De cruciale rollen van TRPM6 bij de circadiaanse regulatie van bloeddruk

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Belang van het renale ionenkanaal TRPM6 in de circadiane secretie van renine om de bloeddruk te verhogen

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto & Hiroaki Miki

Bloeddrukheeft een dagelijks patroon, met hogere waarden in de actieve periode. De verhoging aan het begin van de actieve periode verhoogt het risico op fatale cardiovasculaire gebeurtenissen aanzienlijk. Reninesecretie gestimuleerd door renale sympathische neuronen wordt essentieel geacht voor dit proces; het regulerende mechanisme blijft echter grotendeels onbekend. Hier tonen we het belang vanvoorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6 (TRPM6), een Mg2 plus-permeabel kationkanaal, bij het verhogen van de renine-secretie in de actieve periode.TRPM6expressie is significant verminderd in de distale ingewikkelde tubulus van hypotensieve Cnnm2-deficiënte muizen. We genereren nierspecifiekeTRPM6-deficiënte muizen en een afname vanbloeddruken een verdwijning van de circadiane variatie. Consistent wordt de renine-secretie niet verhoogd in de actieve periode. Bovendien wordt de renine-uitscheiding na farmacologische activering van -adrenoreceptor, het doelwit van neuronale stimulatie, opgeheven en is de receptorexpressie verlaagd in renine-afscheidende cellen. Deze resultaten geven de cruciale rollen aan vanTRPM6 in de circadiane regulatie vanbloeddruk.

Naar schatting hebben wereldwijd ongeveer een miljard mensen hypertensie, wat het risico op verschillende ziekten aanzienlijk verhoogt, waaronder mogelijk dodelijke ziekten, zoals ischemische hartaandoeningen en beroertes. Van deze aan hypertensie gerelateerde fatale incidenten is bekend dat ze vaak voorkomen in de vroege ochtend, het begin van de actieve periode wanneer:bloeddrukstijgt sterk. Renine-secretie die wordt geactiveerd door renale sympathische neuronen wordt geacht hierin een cruciale rol te spelenbloeddrukhoogte, maar het regulerende mechanisme ervan is niet goed begrepen².

cistanche bodybuilding

Het wordt algemeen aanvaard dat sommige voedingsmineralen, met name natrium en kalium, een belangrijke rol spelen bij de beheersing vanbloeddruk. Magnesium is een belangrijk essentieel element dat betrokken is bij een verscheidenheid aan biologische activiteiten. Epidemiologische onderzoeken hebben een significant omgekeerd verband aangetoond tussen magnesiumgehaltes in de voeding en het risico op hypertensie3-6. Bovendien is de uitscheiding van magnesium via de urine, waarvan wordt aangenomen dat deze ongeveer in evenwicht is met de intestinale magnesiumabsorptie, omgekeerd evenredig met het risico op hypertensie. Deze bevindingen suggereren een nauw verband tussen de magnesiumhomeostase van het organisme enbloeddrukregelgeving, waarbij het belang van Mg2 plus kanalen en/of transporteurs in de regulering vanbloeddruk.

Een grote hoeveelheid magnesium wordt voortdurend opnieuw opgenomen in de nieren. Het meeste magnesium in het glomerulaire filtraat wordt opnieuw geabsorbeerd in het dikke opstijgende deel van de lus van Henle, maar de laatste stap van reabsorptie vindt plaats in de distale gekronkelde tubulus (DCT)8. Het laatste proces wordt strak gereguleerd om de hoeveelheid reabsorptie aan te passen tot een niveau dat geschikt is voor het handhaven van magnesiumhomeostase. Genomische analyses van aangeboren ziekten met symptomen van hypomagnesiëmie hebben verschillende sleutelmoleculen onthuld die bij dit proces betrokken zijnTRPM6, coderingvoorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6(TRPM6), die gemuteerd is bij patiënten met recessieve hypomagnesiëmie met secundaire hypocalciëmie2,10.TRPM6vormt een Mg2 plus -permeabel ionkanaal gelokaliseerd op het apicale membraan van DCT-cellen en bemiddelt Mg2 plus opname uit het tubulaire lumen1. Een ander sleutelmolecuul is cycline M2 (CNNM2) en Mg2 plus transporter gelokaliseerd op het basolaterale membraan van DCT-cellen12,13. Cnnm2-mutaties veroorzaken familiale dominante hypomagnesiëmie, die wordt gekenmerkt door defecten in de reabsorptie van magnesium in de nier2. Cnmm2-deficiënte muizen vertonen vergelijkbare symptomen van hypomagnesiëmie met magnesiumverspilling in de nier4. De precieze moleculaire rol van CNNM2 is nog steeds controversieel, maar verschillende bewijslijnen suggereren dat het Mg2 plus efflux van DCT-cellen door het basolaterale membraan5 bemiddelt, waardoor het bijdraagt ​​aan de reabsorptie van magnesium. Verdere analyses van Cnnm2-deficiënte muizen hebben aangetoond dat deze muizen ook significant lagerebloeddrukdan controlemuizen4. Echter, de mechanistische details en de betrokkenheid van andere Mg2 plus kanalen/transporteurs hierbijbloeddrukregelgeving blijft onbekend.

