De epigenetische regulator BRD4 is betrokken bij door cadmium veroorzaakte ontstekingsreactie in rattennier

voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

Cistanche tubulosa voorkomt nierziekte, klik hier voor deproducten en Cistanche DHT

ABSTRACT

Cadmium (Cd) is beschreven als een potentiële ontstekingsveroorzaker, terwijl toenemend bewijs aantoont dat ongepaste ontsteking een factor is die bijdraagt ​​aannierbeschadiging. Daarom is onderzoek naar door Cd veroorzaakte ontstekingsreacties van groot belang voor het ophelderen van het mechanisme van door Cd veroorzaakte nefrotoxiciteit. Bromodomein-bevattende 4(BRD4) is een belangrijke epigenetische regulator die betrokken is bij de ontwikkeling van veel ontstekingsziekten, maar zijn regulerende rol in door Cd veroorzaakteopruiendreactie moet nog worden opgehelderd. Hier vonden we dat behandeling met Cd bij Sprague-Dawley-ratten (2 mg/kg LG, ip, 5 opeenvolgende dagen) en bij rattenniercellijn (NRK{{0}}E, 0–10 M, 12 uur) induceerde de transcriptie van inflammatoire cytokines, die verminderd zou kunnen worden door JQ1 (BRD4-remmer, 25 mg/kg BW, ip , 3 opeenvolgende dagen in vivo; 0, 5 M, 12 uur in vitro) of BRD4 klein interfererend RNA (siRNA, in vitro), wat suggereert dat BRD4 deelneemt aan door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie. Vervolgens verduidelijkte onze studie de rol van BRD4 in door CD veroorzaakte ontstekingsreactie. De remming van BRD4 verminderde door Cd bevorderde nucleaire translocatie en activering van NF-KB in vivo en in vitro. Cd verhoogde het acetyleringsniveau van RelA K310 en verbeterde BRD4-binding aan geacetyleerd NF-KB RelA in vivo en in vitro, die werden opgeheven door remming van BRD4. Samenvattend suggereert onze studie dat BRD4 betrokken is bij Cd-getriggerde transcriptie van inflammatoire cytokines door de activering van de NF-KB-signaleringsroute te bemiddelen en de binding van zichzelf aan geacetyleerd NF-KB RelA bij ratten te verhogen.nier,daarom zou BRD4 een potentieel therapeutisch doelwit kunnen zijn voor door Cd veroorzaakte nierziekten.

