1). Deze BAC bevatte een ~121-kb insert inclusief-37 kb upstream en-39 kb downstream sequentie van de Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen zoals bepaald door elektroforese en sequencing.

Deze Pkd1-BAC-kloon werd gemodificeerd door twee opeenvolgende homologe recombinatiegebeurtenissen in E.coli. De Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen werd gelabeld in exon 10 door een nucleotide (G tot A) te vervangen om een ​​nieuwe EcoRI-plaats op positie 2355 op de cDNA-kaart te creëren. Deze stille puntmutatie werd geproduceerd om de Pkd1 . te onderscheiden(polycysteuze nierziekte)gen en transcript van de BAC van die van endogene oorsprong. Daarnaast hebben we de 5'-regulerende elementen van het Pkd1-BAC-gen vervangen door gebruik te maken van eerder geïdentificeerde "SB" nierepitheelspecifieke elementen van de SBM (gekoppeld aan c-Myc) of SBF gekoppeld aan c- fos)construct-trans-gen om expressie tot de nieren te beperken (36,38) (Fig. 2a).

Deze nieuwe SBPkd1TAc-BAC werd verteerd met Notl, een unieke plaats die zich direct stroomopwaarts van de SB-elementen bevindt, en ClaI in het Tsc2-genlichaam, waardoor de Tsc2-regulerende elementen en de 5'-helft van het genlichaam worden afgekapt om een ​​gebrek aan exogene Tsc2-expressie te garanderen in alle weefsels en om de prokaryotische BACvector-sequenties te verwijderen (Fig. 1 en 2). Dit 70-kb Notl-Clal gelineariseerde fragment werd geïsoleerd, gezuiverd en gekwantificeerd voor oöcyt-micro-injectie (36).

Productie en analyse van SBPkd1rAc transgene muizen. Vier transgene oprichters die verschillende kopieën van het SBPkd1rAc-transgen droegen, ontwikkelden consequent PKD(polycysteuze nierziekte). Van de vier SBPkdlrAc-stichtermuizen bepaald door Southern-analyse, werden drie SBPkdlrAG-transgene lijnen vastgesteld met twee tot negen kopieën van het transgen (Fig. 2b). Karakterisering van de transgenintegriteit in deze lijnen werd gevolgd met 5'-, interne en 3'-sondes zoals getoond door representatieve voorbeelden in Fig. 2b. Transgene lijnen onthulden met de 5'"SB"-sonde een band van 10,9 kb die consistent is met het SBPkd1rAc-transgen dat wordt geïntegreerd in een kop-staartoriëntatie en onthulden met de 3'-sonde een band van 7.1-kb (Fig. 2b). Bovendien detecteerde de interne probe de 9.4-kb endogene Pkd1-band evenals de 6.9-kb- en 2.5-kb-banden van het transgen vanwege de EcoRI-insertieplaats in exon 10 (Fig. 2b). Deze muizen bevatten volledige kopieën van het transgen op basis van de genomische overlappende structuuranalyse.

Pkd1(polycysteuze nierziekte)versterking van de functie bij volwassen SBPkdlrAc-transgene muizen. Expressie van het SBPkdlrAG-transgen en het Pkd1-gen werd onderzocht in verschillende organen. Kwantificering van transcriptniveaus van het transgen en/of endogene gen werd uitgevoerd door Northern blot-analyse (Fig. 3a). Zoals verwacht waren de transgen- en endogene gentranscripten van vergelijkbare lengte (14,2 kb). Op basis van de GAPDH-controle-expressie hadden de nieren van alle SBPkd1TAG-muislijnen consistent verhoogde transcriptexpressie in vergelijking met normale Pkdl-niveaus in volwassen nieren (n=3) van vergelijkbare leeftijd. Renale transgene en endogene expressie voor de verschillende transgene lijnen vertoonden een bereik van 2- tot 15- maal hoger dan de controle renale endogene Pkd1-niveaus (Fig. 3a). In het bijzonder transgene lijn 39 (n {{11} }) toonde hogere Pkd1(polycysteuze nierziekte)niveaus dan regels 3(n=3) en 41 (n =4). Verder correleerden Pkd1-expressieniveaus gemeten met Northern-blot-analyse met die verkregen door real-time PCR met behulp van primers in exons 1 en 2 (Fig. 3b).