Het is ook bekend dat de renale DCT een cruciale rol speelt bijbloeddrukregulatie omdat het natrium aanzienlijk herabsorbeert en het lichaamsvloeistofvolume regeltl6. Een aantal kationkanalen/transporters, zoals de Na-Cl co-transporter (NCC), epitheliaal natriumkanaal (ENaC) en Na plus /H plus exchanger 2 (NHE2), worden uitgedrukt op het DCT apicale membraan en sommige van deze eiwitten bemiddelen Na plus opname in DCT-cellen vanuit het tubulaire lumen. Intracellulair Na plus wordt vervolgens uit de cellen geëxtrudeerd door het basolaterale membraan door Na plus/K plus -ATPase om zijn reabsorptie tot stand te brengen. Afgezien van directe betrokkenheid bij het reguleren van het lichaamsvloeistofvolume, bevindt de DCT zich naast de macula densa, die de secretie van renine regelt, een hormoon met de belangrijkste rol bij het orkestreren vanbloeddrukverordening17,18. Door Cl-niveaus in de urine te detecteren, stimuleren macula densa-cellen nabijgelegen juxta-glomerulaire (JG) cellen om renine af te scheiden.

In dit werk voeren we transcriptoomanalyses uit met nieren van hypotensieve Cnnm2-deficiënte muizen. We vinden een significante afname vanTrpm6, wat ons ertoe aanzet om nierspecifiekeTrpm6-deficiënte muizen. Onverwacht onthullen analyses van deze muizenstam een ​​fenotype dat kwalitatief verschilt van dat van Cnnm2-deficiëntie: het verlies van circadiane variatie vanbloeddruk. We vinden ook dat dit fenotype wordt veroorzaakt door een verminderde secretie van renine, abloeddruk-verhogend hormoon waarvan de bloedspiegel normaal gesproken verhoogd is tijdens de actieve fase.

cistanche bodybuilding

Resultaten

Downregulatie vanTRPM6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)expressie in Cnnm2-deficiënte muizen. Onderzoek naar het moleculaire mechanisme vanbloeddrukvermindering van Cnnm2-deficiënte muizen, we voerden DNA-microarray-analyses uit om genexpressieveranderingen in de nier van Cnnm2f/il te onderzoeken; Zes2-Cre-muizen, zonder beide Cnnm2-allelen in de nier4. Van de differentieel tot expressie gebrachte genen (tabel 1) hebben we ervoor gekozen om Pvalb en . te analyserenTrpm6, die beide worden uitgedrukt in de DCT919. Uit kwantitatieve PCR(qPCR)-analyses bleek dat:Trpm6expressie was op vergelijkbare wijze verminderd in de nieren van beide Cnnm2fi; Zes2-Cre en Cnnm2 plus / muizen. Aangezien zowel Cnnm2 plus /A als Cnnm2fi/; Zes2-Cre-muizen waren hypotensief4, analyseerden weTRPM6 meer in detail uitdrukken. Immunoblotting-analyses van nierlysaten bevestigden een significante afname vanTRPM6op eiwitniveau door Cnnm2-deficiëntie, terwijl de niveaus van NCC en gefosforyleerde NCC (actieve vorm) niet duidelijk werden beïnvloed, werd CNNM2-expressie bevestigd door opeenvolgende immunoprecipitatie- en immunoblotting-analyses). De afname vanTRPM6in de nieren van Cnnm2f/i; Zes2-Cre-muizen werden ook bevestigd door immunofluorescentieanalyses.

We hebben ook onderzochtTRPM6expressie bij muizen zonder CNNM4, die ook symptomen van hypomagnesiëmie vertonen20 maar verhoogd zijnbloeddruk4. Immunoblotting en immunofluorescentie-analyses gaven aan dat:TRPM6expressie wordt verhoogd in DCT-cellen van Cnnm4-deficiënte muizen, wat suggereert dat:TRPM6uitdrukking is nauw verbonden metbloeddrukwaarden, maar het is niet direct gekoppeld aan het magnesiumgehalte in het bloed.

Regulering vanTRPM6expressie door intracellulair Mg2 plus in DCT-cellen. Om het moleculaire mechanisme van te karakteriserenTRPM6 neerwaartse regulatie in Cnnm2-deficiënte muizen, gebruikten we een DCT-afgeleide cellijn MDCT21, die dominant Cnnm2 en matig Cnnm3 en Cnnm4 tot expressie brengt onder genen van de Cnnm-familie. Omdat CNNM2 en CNNM4 een sterke Mg2 plus efflux-activiteit hebben, terwijl CNNM3 geen Mg2 plus efflux-activiteitl5 heeft, hebben we een kleine interfererende RNA (siRNA)-gemedieerde knockdown van Cnnm2, Cnnm4 of beide uitgevoerd. Cnnm2-knockdown verhoogde intracellulaire Mg-plus-niveaus ([Mg plus ]), en gelijktijdige knock-down van Cnnm4 leidde tot een lichte verhoging van gemiddelde [Mg2]; waarde, die niet statistisch significant was. We onderzochten vervolgensTrpm6expressie door qPCR en vond een significante afname na de Cnnm2 knockdown en een veel grotere afname na de dubbele knockdown van Cnnm2 en Cnnm4. Daarom,Trpm6expressie lijkt negatief te worden gereguleerd door intracellulaire Mg2-plus-niveaus, wat consistent is met de eerdere rapporten . Om het belang van Mg2 plus direct te onderzoeken, hebben we MDCT-cellen gekweekt in media met verschillende concentraties van Mg2 plus .1h, waarbij de extracellulaire Mg2 plus-concentratie verlaagde, leidde tot de verlaging van het intracellulaire Mg2 plus-niveau en de toename vanTrpm6expressie, wat een onderdrukkende rol van Mg2 plus suggereert. In het geval van dubbele knockdown (Cnnm2/Cnnm4) MDCT-cellen,Trpm6expressie werd onderdrukt met afnemende Mg2 plus