trefwoorden: BRD4CadmiumNierontstekingcytokinen NF-KB JQ1

1. Inleiding

Cadmium (Cd) is een verontreinigende stof van zware metalen met een hoge toxiciteit en een lange halfwaardetijd. Met de ontwikkeling van de industriële productie heeft de toegenomen dreiging van Cd-vervuiling voor de veiligheid van het milieu en de menselijke gezondheid tot bezorgdheid geleid (Wang et al., 2020; Horiguchi en Oguma, 2016). Nadat het door het lichaam is opgenomen, veroorzaakt Cd schade aan meerdere organen en denieris het belangrijkste doelorgaan (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Eerder hebben we systematisch geverifieerd dat remming van autofagie, oxidatieve stress en apoptose synergetisch bijdragen aan door Cd veroorzaakte nefrotoxiciteit bij ratten (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Ontsteking is een fysiologische reactie die fungeert als een verdedigingsreactie tegen infectie of letsel, maar door Cd geïnduceerde ongecontroleerde en ongepaste ontstekingsreacties kunnen schade veroorzaken, zoals het beschadigen van normaal weefsel van omstanders en het bevorderen van auto-immuunziekten (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). Cd-getriggerde ontstekingsreactie verergerde hart- en vaatziekten en leverschade, wat suggereert dat ontsteking een belangrijke rol kan spelen bij Cd-gemedieerdenierpathologische processen (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetica verwijst naar erfelijke modificaties in genexpressie op basis van niet-DNA-sequentieveranderingen, en de omkeerbaarheid van deze modificaties maakt de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen mogelijk (Vendetti en Rudin, 2013). De familie van bromodomein en extraterminaal domein (BET) omvat bromodomein-bevattende 2 (BRD2), BRD3, BRD4 en bromodomein-testis-specifiek (BRDT), die wordt gekenmerkt door twee broomdomeinen en binding aan geacetyleerde lysines van histonen en niet-histon ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee en Bohmann, 2018). BET-eiwitten fungeren als de transcriptionele co-activator van veel genen en reguleren zo de celcyclus, ontstekingsreactie, oxidatieve stress en andere fysiologische processen in verschillende pathologische modellen (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 is een bijzonder goed bestudeerd lid van de BET-eiwitfamilie, en steeds meer onderzoeken hebben aangetoond dat het een nieuw epigenetisch doelwit is bij het reguleren van gevarieerdenierziekten, waaronder chronische nefritis, diabetische nefropathie en experimentele nierschade (Zeng en Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Van BRD4 is bevestigd dat het deelneemt aan het nucleaire factor-KB (NF-KB)-afhankelijke transcriptieproces om ontstekingsreacties bij veel ziekten te reguleren (Xu en Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 kan worden gerekruteerd door geacetyleerd RelA (NF-KB-subeenheid, een eiwitcoderend gen) op lysine 310 (RelA-K310ac) via zijn bromodomeinen, waardoor cycline-afhankelijk kinase 9 (CDK9) wordt geactiveerd en het RNA-polymerase II wordt gefosforyleerd om de transcriptie van NF-KB-doelgenen (Hajmirza et al., 2018). Recente studies suggereren dat BRD4-remmers een potentiële therapeutische optie kunnen zijn voor ontstekingsziekten. In modellen voor ruggenmergletsel bij ratten verzwakte remming van BRD4 de ontstekingsreactie en bevorderde het het functionele herstel van microglia (Dey et al., 2019). Remming van BRD4 heft ook experimentele nierontsteking op in muizenmodellen van unilaterale ureterale obstructie, antimembraan basale GN en infusie van angiotensine II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Gezien de mogelijke pro-inflammatoire effecten van Cd en de regulerende effecten van BRD4 op ontstekingen, veronderstelden we dat BRD4 betrokken is bij door Cd veroorzaakte ontstekingsreacties. Zoals verwacht medieert BRD4 het transcriptieproces van inflammatoire cytokines in aan Cd blootgestelde rattenniermodellen. Onze studie onthult een mogelijk mechanisme in de door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie en biedt nieuwe inzichten in de therapie van door Cd veroorzaakte nefrotoxiciteit.

2. materialen en methoden

2.1. Chemicaliën en antilichamen

Cadmiumchloride (CdCl2, watervrij, 439800) werd gekocht bij Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, VS). (plus)-JQ1 (HY-13030) werd verkregen van MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, VS). Een extractiekit voor nucleair eiwit werd gekocht bij Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027). Een efficiënte chemiluminescentiekit (ECL, 32209) en bicinchoninezuurproteïne-assayreagens (BCA, 23225) werden verkregen van Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, VS). Primaire antilichamen tegen de volgende eiwitten werden gebruikt: NF-KB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) werden gekocht bij Proteintech Group (Wuhan, China); -actine (3700 s), Histon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normaal konijn-IgG (IgG, 4394) werden gekocht bij Cell Signaling Technology (Danvers, MA, VS); BRD4 (ab128874), K (lysine) acetyltransferase 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-KB RelA (acetyl K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-geconjugeerde ezel-anti-konijn (ab150073) werden gekocht van Abcam (Cambridge, VK). Tweede antilichamen: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) en Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) werden gekocht bij Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, VS). ).

2.2. Dieren en experimenten

Vierentwintig Sprague-Dawley-ratten (mannelijk, 6 weken oud, 110-120 g) werden gekocht bij Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, China). De ratten kregen vrije toegang tot voedsel en water in een omgeving met gecontroleerde omgeving (24 ± 5 ​​graden, 12 uur licht/donker cyclus). De experimentele procedures waren van toepassing op de Richtlijn 2010/63/EU van de Raad van de Europese Gemeenschappen voor dierproeven, en alle procedures werden goedgekeurd door de Yangzhou University Animal Care and Use Committee. Na een week acclimatisatie werden de ratten willekeurig in vier groepen verdeeld: (1) Controlegroep: intraperitoneaal geïnjecteerd met het overeenkomstige oplosmiddel (fysiologische zoutoplossing of 2-hydroxypropyl- -cyclodextrine-oplossing). (2) Cd-groep: CdCl2 (2 mg/kg lichaamsgewicht, opgelost in fysiologische zoutoplossing) gedurende 5 opeenvolgende dagen intraperitoneaal geïnjecteerd om het Cd-intoxicatiemodel vast te stellen. (3) Cd plus JQ1-groep: CdCl2 (2 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal geïnjecteerd gedurende 5 opeenvolgende dagen om het Cd-intoxicatiemodel vast te stellen, en JQ1 (25 mg/kg lichaamsgewicht, opgelost in 2-hydroxypropyl{{ 25}}cyclodextrine-oplossing) intraperitoneaal geïnjecteerd op dag 6-8. (4) JQ1-groep: JQ1 (25 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal geïnjecteerd op dag 6-8. Statistieken van het Cd-gehalte in rattenserums en nierweefsels werden vermeld in tabel S1, wat de succesvolle oprichting van aan Cd blootgestelde rattenmodellen weerspiegelt.

