De centrale rol van transformerende groeifactor- (TGF-) bij de ontwikkeling van nierfibrose
Mar 26, 2022
Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
DEEL Ⅰ: Rol van menselijke primaire nierfibroblasten in TGF- 1-Gemedieerde fibrose-nabootsende apparaten
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Inleiding
Nierfibrose, de laatste gemeenschappelijke route van ontelbare progressieve nierziekten, wordt gekenmerkt door een toename van de productie van extracellulaire matrix (ECM) eiwit, een afname van de afbraak van de matrix, disfunctie van cel-matrix-interactie, de transformatie van residente cellen en infiltratie van ontstekingscellen.Transformerende groeifactor-(TGF-) is een multifunctioneel dimeer peptide dat biologische processen reguleert, zoals celproliferatie, differentiatie en immunologische reacties [1]. Onder de talrijke fibrogene factoren is TGF- (Transformerende groeifactor-) speelt een centrale rol en heeft een ontstekingsremmende werking. TGF- 1(Transformerende groeifactor-)-deficiënte muizen sterven aan massale ontsteking. Transgene muizen die TGF tot overexpressie brengen- 1(Transformerende groeifactor-)zijn vrijwel beschermd tegen het ontwikkelen van renale fibrotische pathologie, voornamelijk door zijn ontstekingsremmende activiteit [2]. De profibrotische en ontstekingsremmende eigenschappen van TGF-(Transformerende groeifactor-)zijn tweesnijdende zwaarden met betrekking tot de therapeutische toepassing van TGF-(Transformerende groeifactor-)remming. Er zijn opmerkelijke inspanningen gedaan om TGF-(Transformerende groeifactor-)actie om de voortgang vannierfibrose[3]. Hoewel er veel benaderingen zijn gebruikt omnierfibrose, is een experimenteel model om momenteel beschikbare medicijnen te evalueren niet ideaal.
cistanche kruid voorkomennierziekten
In het algemeen spelen dierstudies een cruciale rol in preklinische tests bij het voorspellen van farmacokinetiek en werkzaamheid van geneesmiddelen. Er bestaan echter verschillende verschillen tussen dieren en mensen, wat ons ertoe aanzet om de nauwkeurigheid van diergeneesmiddelwerkzaamheid en veiligheidstests in twijfel te trekken 4. Eerdere rapporten waren afhankelijk van preklinische dierstudies tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen om de nefrotoxiciteit en veiligheid van geneesmiddelen te beoordelen. De nierfunctie van dieren is meer dan het dubbele van die van de menselijke nieren. Geneesmiddelen worden dus sneller gemetaboliseerd bij dieren dan bij mensen, waardoor het moeilijk is om de resultaten van toxiciteitstests voor geneesmiddelen op basis van dierstudies op te helderen. Bovendien kunnen de resultaten van dierproeven niet worden gebruikt om de reacties op geneesmiddelen bij mensen te voorspellen, omdat dieren verschillende fysiologische functies hebben. Op dieren gebaseerdnierfibrosemodellen hebben moeite met het reproduceren van menselijkenierfibrose; daarom is er onderzoek gaande om de huidige obstakels te overwinnen en platforms voor het ontdekken van geneesmiddelen te optimaliseren [5].
Organ-on-a-chip (OoC) technologie is naar voren gekomen als een nieuw concept om deze problemen op te lossen. Dit platform is ontworpen met het oog op de huidige tekortkomingen en is veelbelovend gebleken op het gebied van nefrologie [6]. Bovendien hebben OoC-modellen een groot potentieel als vervanging voor experimentele diermodellen, bieden ze een oplossing voor verschillen tussen soorten en kunnen ze helpen een einde te maken aan dierenmishandeling en ethische debatten [7]. Er zijn weinig in vitro-modellen die gelijktijdig primaire nierfibroblasten gebruiken met endotheel- en epitheelcellen, die belangrijke cellen zijn innierfibrose. De rol van elke cel infibrosewordt apart bestudeerd; er is echter beperkte kennis over de interactie van cellen.
In de huidige studie ontwikkelden wefibrose- apparaten nabootsen die menselijke primaire fibroblasten gebruiken. We hebben bevestigd dat TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling heeft verschillende effecten op denierfibrosemodel. Met name spelen fibroblasten een cruciale rol als effectorcellen, bevorderen ze de vorming van een pro-fibrotische micro-omgeving en scheiden ze groeifactoren en cytokinen af. Daarom kunnen fibroblasten, op basis van deze nieuwe methode, een ideaal celmodelsysteem bieden om nierziekte te bestuderen. We evalueerden of van fibrotische nierziekte afgeleide fibroblasten de integriteit van in drie dimensies gekweekte cellen beïnvloeden (3D). Ten slotte presenteren we een proof-of-principle-onderzoek dat het potentieel van menselijkenierfibrose- apparaten nabootsen als een model voor het voorspellen van de reactie op de mensnierfibrose.