plus concentraties tot 0,2 mm, maar verdere verlagingen deden het onderdrukkende effect teniet; zowel intracellulair Mg2 plus enTrpm6niveaus waren niet significant verschillend van controle-siRNA-getransfecteerde cellen in zowel 0.1 als 0.02 mM omstandigheden. Deze resultaten duiden op een Mg2 plus-afhankelijk regulerend mechanisme vanTrpm6uitdrukking, die de verklaartTrpm6downregulatie in de nieren van Cnnm2-deficiënte muizen.

Voorwaardelijke verstoring vanTrpm6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)in de nier. Vervolgens wilden we genererenTrpm6-deficiënte muizen om het belang vanTRPM6in de regulering vanbloeddruk. We gebruikten een embryonale stam (ES) celkloon met een recombinantTrpm6allel (Trpm6-) die een splitsingsacceptorsequentie bevat, waardoor voortijdige mRNA-splitsing wordt geforceerd en resulterend in een mRNA dat is afgeknot na exon 6. Chimere heterozygote muizen werden verkregen door blastocyst-injectie van de ES-cellen en recombinatie werd bevestigd door PCR. We hebben deze gekruistTrpm6plus /- muizen, maar neeTrpm6-/--off_lente werden verkregen. Dit resultaat komt overeen met eerdere rapporten waaruit bleek dat embryonale letaliteit inTrpm6-deficiënte muizen24,25

Daarom voerden we een nierspecifieke conditionele verstoring vanTrpm6met behulp van Six2-Cre, dat de efficiënte en specifieke expressie van GFP-gefuseerd Cre-recombinase in de embryonale nier mogelijk maakt.Trpm6fl/, Six2-Cre-muizen (nierspecifiekTrpm6-deficiënte muizen) werden geboren met de verwachte Mendeliaanse verhouding. Om de uitdrukking van te bepalenTRPM6, voerden we immunoblotting-analyses uit met behulp van een anti-TRPM6antilichaam.TRPM6eiwitniveaus waren sterk verlaagd in de nieren vanTrpm6fl/fl, Six2-Cre muizen, maar er werden geen significante veranderingen waargenomen in andere organen. Immunofluorescentiekleuringsanalyses toonden ook geen expressie vanTRPM6in NCC-positieve DCT-cellen. We hebben geen significante waargenomenTRPM6-positief signaal in meer dan 100 van dergelijke clusters van NCC-positieve cellen, wat suggereert datTRPM6expressie wordt bijna volledig onderdrukt in DCT-cellen van Trpmfi/; Zes2-Cre muizen. Deze resultaten bevestigen de succesvolle generatie van nierspecifiekeTrpm6-deficiënte muizen.

We onderzochten eerst het effect van nierspecifiekeTrpm6-deficiëntie op magnesiumhomeostase. We hielden muizen in metabole kooien en verzamelden urine- en serummonsters, die vervolgens werden onderworpen aan colorimetrische kwantificering van magnesiumniveaus met behulp van Xylidyl Blue-I. Serummagnesiumspiegels waren significant lager inTrpm6l/l; Zes2-Cre-muizen vergeleken met die in controleTrpm6plus / plus ; Zes2-Cre-muizen, terwijl de magnesiumspiegels in de urine hoger waren. We voerden ook inductief gekoppelde plasma-emissiespectroscopie (ICP-ES) analyses uit om verschillende belangrijke metaalelementen in het serum te meten en ontdekten dat alleen magnesiumniveaus significant werden beïnvloed in Trpmd/; Zes2-Cre-muizen. Deze resultaten geven duidelijk aan dat nierspecifieke Trpm6-deficiënte muizen hypomagnesiëmie hebben met renaal magnesiumverlies, zoals waargenomen bij nierspecifieke Cnnm2-deficiënte micel4.