Na 8 dagen behandeling werden de ratten gedood door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie na 12 uur vasten. De nierweefsels werden ontleed en 1 g weefsel van elke nier werd snel bewaard bij -80 ◦C voor de volgende Western-blot- en kwantitatieve PCR- (qPCR) -analyse. De resterende hoeveelheid weefsel werd snel gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde (PFA) voor immunohistochemische (IHC) kleuring.

2.3. Celkweek en behandeling

De rattenniercellijn (NRK{{0}}E) werd verkregen van de Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. NRK-52E-cellen werden gekweekt met Dulbecco's gemodificeerde Eagle's-medium (DMEM, Gibco, 12800-017) dat 5 procent foetaal runderserum (FBS, Gibco, 10437-028), penicilline en streptomycine bevat (1 00 E/mL) in een bevochtigde toestand van 5 procent CO2 en 95 procent lucht bij 37 graden. CdCl2 (opgelost in ultrazuiver water) en JQ1 (opgelost dimethylsulfoxide) werden afzonderlijk bewaard bij 4 graden en -20 graden en vóór gebruik verdund in werkoplossingen. Het experimentele ontwerp was als volgt: (1) Cellen werden behandeld met 0, 2,5, 5, 10 M Cd gedurende 12 uur, of 5 μM Cd gedurende 0, 6, 12, 24 uur om de daaropvolgende testen uit te voeren. (2) Cellen werden gedurende 12 uur behandeld met 5 M Cd en / of 0, 5 M JQ1 om de daaropvolgende tests uit te voeren. (3) Cellen werden getransfecteerd met siBRD4 en/of behandeld met 5 M Cd gedurende nog eens 12 uur om de volgende testen uit te voeren.

2.4. Kleine storende RNA-transfectie

We transfecteerden 20 nM BRD4 klein storend RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, VS) in de NRK -52E-cellen door Lipofectamine RNAiMAX-transfectiereagens (Thermo Fisher Scientific, Cat # 13778150) gedurende 24 uur volgens de producthandleidingen. De volgende sense siRNA's werden gebruikt:

siBRD4, met een doelsequentie van 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA-negatieve controle), met een doelsequentie van 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Nierweefselmonsters en NRK-52E-cellen werden gelyseerd in RIPA-buffer die proteaseremmers bevatte om het totale eiwit te extraheren. Het kerneiwit werd van tevoren uit verse weefsels en cellen bereid en bij 80 graden bewaard. Eiwitmonsters (20-30 ug per monster) werden gescheiden door SDS-PAGE-elektroforese en vervolgens overgebracht naar de polyvinylideenfluoridemembranen (Millipore, ISEQ00010). De membranen werden gedurende 90 minuten geblokkeerd met 5% magere melk en 12 uur bij 4 graden geïncubeerd met de volgende primaire antilichamen: -actine (1:5000), NF-KB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Vervolgens werden de membranen gewassen met TBST en 90 min bij kamertemperatuur (RT) geïncubeerd met overeenkomstige secundaire antilichamen (1:10000). De membranen werden geïncubeerd met elektrochemiluminescentie (ECL, ThermoFisher Scientific) en bepaald op de Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Frankrijk), en de optische dichtheid werd geanalyseerd met behulp van ImageJ (NIH, Bethesda, MD, VS).