Kwantificering van de transgenexpressieniveaus werd specifiek uitgevoerd door real-time PCR en semi-kwantitatieve RT-PCR in de drie transgene lijnen op volwassen leeftijd met behulp van primers in het 5'-niet-vertaalde gebied (B, -globine-promoter) en in exon 2 van Pkd1(polycysteuze nierziekte)(Fig. 3b). De SBPkdlrAc-expressie in transgene muizen werd vergeleken met het S16-ribosomale eiwitgenproduct als een interne standaard. Omstandigheden die werden gebruikt voor semi-kwantitatieve RT-PCR-amplificatie waren binnen het lineaire bereik. Transgenexpressie door real-time PCR en semi-kwantitatieve RT-PCR vertoonde consistent en specifiek de hoogste expressie in de nier van alle transgene lijnen ten opzichte van andere organen (Fig. 3b en c). Nierexpressieniveaus voor een individueel monster waren reproduceerbaar met elk van de gebruikte detectietechnieken. De hoogste niveaus van Pkd1(polycysteuze nierziekte)transgene nierexpressie werd gemeten voor lijn 39 en 41. Om te controleren of de verhoogde Pkd1(polycysteuze nierziekte)expressie resulteerde uit het transgen of het endogene gen, werd dezelfde groep muizen uit de drie transgene lijnen vergeleken voor renale Pkd1-transgenexpressie en voor renale Pkd1-totale (transgene en endogene) expressie door middel van real-time PCR. Interessant is dat regels 39 en 41 ten opzichte van regel 3 aantoonden dat de verhoogde nierexpressie van Pkdl-transgen vergelijkbaar was met of hoger was dan die van totale renale expressie van Pkdl, wat erop wijst dat het transgen specifiek verantwoordelijk is voor deze geïnduceerde expressie. In verschillende organen (waaronder hart, long, hersenen, lever, pancreas en milt) vertoonde het SBPkd1rAg-transgen een zeer zwakke expressie die af en toe werd gedetecteerd in milt en long, met weinig tot niet-detecteerbare expressie in andere organen (figuur 3b). Kwantificering door real-time PCR toonde een 10- tot een 1,000-voudig lager niveau van de transgenexpressie in extrarenale weefsels ten opzichte van nierexpressie (Fig. 3c). De regulerende elementen "SB" van het SBPkdlrA-transgen verleenden preferentiële renale expressie; deze specifieke orgaanverdeling werd ook bepaald bij gebruik in transgenen gekoppeld aan c-myc (SBM) en c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, een stroomafwaartse effector van Pkd1(polycysteuze nierziekte)signaalroutes in SBPkdlrAc-muizen. Om inzicht te krijgen in het intracellulaire pathogenetische mechanisme van SBPkdlrAg-transgene muizen, probeerden we vervolgens het c-myc-nierexpressieniveau te volgen op basis van onze eerdere observatie van c-myc-deregulatie in menselijke ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)nieren(22). Er werd een nieranalyse uitgevoerd van alle drie de transgene lijnen 3(n =4),39(n =7), en 41 (n=4) evenals controles (n=4). Zoals getoond in Fig. 3d, is er een substantiële expressie van endogeen c-myc geïnduceerd in SBPkd1TAG-muizen in vergelijking met controlemuizen van vergelijkbare leeftijd. Interessant is dat het niveau van c-myc-expressie in sommige SBPkd1-c-nieren. in het bijzonder lijn 39, bereikte niveaus vergelijkbaar met die waargenomen in het PKD SBM transgene muismodel geproduceerd door renale c-myc-expressie.

Nierafwijkingen in SBPkd1raG-muizen vergelijkbaar met PKD(polycysteuze nierziekte). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 voor elke lijn) ontwikkelden meerdere tubulaire (T) en glomerulaire cysten (G) (Fig. 4d, f en g). Cysten werden waargenomen in tubuli van de corticale en medullaire regio's, evenals het verzamelen van tubuli van de papilla (Fig. 4d en e). Transgene muizen vertoonden tubulaire epitheliale hyperplasie (pijlpunt) met zowel cystische als niet-cystische tubuli en frequente hypertrofie (Fig. 4g en h), maar de ernst varieerde tussen individuele muizen. Interstitiële fibrose (F), perivasculaire lymfoïde infiltraten en eiwitachtige afgietsels (P) werden vaak waargenomen (Fig. 4d en e).