Gebrek aan circadiane variatie vanbloeddruken renine-activiteit. Vervolgens onderwierpen weTrpm6ik/l; Zes2-Cre muizen ombloeddrukmetingen met behulp van radiotelemetrie. Systolisch en diastolischbloeddrukwaarden waren beide significant lager inTrpm6l/; Zes2-Cre-muizen dan bij controlemuizen. Het is opmerkelijk dat de gebruikelijke circadiane variatie vanbloeddruk, met hoge waarden tijdens de donkere periode en lage waarden tijdens de lichte periode bij muizen, werd niet waargenomen inTrpm6v/l; Zes2-Cre muizen. Om te onderzoeken of het circadiane ritme normaal verloopt, gebruikten we radiotelemetrie om de locomotiefactiviteit van muizen te meten en bevestigden we een zeer duidelijke circadiane variatie inTrpm6l/; Zes{{0}}Cre muizen. We onderzochten ook bloedspiegels van vasopressine (AVP) en mRNA-niveaus van twee klokgenen Bmall en Per2 in de hersenen en de nieren; het is bekend dat ze allemaal typische circadiane variatie vertonen27,28. We analyseerden op zes verschillende tijdstippen (op 0,4,8 zeitgeber times(ZT) voor de lichte periode en op 12,16,20 ZT voor de donkere periode). Controlemuizen vertonen duidelijke circadiane patronen van hun expressie zoals eerder gemeld28, en nogmaals, we vonden geen significante afwijkingen inTrpm6/il; Zes2-Cre muizen. We hebben ook het expressieniveau van Trpm7 gecontroleerd, dat codeert voor een Mg2 plus -permeabel kanaal dat nauw verwant is aanTRPM6, in de nier. De expressiepatronen waren in beide erg vergelijkbaarTrpm6plus / plus ; Zes2-Cre en Trpm6f/; Zes2-Cre-muizen en vertoonden geen duidelijke circadiane patronen. Gezamenlijk concluderen we dat het circadiane ritme normaal verloopt inTrpm6i; Zes2-Cre muizen. Er is overwogen datbloeddrukverhoging tijdens de actieve periode (de donkere periode voor muizen en de lichte periode voor mensen) bij zowel mensen als muizen treedt op als reactie op een toename van de secretie van renine in het bloed2. We hebben de renine-activiteit gemeten in bloedmonsters verzameld op de zes verschillende hierboven beschreven tijdstippen. Tijdens de donkere perioden werd een duidelijke toename van de renine-activiteit in het bloed waargenomen in monsters van controlemuizen, maar er werd geen significante toename waargenomen in monsters van die vanTrpm6/lSix2-Cre muizen. We hebben ook de bloedspiegel van noradrenaline gemeten, waarvan bekend is dat de afgifte wordt gestimuleerd door de activering van het renine-angiotensinesysteem29,30. Zoals verwacht verdween hun circadiane variatie ook inTrpm6, Zes2-Cre muizen. Ondertussen werd het eiwitniveau van bloedangiotensinogeen (AGT), een ander snelheidsbeperkend molecuul voor het activeren van het renine-angiotensinesysteem bij muizen31, niet beïnvloed doorTrpm6 tekort. De resultaten suggereren dat de verminderde circadiane variatie van renine belangrijk is voor het verlies van circadiane variatie van reninebloeddrukdoorTrpm6-tekort.

de nabijheid vanTRPM6tot expressie brengende cellen naar renine-afscheidende cellen. Renine wordt tot expressie gebracht in en uitgescheiden door JG-cellen in de nier17,18. JG-cellen staan ​​in direct contact met de macula densa, die zich naast de DCT bevindt en de renine-uitscheiding door JG-cellen stimuleert als reactie op de verlaging van de Cl-niveaus in de urine18. Immunofluorescentiekleuring voor renine en neuronaal stikstofmonoxidesynthase (nNOS), een macula densa-marker, vertoonde geen afwijkingen in het patroon of de intensiteit van positieve signalen waargenomen nabij de glomeruli inTrpm6f/; Zes2-Cre muizen. Daarom lijken cellen die direct betrokken zijn bij de secretie van renine en de regulatie ervan niet duidelijk beïnvloed te worden doorTrpm6tekort. Net zoTRPM6wordt mede tot expressie gebracht met NCC in de DCT, onderzochten we vervolgens de ruimtelijke relatie tussenTRPM6/NCC tot expressie brengende cellen (DCT) en de macula densa- of JG-cellen. Confocale beelden van sagittale DCT-coupes toonden bijna een volledige overlap vanTRPM6en NCC-signalen door de hele DCT. We kleurden vervolgens voor nNOS en NCC en ontdekten dat de gebieden die positief zijn voor nNOS en NCC verbonden zijn, zonder enige signaaloverlap. Bovendien dubbele kleuring voor renine enTRPM6/NCC onthulde dat sommigeTRPM6/NCC tot expressie brengende cellen bevinden zich in de buurt van renine tot expressie brengende JG-cellen, wat suggereert dat:TRPM6/NCC tot expressie brengende cellen, evenals de macula densa, kunnen een significante invloed hebben op de secretie van renine.