2.6. Immunofluorescentie (IF) kleuring

NRK{{0}}E-cellen gezaaid in een 24-wells-plaat werden gekweekt tot ongeveer 60 procent confluentie. De cellen werden behandeld met 5 M Cd en/of 0,5 M JQ1 gedurende 12 uur, daarna gefixeerd met PFA (4 procent, 10 min), gepermeabiliseerd met Triton X- 100 (0,1 procent, 15 min), geblokkeerd met BSA (2 procent, 90 min) bij kamertemperatuur, en overnacht geïncubeerd met primair antilichaam (NF-KB p65, 1:50 verdunning) bij 4 graden. Na drie keer gewassen te zijn met PBS, werden de cellen 90 min geïncubeerd met secundair antilichaam (1:500 verdunning) en met DAPI gedurende 5 min bij kamertemperatuur, waarna de cellen werden waargenomen onder een confocale microscoop. NF-KB nucleaire translocatie werd geanalyseerd in drie onafhankelijke onderzoeken.

2.7. qPCR

Het totale RNA van nierweefsel en NRK-52E-cellen werd geëxtraheerd met RNAiso Plus-kit (Takara Bio, Shiga, Japan). 1 ug totaal RNA werd gebruikt om cDNA van de eerste keten te synthetiseren volgens de handleiding van de fabrikant (Roche, Basel, Zwitserland). 2 L complementair DNA (cDNA) per putje werd genomen om de relatieve mRNA-niveaus te detecteren met behulp van een LightCycler® 96 Real-Time PCR-systeem (Roche). Bereken de relatieve mRNA-niveaus volgens vergelijking 2-△△CT. De primers werden vermeld in Tabel S2. -actine was een rattenreferentiegen.

2.8. Co-immunoprecipitatie (Co-IP)

De nierweefsels en NRK-52E-cellen werden gelyseerd in vers bereide cellysisbuffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 procent Triton X{{8} }) die PMSF bevat. Proteïne G-korrels (100 L per monster, Bio-Rad, Hercules, CA, VS) werden gemengd met 2 ug BRD4, RelA-K310ac of IgG-antilichaam per monster en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geroteerd. Vervolgens werden de totale eiwitlysaten een nacht bij 4 graden geïncubeerd met kralen-antilichaamcomplex. Na drie keer te zijn gewassen met cellysisbuffer, werden de immunoprecipitaten opnieuw gesuspendeerd met 1 x SDS PAGE-monsterbuffer om de monsters te configureren. De doeleiwitten werden gedetecteerd met behulp van western blotting met primaire antilichamen tegen BRD4 en anti-RelA K310ac.

2.9. statistische analyse

Alle gegevens werden verkregen uit ten minste drie onafhankelijke experimenten en uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM, tenzij anders vermeld. Experimentele groepen werden vergeleken door ongepaarde tweezijdige Student's t-test of eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met behulp van SPSS 22. 0 (SPSS Inc., Chicago, IL, VS). De significantie werd vastgesteld op p <>

3. Resultaten

3.1. Cd induceert de expressie van inflammatoire cytokinen in vivo en in vitro

Als milieuverontreinigende stof is bewezen dat Cd nierschade veroorzaakt door een reeks biologische processen te reguleren (Wang et al., 2019c). In deze studie werden de veranderingen in de transcriptieniveaus van inflammatoire cytokines onderzocht na blootstelling aan Cd om te onderzoeken of ontsteking een rol speelt bij Cd-geïnduceerde nefrotoxiciteit. Gegevens toonden aan dat blootstelling aan Cd de interleukine (IL)-1 en tumornecrosefactor (TNF)-eiwitniveaus significant verhoogde in NRK-52E-cellen (Fig. 1A-B) en rattennierweefsels (Fig. 1C). -D). Ondertussen, zoals getoond in Fig. 1E-F, verhoogde blootstelling aan Cd de transcriptionele niveaus van inflammatoire cytokines (IL-1, IL-6, TNF- en (Monocyt chemoattractant eiwit-1) MCP -1) in vivo en in vitro. Deze bevindingen suggereren dat Cd de expressie van inflammatoire cytokinen in rattennieren induceert.

3.2. BRD4 neemt deel aan het door Cd geïnduceerde transcriptieproces van inflammatoire cytokines

BRD4 is een nieuw beschreven epigenetische regulator die bindt aan geacetyleerde histonen of niet-histonen om ontstekingsprocessen bij veel ziekten te reguleren. Hier werden BRD4-remmer JQ1 en BRD4-siRNA gebruikt om de rol van BRD4 op door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie te onderzoeken. Gegevens toonden aan dat Cd-verhoogde IL -1- en TNF-eiwitniveaus neerwaarts werden gereguleerd door JQ1-behandeling in vivo en in vitro (Fig. 2A-D) en door BRD4-knockdown in vitro (Fig. S1A-B). Ondertussen remde JQ1-behandeling significant de Cd-versterkte transcriptieniveaus van IL-1, IL-6, TNF- en MCP-1 in NRK-52E-cellen (Fig. 2E) en rattennierweefsels (Fig. 2F). Ook verminderde BRD4-knockdown significant de Cd-verhoogde transcriptieniveaus van inflammatoire cytokinen in NRK -52 E-cellen (Fig. S1C). Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat BRD4 een kritische regulator is van door Cd veroorzaakte ontstekingsreacties in rattennieren.