effecten van cistanche: behandel nierinfectie
2. Resultaten
2.1.Identificatie van alfa-gladde spieractine(a-SMA) en keratine-8(KRT-8) door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)in HK-2 Cellen
In de vroege fase onderzochten we bekende markers vanfibroseen het cytoskelet in tweedimensionale (2D)culturen. Immunofluorescentiekleuringstesten werden uitgevoerd om de -SMA-expressie van fibrose en tubulaire epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) marker en KRT8-niveaus als een cytoskeletmarker te schatten. Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat de expressie van -SMA oorspronkelijk zwak was en dat de KRT8-niveaus hoog waren in de monolaag HK-2-epitheelcellen. Er was geen significante verandering in fluorescentie-intensiteit door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)(5 ng/mL) of de specifieke remmerbehandeling van HK-2-epitheelcellen gedurende 24 uur (Figuur 1).
Figuur 1. Immunofluorescentie laat zien dat de expressie van alfa-SMA en keratine-8(KRT8) behouden bleef door behandeling van TGF- 1(Transformerende groeifactor-)of de remmer in HK-2-cellen.(A)De expressie van alfa-SMA en (B)CCK-8 had geen effect op HK-2cellen door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)(5ng/ml) of de remmer. Cellen werden oorspronkelijk uitgeplaat met een dichtheid van 1 × 10 graden per putje (ac) onbehandelde controle en （df-gestimuleerd met 5ng/mL TGF- 1(Transformerende groeifactor-) or（gi）10 μM-remmer (SB431542) gedurende 24 uur en gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde. De cellen werden vervolgens 20 minuten gekleurd met anti- -SMA en anti-cytokeratine-8. Co-kleuring met Hoechst-kleurstof H33342 om celkernen te identificeren werd uitgevoerd. Schaalbalken in microfoto's geven 200 um aan.
cistanchepoeder verbetert de nierfunctie
2.2. KRT8-expressie verminderd door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)op een chip
Vervolgens evalueerden we de expressieniveaus van -SMA en KRT8 in 3D-gekweekte HK-2 en de totale lengte van GFP-humane navelstrengendotheelcellen (HUVEC's) behandeld met TGF- 1(Transformerende groeifactor-)en een specifieke remmer. Om dit te bereiken, hebben we eerst een weefselchippatroon vastgesteld dat bestaat uit twee celtypen, HK-2-epitheelcellen en GFP-HUVEC's. Na bevestiging van het construct hebben we de weefselchip belicht met TGF- 1(Transformerende groeifactor-)(5 ng/mL) of een specifieke remmer (10 um SB431542) gedurende 24 uur.
Zoals weergegeven in figuur 2A-C, werd de expressie van -SMA niet specifiek veranderd door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)of de specifieke remmersbehandeling. De expressie van KRT8 was echter verminderd in de co-gekweekte chip van het tweecellige type. Bovendien verhoogde de toevoeging van een TGF-ß1-remmer de expressie van KRT8.
We onderzochten de vorming van een 3D buisvormig capillair-achtig netwerk door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling in HUVEC's, aangezien endotheelcellen spontaan een 3D tubulair capillair-achtig netwerk kunnen vormen. In overeenstemming met onze culturele omstandigheden was de vorming van dikke lijnen aanzienlijk verminderd. Er waren echter capillairachtige dunne lijnen verhoogd in de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandelde GFP-HUVEC's. In het geval van de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)remmerbehandeling op de 3D-gekweekte chip, de totale lengte van de dikke en dikke lijnen vertoonde een omgekeerde neiging tot TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling. Een toename in de lengte van de dikke lijn werd waargenomen in vergelijking met de onbehandelde controlegroep. Een soortgelijk patroon werd waargenomen in de diameter van de dikke lijn in GFP-HUVEC na TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling en remmersbehandeling. De diameter van de GFP-HUVEC werd onderdrukt door de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling, maar nam toe ongeacht de dikte van de lijn door de remmer in vergelijking met zowel de controles als TGF- 1(Transformerende groeifactor-). De totale lengte en diameter van de dikke lijn waren dramatisch toegenomen door behandeling met TGF- 1-remmer in vergelijking met de onbehandelde controle en behandeling met TGF- 1. Met name de verkregen resultaten duidden op een verhoogde dichtheid van kleine bloedvaten in de TGF-(Transformerende groeifactor-)-behandelde groep vergeleken met hun onbehandelde tegenhangers. Daarentegen is de dichtheid van dikke vaten in de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandelingsgroep was lager dan die in de onbehandelde controlegroep (Figuur 2D, E).