Verminderde renine-secretie doorTrpm6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)tekort. Over het algemeen speelt het autonome zenuwstelsel een cruciale rol bij het orkestreren van de voortgang van het circadiane ritme. Aangenomen wordt dat de secretie van renine uit JG-cellen tijdens de actieve periode wordt gestimuleerd door noradrenaline dat wordt uitgescheiden door renale sympathische neuronen32. Om het effect van een dergelijke stimulatie op de secretie van renine direct te onderzoeken, hebben we nierschijfjes gemaakt en deze gestimuleerd met isoproterenol, een -adrenoreceptor (AR) -agonist. De resultaten toonden een zeer duidelijke afname van het renine-positieve signaal dat in het plakje achterbleef na isoproterenol-stimulatie gedurende 30 minuten. Kwantitatieve analyses toonden aan dat het percentage glomeruli omgeven door een renine-positief signaal afnam van ongeveer 80 procent tot 30 procent na stimulatie met isoproterenol, wat wijst op het optreden van massale renine-uitscheiding. We hebben echter geen significant effect waargenomen van isoproterenol-stimulatie op het reninesignaal in nierschijfjes vanTrpm6/1; Zes2-Cre-muizen. Om het resultaat te bevestigen, hebben we ook de bloedrenine-activiteit gemeten na toediening van isoproterenol. De resultaten laten zien dat een significante verhoging van de renine-activiteit in het bloed alleen werd waargenomen bij controlemuizen, terwijl de toename van de hartslag vaak werd waargenomen bij beide stammen. Deze resultaten impliceren dat renine-afscheidende JG-cellen niet kunnen reageren op stimulatie van sympathische nierneuronen, wat consistent is met het verdwijnen van de circadiane toename vanbloeddruken renine-activiteit inTrpm6l/fl; Zes2-Cre muizen.

JG-cellen kunnen ook worden gestimuleerd om renine uit te scheiden als reactie op prostaglandinen, waarvan prostaglandine E2(PGE2) als het meest significant wordt beschouwd, omdat het fysiologisch wordt uitgescheiden door macula densa-cellen wanneer de Cl-niveaus in de urine afnemen17,18. Bovendien is het ook bekend dat PGE, de behandeling van nierplakken, de reninesecretie efficiënt kan stimuleren33. Stimulatie van JG-cellen met PGE2 en isoproterenol activeert gewoonlijk cAMP-productie, wat uiteindelijk renine-uitscheiding veroorzaakt. Daarom hebben we ook het effect van PGE getest, en het membraan-permeabele cAMP-analoog, dibutylyl-cAMP(db-cAMP). PGE2 en db-cAMP stimuleerden met succes de renine-secretie in nierschijfjes van Trpmdi/A, Six2- Cre-muizen en controlemuizen. Dit geeft aan datTrpm6 deficiëntie heft niet de algemene machinerie op die betrokken is bij het detecteren van externe signalen, het doorgeven van intracellulaire signalen en het uitvoeren van renine-secretie, maar het heeft specifiek invloed op de respons op -AR.

Verminderde -AR-expressie in JG-cellen metTrpm6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)tekort. Verminderde -AR-receptorresponsineTrpm6l/l; Zes2-Cre-muizen brachten ons ertoe de status van de -AR-receptorexpressie te onderzoeken, en dus voerden we immunofluorescentie uit van 1-AR, het belangrijkste -AR-subtype dat tot expressie wordt gebracht in JG-cellen34. Zoals eerder gemeld34, vonden we het bandachtige kleurpatroon in niercoupes van zowel controle- als Trpmdi/l, Six2-Cre-muizen. Het is bekend dat 1-AR sterk tot expressie wordt gebracht in zowel bloedvaten als JG-cellen34, en consequent waren de 1-AR-positieve cellen aan het einde van de bandachtige kleuring in controlemuizennier ook positief voor reninekleuring (weergegeven met een pijlpunt). Daarentegen is de kleuring van Trpm6l/fl; Zes2-Cre-muisnieren vertoonden een kleiner aantal 1-AR/renine dubbel-positieve cellen, wat suggereert dat 1-AR-expressie was verlaagd in JG-cellen. Om deze bevinding te bevestigen, hebben we JG-cellen geïsoleerd met behulp van de Percoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode volgens het vorige rapport . Immunoblotting-analyses onthulden dat renine-positieve JG-cellen verrijkt zijn in de band 3-fractie, wat consistent is met hun rapport35, en 1-AR-expressie in deze band 3-fractie was specifiek veel lager in Trpmdi/1; Zes2-Cre muizen. Samen vonden we datTrpm6deficiëntie verlaagt het expressieniveau van 1-AR in JG-cellen, wat consistent is met de verminderde reninesecretie.

Het effect van de kunstmatige interventie op circadianebloeddrukvariatie. In de laatste reeks experimenten hebben we het effect van verschillende interventies op circadiane . getestbloeddrukvariatie. Om het belang van renine te bevestigen, hebben we een klinisch beschikbare renineremmer aliskiren36 toegediend aan wildtype muizen. Graag willenTrpm6ablatie, toediening van aliskiren door operatieve implantatie van een osmotische minipomp onderdrukte significant de circadianebloeddrukvariatie. Vervolgens voerden we renale denervatie-operaties uit, aangezien de activering van -AR op JG-cellen via het sympathische zenuwstelsel de belangrijkste route is voor het stimuleren van de secretie van renine op een circadiane manier . Nogmaals, we ontdekten dat de interventie de onderdruktebloeddrukvariatie. Deze resultaten zijn in overeenstemming met ons model dat defecten in -AR-respons en renine-secretie verantwoordelijk zijn voor het verlies vanbloeddrukvariatie in Trpmdl/l; Zes2-Cre muizen.