Om de lokalisatiesite van verhoogde Pkd1 . nauwkeuriger te definiëren(polycysteuze nierziekte)expressie in de nieren, hebben we in situ hybridisatie uitgevoerd met behulp van de eerder gebruikte exon 36-45-probe (16). Het hybridisatiesignaal was specifiek gelokaliseerd in de epitheelcellen die cysten en hyperplastische tubuli bekleden, evenals glomerulaire cysten. Bovendien werd enig signaal gezien over het epitheel van niet-cystische of licht verwijde tubuli, waarschijnlijk de tubuli identificerend die voorbestemd waren om toekomstige cystische veranderingen te ondergaan (Fig. 4i en j).

Nier histologische analyse werd ook uitgevoerd op transgene muizen bij de geboorte(n =8), postnatale dag 10(P10)(n =3),P20(n =5),P35(n { {7}}), en P45(n=3) in vergelijking met negatieve nestgenoten van dezelfde leeftijdsgroep (n 2 tot 4). Interessant is dat alle pasgeboren transgene muizen tubulaire en glomerulaire dilatatie vertoonden ten opzichte van controle-negatieve nestgenoten (Fig. 4k en l), wat aangeeft dat nierafwijkingen in utero begonnen zoals waargenomen bij SBM-muizen en in ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)patiënten. De tubulaire en glomerulaire dilatatie namen in omvang en aantal toe met toenemende leeftijd. Tegen P35 vertoonden transgene muizen ernstigere hyperplasie en bewijs van glomerulosclerose. Veranderde nierfysiologische functies in SBPkd1TAG-muizen. Nierfysiologische functies van alle transgene muizen vertoonden kenmerken die vergelijkbaar zijn met PKD(polycysteuze nierziekte), terwijl de niet-transgene nestgenoten de ziekte nooit ontwikkelden. Binnen enkele maanden na de geboorte ontwikkelden de aangetaste dieren chronische nierinsufficiëntie. Deze dieren werden gecontroleerd op nierfunctieparameters door meting van serum- en urinespiegels, bloedureumstikstof (BUN) en creatinine, urine-osmolaliteit, urine-eiwit en ionenuitscheiding (Tabel 1). Alle muizen uit de drie lijnen vergeleken met controles vertoonden concentratiestoornissen, een veel voorkomende bevinding bij ADPKD, en vertoonden bijgevolg verminderde urine-BUN-, creatinine-, eiwit- en ijzerconcentraties. Transgene SBPkd1TAG-oprichters en nakomelingen (n 6) van elke lijn werden kwalitatief gevolgd op proteïnurie op urinemonsters door SDS-PAGE (Fig. 5). Muizen ouder dan 2 maanden vertoonden niet-selectieve proteïnurie die met de leeftijd vorderde. Bovendien waren de niveaus van het serum BUN en serumcreatinine verhoogd, wat nierinsufficiëntie aan het licht bracht (tabel 2). Omdat chronische nierinsufficiëntie vaak leidt tot veranderingen in hematologische parameters, werden deze onderzocht in SBPkd1TAG transgene muizen van 3 tot 14 maanden oud (Tabel 2). Deze transgene muizen hadden bloedarmoede, zoals blijkt uit het significant verlaagde aantal rode bloedcellen, waarbij hemoglobine en hematocriet de helft van de normale niveaus bereikten. Andere parameters van rode bloedcellen, zoals het percentage reticulocyten, werden niet beïnvloed, zoals verwacht wanneer ze werden geïnduceerd door een nierafwijking. Deze dieren stierven consequent aan nierfalen op de leeftijd van 5.9  2,8 maanden (n 42) voor transgene lijn 39 en op latere leeftijd, 14.6 3,1 maanden (n 20) en 11 .7 6,5 maanden (n 7), voor respectievelijk regel 3 en 41.

Afb. 1. Schematische weergave en gedetailleerde restrictiekaartanalyse van een muizen Pkd1-BAC.