Figuur 2. KRT8-expressie in HK-2 en totale lengte en diameter van de HUVEC's.(A) Immunofluorescentie laat zien dat de expressie van -SMA behouden bleef en dat de KRT8-expressie drastisch werd verlaagd door behandeling van TGF- 1(Transformerende groeifactor-)in Hongkong-2. Cellen werden uitgeplaat en gestimuleerd met 5ng/mL TGF- 1(Transformerende groeifactor-)of 10 m remmer （SB 431542） gedurende 24 uur en gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde. De cellen werden 20 minuten gekleurd met anti- -SMA en anti-cytokeratine-8. Co-kleuring met Hoechst-kleurstof H33342 om celkernen te identificeren werd uitgevoerd. De expressie van -SMA(ac) had geen verandering, maar KRT8(df) in HK-2-cellen en GFP in HUVEC (gi)-expressie waren significant veranderd door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)(5 ng/mL) en de remmer (B, C). In de totale lengte van de HUVEC's was het dunne vat vergroot, maar het dikke vat werd verkleind door TGF- 1(Transformerende groeifactor-). De diameter werd vergroot in zowel de dunne als de dikke vaten. Deze resultaten werden teruggedraaid door de remmer SB431542 (D, E). Schaalbalken in de microfoto geven 100 m aan.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
waar wordt cistanche voor gebruikt: behandeling van chronische nieraandoeningen
2.3. TGF- 1(Transformerende groeifactor-)Beïnvloedt drie celtypen van de chip met een structuur met meerdere compartimenten
De TGF bestuderen- 1(Transformerende groeifactor-)reacties van de voorgestelde 3D-chip hebben we immunokleuring op elk compartiment afzonderlijk uitgevoerd (Figuur 3). Bij deze analyse werden primaire menselijke nierfibroblasten gebruikt. De monsters werden geanalyseerd met behulp van FACS en bevestigd dat ze positief waren voor het fibroblastmarkerantilichaam. Na incubatie van de drie celtypen met TGF- 1(Transformerende groeifactor-)gedurende 24 uur werd immunokleuring uitgevoerd om de expressie van -SMA en KRT8 te beoordelen. De expressie van a-SMA werd opgereguleerd door TGF-1-behandeling en tegengestelde resultaten werden waargenomen met TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling met remmers. Omgekeerd werd de expressie van KRT8 gedownreguleerd door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)en vertoonde een tegengestelde reactie op de TGF-(Transformerende groeifactor-)remmer (Figuur 4A-C).
Figuur 3. Voorbeeldafbeelding met apparaat schematische demonstratie van de fabricage en experimentele schema.(A) De bovenste twee afbeeldingen tonen de lay-out. De linkerafbeelding toont een algemene foto van bovenaf van het apparaat. De onderste afbeeldingen tonen de doorsnede. Schematische weergave van de afmetingen van de vloeistofgeleiders. (B) Deze figuur beschrijft de experimentele schema's voor:fibrose- apparaten nabootsen. Het vierstaps laadproces voor elk putje. Locatie van elk hydrogelpatroongebied, evenals de plaatsing van de media in top-down en isometrische doorsnede. (1) Een totaal van 1,5 uL hydrogel 1 wordt spontaan in het centrale kanaal geleid. (2) Centraal kanaal is gevuld met 5 L hydrogel. (3) In totaal 10 L hydrogel 3 is van een patroon voorzien op de bodem van het reservoir. （4）Er wordt in totaal 200μL media gedoseerd. Rode schaalbalk=9 mm.
Zoals afgebeeld in figuur 4D-G, werd de lengte van de capillair-achtige dunne lijn significant verhoogd door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling in de GFP-HUVEC's. De dikte van de dikke lijn was echter afgenomen in de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandelde HUVEC's. De diameter werd gemiddeld verkleind voor de dunne en dikke vaten in de HUVEC's. In het geval van de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling met een remmer op de 3D-gekweekte chip, vertoonde de totale lengte van de dikke en dikke lijnen een tegengestelde trend ten opzichte van de TGF- 1-behandeling. Verder was de lengte van de dikke lijn toegenomen in vergelijking met de onbehandelde controlegroep.