We hebben ook het effect getest van het verhogen van het magnesiumgehalte in de voeding. Voor dit doel kregen wildtype muizen gedurende 1 maand een Mg-rijk dieet met 0,6 procent (normaal dieet:0,3 procent magnesium). Zoals verwacht vertoonden die muizen verhoogde Mg-waarden in het bloed. Vervolgens hebben we het expressieniveau van gecontroleerdTRPM6bij DCT; het nam drastisch af door een hoog-Mg-dieet te voeren, en de mate van verminderdeTRPM6expressie was groter dan renale Cnnm2-ablatie. Toen we debloeddrukbij deze muizen ontdekten we dat muizen die een hoog-Mg-dieet kregen, significant kleiner warenbloeddrukvariatie danTrpm6-deficiënte muizen, wat consistent is met ons idee dat nier-TRPM6is belangrijk voor circadianebloeddrukvariatie.

Tabel 1 Genen die omhoog of omlaag werden gereguleerd in de nieren van Cnnm2flfl/flfl; Zes2-Cre-muizen.

Discussie

In dit onderzoek hebben we het belang aangetoond vanTRPM6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)in de regulering vanbloeddruk. In het bijzonder laten we een bijna volledige verdwijning zien van de circadiane variatie vanbloeddrukin nier-specifiekTrpm6-deficiënte muizen. We ontdekten ook dat de secretie van renine, een belangrijk hormoon dat de bloeddruk orkestreert, ernstig werd afgeschaftTrpm6-deficiënte muizen, wat consistent is met de waargenomenbloeddrukfenotype. Verschillende rapporten hebben aangetoond dat TRPM7, een ander Mg2 plus -permeabel kanaal dat sterk lijkt opTRPM6, beïnvloedt ook de bloeddruk37,38. TRPM7 voorkomt de toename vanbloeddrukna toediening van angiotensine II door de respons van vasculaire endotheelcellen op angiotensine II te onderdrukken. Integendeel, onlangs werd gemeld dat TRPM7 ook de verhoging vanbloeddrukna toediening van leptine door Mg2 plus influx in de carotislichaamscellen te bemiddelen . Dus de rol van TRPM7 inbloeddrukregelgeving is dubbelzinnig. Aangezien het expressieniveau van TRPM7 in de nier echter niet werd beïnvloed doorTrpm6ablatie (aanvullende figuur 5), lijkt het erop dat TRPM7 niet direct betrokken is bij de fenotypen die in deze studie zijn waargenomen.

Zoals waargenomen bij Cnnm2-deficiënte muizen,bloeddrukwaarden werden verlaagd inTrpm6-deficiënte muizen (Fig. 2)14. Er moet echter worden opgemerkt dat er een duidelijk verschil was tussen deze muizen. Cnnm2-verstoring over het algemeen verminderdbloeddruk, maar circadiane variatie was nog steeds duidelijk waarneembaar. Daarentegen verdween deze variatie inTrpm6-deficiënte muizen. Een dergelijk kwalitatief verschil is ook consistent met onze waarneming dat de circadiane variatie van renine werd behouden in Cnnm 2-deficiënte muizen (aanvullende figuur 9). Opgemerkt moet worden dat zowel CNNM2 alsTRPM6Er wordt gedacht dat ze belangrijk zijn voor renale Mg2 plus reabsorptie door het vectoriële Mg2 plus transport door de DCT te mediëren, en inderdaad vertoonden muizen met een tekort aan beide genen identiek renaal Mg2 plus-verspillend fenotype (Fig. 1 en ref. 39). Het kwalitatieve verschil vanbloeddrukfenotype tussen Cnnm2-enTrpm6-deficiënte muizen suggereren dat Mg2 plus transport in de DCT, de gemeenschappelijke functie van de twee moleculen, niet direct betrokken is bij de circadiane variatie vanbloeddruken renine-secretie, wat suggereert dat de CNNM2-onafhankelijke rol vanTRPM6ligt ten grondslag aan deze intrigerende fenotypes.