Genomische DNA-digestiepatronen van de Pkd1(polycysteuze nierziekte)-BAC werden vergeleken met die van de Pkd1(polycysteuze nierziekte)locus in de 129Sv en C57Bl/6J inteelt muizenstammen. Er werden zeven probes geproduceerd die het grootste deel van het muizen-Pkd1-gen omvatten:

(a) exon 1, (b) exon 2-3, (c) exon 7-15, (d) exon 15-20, (e) exon 25-34, (f) exon 36-45, en (g) exon 45-46, gelabeld a tot g op de genomische Pkd1(polycysteuze nierziekte)representatie en over individuele blots.

Southern-blot-analyse na restrictiedigesten (BamHI, EcoRI, HindIII en KpnI) van genomisch DNA van de Pkd1-BAC en muizen Pkd1(polycysteuze nierziekte)loci vertoonden identieke patronen met alle zeven sondes. M, HindIII-merker; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISCUSSIE

Hierin rapporteren we de isolatie en karakterisering van een muizen Pkd1-BAC. Deze Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen werd gelabeld en regulerende elementen werden vervangen om expressie specifiek naar de nieren te richten door twee opeenvolgende homologe recombinatiegebeurtenissen. Transgene muizen geproduceerd met dit nieuwe SBPkd1TAG-gen vertoonden een 2- tot 15-voudige toename in Pkd1-expressie en ontwikkelden reproduceerbaar vroege niermorfologische veranderingen die typisch zijn voor PKD. Nierinsufficiëntie is duidelijk op middelbare leeftijd en muizen sterven voortijdig aan nierfalen. Onze resultaten geven ook aan dat het Pkd1-overexpressiemechanisme dat verantwoordelijk is voor dit fenotype wordt gemedieerd door signaleringsactivering van c-myc in vivo. Deze studie toont aan dat de Pkd1-functie van de muis in de nieren voldoende is om een ​​PKD-renaal fenotype te produceren. Aangezien het muizen-Pkd1-gen niet wordt gedupliceerd zoals bij mensen (27), hebben we direct een BAC-kloon geïdentificeerd en geïsoleerd die het volledige Pkd1-gen bevatte. Volledige karakterisering van de 129/Sv muizen Pkd1-BAC, indirecte vergelijking met twee andere inteelt muizenstammen, bevestigde de integriteit van de Pkd1 locus. Het Pkd1-BAC-insert bevatte 37 tot 39 kb stroomopwaartse en stroomafwaartse sequenties van het Pkd1-gen. Onze analyse toonde aan dat het Pkd1-gen in deze BAC een bonafide murine wildtype locus was die voor verdere studies zou kunnen dienen. Hoewel er sterk bewijs is dat cystevorming in ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)kan het gevolg zijn van verlies van heterozygotie na somatische inactivatie van de normale PKD1(polycysteuze nierziekte)allel (3, 21, 32), is er ook suggestief bewijs voor aanhoudende of zelfs verhoogde polycystine-1-expressie in het cystische tubulaire epitheel (22, 29). De laatste observatie roept de vraag op of overexpressie van Pkd1 op zich een voldoende directe oorzaak van cystogenese is. Bij transgene muizen die het menselijke PKD1 . dragen(polycysteuze nierziekte), TSC2-, RAB 26-, NTHL1- en SLC9A3R2-genen, ontwikkelde slechts een minderheid van de muizen cysten en geen enkele had detecteerbare transgenexpressie op volwassen leeftijd ondanks 30 kopieën van het transgen (31). Bij die transgene muizen was het moeilijk om een ​​duidelijke rol voor Pkd1-overexpressie bij cystogenese vast te stellen. Ons model verschilt, aangezien twee tot negen wild-type kopieën van Pkd1 alleen, zonder aangrenzende genen, werden geïntegreerd in transgene muizen. Aangezien het Pkd1-gen essentiële functies heeft in verschillende organen of weefsels, zoals beschreven voor talrijke muizen met ablatie van het Pkd1-gen, zou systemische overexpressie van Pkd1 kunnen leiden tot bijkomende verstorende effecten. Daarom hebben we de rol van Pkd1-functiewinst aangepakt met behulp van een benadering die Pkd1 specifiek op de nieren richt. Door homologe recombinatie hebben we eerst het stroomopwaartse regulerende gebied van Pkd1 vervangen door de "SB" renaal beperkte regulerende elementen, waardoor de verminderde genexpressie die normaal wordt gezien voor Pkd1 op volwassen leeftijd, evenals potentiële secundaire feedbacklusregulatie wordt voorkomen (36, 38). Ten tweede hebben we het murine Pkd1-transgen (Pkd1TAG) gemarkeerd met een stille puntmutatie in exon 10, maar hebben we geen epitoop-tag ingevoegd om ervoor te zorgen dat een volledig functioneel "wildtype" eiwit met geconserveerde structuur en integriteit zou worden geproduceerd. Van deze gemodificeerde BAC werd een SBPkd1TAG-fragment gezuiverd van het Tsc2-gen en de BAC-vector om interferentie door het Tsc2-gen te voorkomen, dat ook een cystisch fenotype kan induceren (8, 20, 28), en om het remmende effect van prokaryotische sequenties (5).