Figuur 4. Wijziging van 3D-gekweekte HK-2 en HUVEC's met primaire nierfibroblasten.Totale cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 5×10 graden per 3D-chip en gestimuleerd met 5 ng/mL TGF- 1(Transformerende groeifactor-)of 10 m remmer （SB 431542） gedurende 24 uur en gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde. (A) Cellen in de 3D-chip werden gekleurd met anti-o-SMA en anti-cytokeratine -8. De expressie van -SMA (ac) was verhoogd en KRT8(df)-expressie was significant verlaagd door TGF- 1 (5 ng/mL). De totale lengte van de HUVEC's; dunne vaten werden dramatisch verhoogd en dikke vaten werden verlaagd door TGF-ß1(Transformerende groeifactor-)D, E). De diameter werd verkleind voor dunne en dikke vaten (F, G). Deze resultaten werden omgekeerd door de remmer SB431542. Schaalbalken in microfoto's geven 100 m aan. * p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 moduleert ontstekingsmediator en groeifactoren
Vervolgens onderzochten we de inflammatoire cytokines en groeifactoren in het supernatant; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Transformerende groeifactor-), en TGF- 3(Transformerende groeifactor-)eiwitsecretie was dramatisch hoger in 3D-gekweekte chips dan de 2D-fibroblast die goed was gekweekt, hoewel ze hetzelfde totale aantal cellen hadden. Echter, TGF- 1(Transformerende groeifactor-) niveaus waren vergelijkbaar, aangezien de 2D- of 3D-gekweekte modellen werden behandeld met vergelijkbare concentraties TGF- 1(Transformerende groeifactor-)(Figuur 5A-E). In het bijzonder was de afgifte van FGF-2 uit menselijke primaire nierfibroblasten 20,9 ± 0,4 pg/dag/5×10 graden cellen van de 2D monolaagkweek en 3094,8 ± 0,2 pg/dag/5 x 10 graden cellen inclusief de HUVEC's en HK-2 van de 3D-gekweekte chip in de onbehandelde controle. De afscheiding van FGF-2 door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)stimulatie was 31.0±0.2pg/dag/5×10 graden cellen voor de 2D-cultuur en 3683.9±0.8 pg/dag/5×10 graden cellen voor de 3D -gekweekte chip. Deze toename in FGF-2-eiwitproductie in de 2D-monolaagcultuur ging gepaard met een toename in het 3D-gekweekte chipmodel door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling (Figuur 5B).
Figuur 5. Vergelijking van 2D- en 3D-gekweekte modellen als platforms voor het nabootsen van nierfibrose.Cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 5×10 graden per 2D-putje of 3D-chip en gestimuleerd met 5ng/mL TGF- 1(Transformerende groeifactor-)of 10 um-remmer (SB 431542) gedurende 24 uur. Primaire menselijke nierfibroblasten werden gebruikt in het 2D-gekweekte en in het 3D-gekweekte model. Fibroblasten werden gebruikt met een dichtheid van 8 x 10* gekweekt met HUVEC's en HK-2. De primaire humane renale fibroblast-tot-HUVEC-ratio, of F:H-ratio, was 1:5 voor beoordelingfibrose.HK-2-cellen werden gebruikt met een dichtheid van 2 × 104. Detectie van (A)IL-1, (B)basische fibroblastgroeifactor (FGF-2) en (CE)TGF-beta 1, 2 en 3 in het supernatant werd uitgevoerd door multiplexanalyse van cytokinen en multiplex-bead-immunoassay. Elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformerende groeifactor-).
Voordelen van cistanche tubolosa: nierziekten behandelen
Verder schatten we de mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokinen zoals IL-1 , IL-6, IL-8 en TNF-. De resultaten werden significant verlaagd door recombinant humaan TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling in de 3D-gekweekte chip als een ontstekingsremmende eigenschap van TGF-(Transformerende groeifactor-). We ontdekten dat mRNA-expressie werd opgereguleerd door de TGF- 1(Transformerende groeifactor-)remmer (SB431542). Bovendien werd door remmer gemedieerde expressie van IL-6, IL-8 en TNF- specifiek gedownreguleerd in vergelijking met de onbehandelde controle (Figuur 6A-D). Het mRNA-niveau van VEGF, een fibrotische factor, werd significant verhoogd door TGF- 1(Transformerende groeifactor-)behandeling. Het mRNA-niveau van VEGF werd verlaagd door de TGF- 1-remmer (Figuur 6E), terwijl de mRNA-expressie van IL-10 met antifibrotisch effect was verlaagd bij fibrotische aandoeningen veroorzaakt door TGF- 1 . Daarentegen werd de expressie van I-10mRNA verhoogd door behandeling met TGF- 1remmers (Figuur 6F).
Figuur 6. Real-time PCR toont de algehele mRNA-expressie van de 3D-chip.Cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 5×10 graden per 3D-chip en gestimuleerd met 5ng/mL TGF- 1(Transformerende groeifactor-)of 10 um-remmer (SB431542) gedurende 24 uur. Totaal RNA geëxtraheerd uit de 3D-gekweekte chip. De mRNA-expressie van (A)IL-1 ,(B)TNF-,(C)IL-6 en (D)IL-8 vertegenwoordigt het ontstekingsremmende effect van de TGF{ {10}}(Transformerende groeifactor-)behandeling. (E) VEGF-expressie als een angiogene factor was verhoogd. (F)IL-10-expressie als antifibrotische factor werd significant verlaagd door TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformerende groeifactor-).