Verschillende mechanismen werken om de renine-secretie van JG-cellen te stimuleren om te behoudenbloeddruk. Onder hen wordt de input van renale sympathische neuronen beschouwd als de belangrijkste rol bij het vergroten vanbloeddruktijdens de actieve periode van circadiane variatie32. Deze neuronen scheiden noradrenaline uit, dat bindt aan en activeert -AR op JG-cellen om cAMP-productie te stimuleren, wat uiteindelijk leidt tot renine-uitscheiding1732. In onze experimenten met behulp van schijfjes nier verkregen uitTrpm6-deficiënte muizen vertoonden stimulatie met isoproterenol, een -AR-agonist, geen effect op de renine-secretie, terwijl stimulatie met PGE2 of db-cAMP de renine-secretie efficiënt verhoogde (Fig. 4). PGE2 wordt uitgescheiden door de macula densa als reactie op lage niveaus van Cl- in de urine en het activeert EP2- en EP4-receptoren op JG-cellen, die, net als -AR-activering, uiteindelijk de cAMP-productie stimuleert40. Daarom impliceren deze resultaten dat -AR-signalering selectief wordt opgeheven in JG-cellen vanTrpm6-deficiënte muizen, zonder de stroomafwaartse cAMP-gemedieerde signaalroute te beïnvloeden. Consequent onthulden immunofluorescentie van niersecties van muizen en immunoblotting van geïsoleerde JG-cellen dat -AR-expressie significant was verminderd in de JG-cellen vanTrpm6-deficiënte muizen (Fig. 5). Een dergelijke verminderde -AR-expressie zou ervoor moeten zorgen dat JG-cellen geen renine kunnen afscheiden als reactie op sympathische zenuwstimulatie tijdens de actieve periode, waardoor de circadiane variatie van het reninegehalte in het bloed wordt geëlimineerd enbloeddruk. Opgemerkt moet worden dat er een onderzoek is met 1/ 2-AR-knockout-muizen, die een verminderde circadiane aantoondenbloeddrukvariatie alsTrpm6-deficiënte muizen41. Ze schreven het toe aan de verminderde locomotorische activiteit, maar het blijft mogelijk dat verminderde circadiane variatie van renine-activiteit bijdraagt ​​aan verminderde circadiane variatie vanbloeddruke. Als alternatief kan de ongebruikelijke achtergrond van hun muizen (gemengde achtergrond van C57BL6/J, 129 en VFB; we gebruikten pure C57BL6/achtergrond) het effect van -AR opbloeddrukvariatie; genetische achtergronden zijn van cruciaal belang voor circadianebloeddrukvariatie42.

cistanche bodybuilding

Hoe het verlies vanTRPM6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)in DCT-cellen leidt tot de verminderde -AR-expressie in JG-cellen is ongrijpbaar gebleven. Experimenten met andere celtypes hebben aangetoond dat -AR-expressie wordt gereguleerd door verschillende moleculen waarvan bekend is dat ze intercellulaire signalering mediëren: Toevoeging van glucocorticoïden aan het kweekmedium van van zaadleider afgeleide cellijn DDT1 MF-2 verhoogt -AR-expressie43. Ook werd gemeld dat stikstofmonoxide (NO) -AR-afbraak in hartcellen onderdrukte door S-nitrosylering van GRK24. Van deze moleculen is het opmerkelijk dat NO wordt uitgescheiden door macula densa-cellen in de nieren, waardoor JG-cellen op een paracriene manier worden gestimuleerd om de renine-uitscheiding te verhogen . Hoewel de expressie van nNOS, het NO-producerende enzym in de nier, beperkt is tot macula densa-cellen, staan ​​ze in direct contact met DCT-cellen, het volgende segment van de niertubule6. Het is dus mogelijk datTrpm6-deficiëntie in DCT-cellen leidt tot de verminderde -AR-expressie in JG-cellen door de productie of afgifte van NO uit de aangrenzende macula densa-cellen te beïnvloeden.

Het is bekend dat JG-cellen ook communiceren met andere cellen door spleetovergangen te vormen met omringende cellen, zoals mesangiale cellen, en Ca2 plus ontvangen om de renine-uitscheiding te onderdrukken7. Hoewel JG-cellen en DCT-cellen geen direct contact met elkaar hebben, zijn ze nog steeds dicht bij elkaar gelokaliseerd (ref. 46 en Fig. 3) en het is mogelijk dat deze cellen gap junctionele communicatie gebruiken via tussenliggende cellen, zoals mesangiale cellen; alle drie celtypen brengen naar verluidt Cx3747,48 tot expressie, een connexine-isovorm die oligomeriseert en gap junctions vormt. Verdere analyse kan het molecuul en de route identificeren die verantwoordelijk is voor de intercellulaire signalering tussen DCT- en JG-cellen, wat belangrijk is om het algemene mechanisme van verstoorde circadianebloeddrukvariatie doorTrpm6-tekort.

InTrpm6-deficiënte muizen, de circadiane variatie van de bloedspiegels van niet alleen renine maar ook noradrenaline verdween. Activering van het renine-angiotensinesysteem stimuleert de afgifte van noradrenaline in de bloedbaan29,30, en daarom lijkt het redelijk dat het effect vanTrpm6 (voorbijgaande receptorpotentieel melastatine-gerelateerd 6)ablatie van de renine- en noradrenalinespiegels in het bloed was vergelijkbaar. Aangezien noradrenaline ook inwerkt op de -AR van JG-cellen om de secretie van renine te bevorderen, wordt aangenomen dat de twee moleculen een positieve feedbacklus vormen, waardoor elkaars secretie wordt gestimuleerd. Er moet echter worden opgemerkt dat de resultaten van experimenten met isoproterenoltoediening expliciet het defect in renine-uitscheiding laten zien (Fig. 4), en dus lijkt het de primaire oorzaak te zijn van het verlies van de circadiane variatie van zowel renine als noradrenaline.