Er werden vier verschillende SBPkd1TAG transgene stammuizen en drie onafhankelijke lijnen geproduceerd met specifiek nier Pkd1(polycysteuze nierziekte)-verbeterde expressie. Bijzonder opvallend is de volledige penetrantie van het fenotype bij deze transgene muizen. De oprichter en muislijnen van SBPkd1TAG hadden verschillende fysiopathologische kenmerken gemeen met ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte). Deze omvatten de ontwikkeling van cysten in de cortex, medulla en glomeruli samen met epitheliale hyperplasie, interstitiële fibrose en focale interstitiële ontsteking.

Omdat de PKD(polycysteuze nierziekte)fenotype werd consistent waargenomen in alle verschillende transgene stammuizen en de transgenintegratie in het muizengenoom is een willekeurig fenomeen, het fenotype kan niet het gevolg zijn van het chromosomale positie-effect, maar alleen van verhoogde Pkd1-expressie. Er werd inderdaad aangetoond dat expressie van het Pkd1-transgen in alle lijnen renaal beperkt is, zoals eerder waargenomen voor andere transgenen die worden gereguleerd door de "SB" -elementen (36, 38). Bovendien werd deze verhoogde Pkd1-expressie veroorzaakt door het transgen en niet door een indirecte endogene Pkd1-activering. Daarom leveren onze resultaten duidelijk bewijs dat de versterking van de functie van een wildtype functionele Pkd1 meerdere niercysten kan produceren. Belangrijk is dat deze SBPkd1TAG-muizen het eerste muismodel vormen dat wordt gegenereerd door de enige overexpressie van de muisortholoog van het menselijke PKD1-gen.

De SBPkd1TAG-muizen laten zien dat Pkd1(polycysteuze nierziekte)overexpressie is een primair pathogenetisch mechanisme van renale cystogenese. Belangrijk is dat de hoogste transgenexpressieniveaus in de nieren bleken te correleren met de progressie en ernst van het fenotype. We hebben ook gevonden dat overexpressie van Pkd1 in de ontwikkeling van het SBPkd1TAG-fenotype waarschijnlijk de activering van c-myc in vivo signaleert. Het is denkbaar dat deze activering zelfs direct kan zijn via de polycystine-1 C-terminale staart die proteolytische splitsing en nucleaire translocatie ondergaat (7). Aangezien werd aangetoond dat verhoogde renale expressie van c-myc bij volwassen muizen PKD induceert, zou het zeer consistent zijn om c-myc te ondersteunen als een belangrijke stroomafwaartse effector van Pkd1-signaleringsroutes. Dit resultaat correleerde ook met onze eerdere bevindingen van verhoogde c-myc-expressie in de nieren van alle menselijke ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)geanalyseerd (22). Al met al geven deze resultaten aan dat c-myc een primaire mediator is van Pkd1(polycysteuze nierziekte)cystogenese. Onze resultaten van het Pkd1 gain-of-function-model, samen met muizen Pkd1 haploinsufficiëntie en functieverlies, geven aan dat elke Pkd1-ontregeling zou kunnen leiden tot cystogenese (2, 19, 23-26, 31, 40).