Tot dusver is een verscheidenheid aan effectieve geneesmiddelen ontwikkeld en gebruikt om hypertensieve patiënten te behandelen. Een aanzienlijk aantal patiënten vertoont echter resistentie tegen de conventionele behandelingen die een combinatie van belangrijke antihypertensiva met verschillende functionele mechanismen gebruiken4. Chirurgische denervatie van renale sympathische neuronen met behulp van endovasculaire katheters is op proefbasis uitgevoerd om dergelijke resistente hypertensie te behandelen50. De praktische effectiviteit bij het verbeterenbloeddrukcontrole was controversieel51,52, maar recent gepubliceerde onderzoeken hebben een significante vermindering vanbloeddrukvergeleken met schijncontroles53,54. Er zijn ook gemengde resultaten over het effect van renale denervatie op de circadiane variatie vanbloeddruk. Sommige rapporten toonden aan dat de omvang vanbloeddrukafname door renale denervatie was groter tijdens de actieve perioden53, maar anderen rapporteerden geen verandering in circadiane variatie vanbloeddruk55,56. In de analyse met proefdieren onderdrukten onze nierdenervatie-operaties tegen muizen de circadiane variatie vanbloeddruk(Afb.6). Vergelijkbare operaties werden ook uitgevoerd tegen ratten, maar zelfs controle wildtype ratten vertonen bijna geen circadianebloeddrukvariatie in de eerste plaats57,58, waardoor het moeilijk is om het effect van de operatie te evalueren. Er zijn meer studies nodig om de impact van renale denervatie op de circadiane duidelijk te makenbloeddrukvariatie, wat ons ook zou helpen om het meer gedetailleerde mechanisme vanbloeddrukontregeling doorTrpm6-tekort.

Telemetrische metingen vanbloeddruk, hartslag en bewegingsactiviteit. Telemetrische metingen vanbloeddrukwerden als volgt uitgevoerd4.Bloeddruktransducers (TAl1PA-C10, Data Sciences International) werden onder narcose operatief ingebracht in de linker arteria carotis van 2- tot 3-maanden oude muizen (door intraperitoneale toediening van 0,3 mg/ kg medetomidine, 4 mg/kg midazolam en 5 mg/kg butorfanol). Na 3 weken herstel, systolisch en diastolischbloeddrukwaarden werden geregistreerd met een geplande bemonstering van 2-min elke 60 minuten met behulp van Dataquest ART-software (Data Sciences International). Er werden gedurende ten minste vijf opeenvolgende dagen records verkregen en de gemiddelden van metingen die elke dag op hetzelfde tijdstip werden genomen, werden voor elke muis bepaald en gebruikt voor verdere statistische analyses, behalve voor aanvullende figuur 4. Gebaseerd op Nakamori et al.68, nier denervatie werd 2 weken voor het inbrengen uitgevoerdbloeddrukomvormers als volgt. Nieren werden blootgelegd door abdominale incisie en bindweefsel rond de niervaten werd ontleed. Vervolgens werden de niervaten gedurende 2 minuten ondergedompeld in 95 procent ethanol en daarna gedurende 2 minuten in PBS. Sham-operatie werd uitgevoerd met behulp van de equivalente procedure zonder onderdompeling in ethanol. Aliskiren kreeg 25 mg/kg/dag toegediend door subcutaan een osmotische pomp (1004, ALZET) in te bouwen en de opname werd gestart vanaf de dag na de introductie van de pomp. Voor magnesiumsuppletie kregen muizen 1 maand voordien een magnesiumverrijkt dieet met 0,6 procent magnesium (CLEA Japan).bloeddrukmeting.

De hartslag werd gemeten met hetzelfde radiotelemetriesysteem, behalve dat de opname werd uitgevoerd met een geplande 30-s geplande bemonstering elke minuut, en een enkele meting werd gebruikt voor verdere analyse.

Locomotorische activiteiten werden beoordeeld met behulp van hetzelfde radiotelemetriesysteem, door de veranderingen in signaalsterkte van de transducer als gevolg van de voortbeweging van het dier te volgen. In dit geval werden transducers operatief ingebracht in de onderhuidse ruimte in de rechterflank. Opnames werden uitgevoerd met dezelfde tijdsintervallen als hierboven beschreven.

cistanche bodybuilding

Referenties

1. Giles, TDCircadisch ritme vanbloeddruken de relatie met cardiovasculaire gebeurtenissen.J. Hypertensie. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F. & Hermida, RC inBloeddrukMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT. (eds White, WB) Part II, Ch.6, 105-128(Springer, 2016).

3. Witteman, JCet al. Een prospectieve studie van voedingsfactoren en hypertensie bij Amerikaanse vrouwen. Oplage 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et al. Een prospectieve studie van voedingsfactoren en hypertensie bij Amerikaanse mannen. Oplage 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A. et al. Prospectieve studie van voedingsfactoren,bloeddruk, en hypertensie onder Amerikaanse vrouwen. Hypertensie 27,1065-1072(1996).

Opmerking:het bovenstaande is geen volledige referentielijst