Ernstige Pkd1(polycysteuze nierziekte)onbalans bij muizen veroorzaakt door Pkd1(polycysteuze nierziekte)ablatie of transgene overexpressie veroorzaakte een vroeg begin en snelle progressie van niercysten en tastte een groot deel van de tubuli aan. Daarentegen leidde een mildere Pkd1-onbalans zoals haplo-insufficiëntie tot een langzamere progressie van PKD met meer focale cysten. De schijnbaar paradoxale ontwikkeling van een vergelijkbaar fenotype door middel van tegengestelde polycystine-1-ontregeling zou kunnen worden verklaard door het algemene resultaat, namelijk een relatieve onbalans in de eiwitconcentratie die de vorming of de functie van een actief polycystine-multiproteïnecomplex zou kunnen veranderen. Al met al beweren onze resultaten en die van andere onderzoekers dat het mechanisme van cystevorming in ADPKD (autosomaal dominantpolycysteuze nierziekte)komt waarschijnlijk voort uit drie pathogenetische mechanismen: functiewinst, functieverlies en gendoseringseffecten. De nieuwe SBPkd1TAG-muizen vormen een krachtig model van renale cystogenese dat belangrijke inzichten kan verschaffen in de pathofysiologie van PKD(polycysteuze nierziekte), Pkd1(polycysteuze nierziekte)signaaltransductieroutes en interactiepartners. De studie van dit model kan ook leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om de normale eiwitbalans binnen het Pkd1-multimeercomplex te herstellen.

REFERENTIES

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos en M. Trudel 2000. Genetische correctie van sikkelcelziekte: inzichten met behulp van transgene muismodellen. nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle en R. Sandford. 2001. Cardiovasculaire, skelet- en nierdefecten bij muizen met een gerichte verstoring van de Pkd1(polycysteuze nierziekte)gen.Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 98:12174-12179.

3. Brasier, JL en EPHenske.1997. Verlies van depolycysteuze nierziekte(PKD1) regio van chromosoom 16p13 in niercystecellen ondersteunt een functieverliesmodel voor cystepathogenese. J. Clin. Onderzoek.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T.Watnick, GG Germino en NA Doggett.1995. Analyse van de genomische sequentie voor deautosomaal dominant polycysteuze nierziekte(PKD1) gen voorspelt de aanwezigheid van een leucine-rijke herhaling. Brommen. Mol. Genet.4:575-582.

5.Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E.Lacy en F.Costantini.1985. Specifieke expressie van een vreemd -globinegen in erytroïde cellen van transgene muizen. Natuur 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst, GG Germino en M.-C. Gubler.2002. Expressie van PKD1(polycysteuze nierziekte)en PKD2(polycysteuze nierziekte)transcripten en eiwitten in het menselijke embryo en tijdens de normale ontwikkeling van de nieren. Ben. J. Pathol 160:973-983.

7.Chauvet, V., X. Tian, ​​H.Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo en MJ Caplan.2004. Mechanische stimuli induceren splitsing en nucleaire translocatie van het polycystine-1 C-uiteinde. J. Clin. Onderzoek. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson en DJ Kwiatkowski.2000. Moleculair genetische vooruitgang in tubereuze sclerose. Brommen. Genet.107:97-114. 9. Consortium, EPKD1993. Identificatie en karakterisering van het tubereuze sclerose-gen op chromosoom 16. Cel 75:1305-1315.

10. Consortium, EPKD1994. Het gen voor polycystische nierziekte 1 codeert voor een transcript van 14 kb en ligt in een gedupliceerd gebied op chromosoom 16. Cel 77:881-894.

11. Consortium, IPKD1995. Polycystische nierziekte: de volledige structuur van de PKD1(polycysteuze nierziekte)gen en zijn eiwit. Cel 81:289-298.

12.Couillard, M., R. Guillaume,N. Tanji, V. DAgati en M. Trudel.2002. Door c-myc geïnduceerde apoptose bij polycystische nierziekte is onafhankelijk van FasL Fas-interactie. Kanker onderzoek. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME en M. Trudel.1994. De transgene SAD-muis: een model van menselijke sikkelcelglomerulopathie. Nier Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders en J.Zhou. 1996. Identificatie en lokalisatie van polycystine, de PKD1(polycysteuze nierziekte)gen product. J. Clin. Onderzoek. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li en N.Heintz.2002. Zeer efficiënte modificatie van bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC's) met behulp van nieuwe shuttle-vectoren die de R6Ky-oorsprong van replicatie bevatten. Genoom onderzoek. 12;1992-1998.