3.3. BRD4-expressieniveaus blijven ongewijzigd na blootstelling aan Cd

Vervolgens werden veranderingen in de expressieniveaus van BRD4 gedetecteerd na blootstelling aan Cd. NRK-52E-cellen werden behandeld met Cd onder een concentratiegradiënt en ratten werden gedurende 5 dagen intraperitoneaal met Cd geïnjecteerd om het effect van Cd op BRD4-expressie in de nier in vivo en in vitro op te helderen. De resultaten toonden aan dat de BRD4-eiwitniveaus ongewijzigd waren in zowel de aan Cd blootgestelde NRK-52E-cellen (Fig. 3A-B) en rattennierweefsels (Fig. 3C-D). Ook waren de BRD4-mRNA-niveaus onveranderd na blootstelling aan Cd (Fig. 3E-F). Deze resultaten geven aan dat BRD4 de door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie medieert, niet afhangt van veranderingen in het expressieniveau.

3.4. BRD4 reguleert Cd-gepromote NF-KB nucleaire translocatie

De rol van BRD4 in door Cd veroorzaakte ontstekingsreacties werd onderzocht in onze studie. Verandering van de NF-KB-signaleringsroute is nauw verwant aan de transcriptie van inflammatoire cytokinen (Chi et al., 2021). Onze studie wees uit dat BRD4 betrokken is bij Cd-gereguleerde nucleaire translocatie en activering van NF-KB. Eerst werd de subcellulaire lokalisatie van NF-KB bepaald door IF-kleuring en IHC-kleuring. Gegevens in Fig. 4A en D toonden aan dat JQ1 door Cd bevorderde NF-KB-nucleaire translocatie in NRK-52E-cellen en nierweefsels van ratten remt. Ondertussen toonden Western-blot-resultaten aan dat JQ1 de Cd-verhoogde nucleaire eiwitniveaus van NF-KB in vivo (Fig. 4B-C) en in vitro (Fig. 4E-F) significant verlaagde. Evenzo remde BRD4-knockdown significant de door Cd bevorderde NF-KB-nucleaire translocatie (Fig. S2A) en verlaagde de Cd-verhoogde nucleaire eiwitniveaus van NF-KB (Fig. S2B-C) in NRK -52 E-cellen. Alles bij elkaar genomen kan remming van BRD4 de door Cd bevorderde nucleaire translocatie van NF-KB verminderen, wat suggereert dat BRD4 de activering van de NF-KB-signaleringsroute in de nier na blootstelling aan Cd medieert.

3.5. Cd verhoogt RelA K310 acetylering niveaus

Studies hebben bevestigd dat BRD4 bindt aan geacetyleerd RelA K310 via zijn broomdomeinen om NF-KB-afhankelijke transcriptie te reguleren (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Zo werden het acetyleringsniveau van RelA K310 en de expressie van twee enzymen gedetecteerd. Gegevens toonden aan dat de eiwitniveaus van RelA-K310ac en acetylase Ep300 continu werden verlaagd met de verhoogde concentratie van Cd, terwijl het niveau van het deacetylase Sirt1-eiwit geleidelijk toenam in NRK-52E-cellen (Fig. 5A-B) en nierweefsels van ratten (Fig. 5C-D). Ook vertoonden Ep300- en Sirt1-mRNA-niveaus dezelfde trends (Fig. 5E-F). Deze resultaten suggereren dat Cd het acetyleringsniveau van RelA K310 bevordert, dus BRD4 kan betrokken zijn bij door Cd veroorzaakte transcriptie van inflammatoire cytokinen in de nier.

3.6. Cd verhoogt BRD4-binding aan RelA-K310ac om de transcriptionele functie te verbeteren

Binding aan acetyleringsplaatsen is de basis voor de transcriptionele regulatie van BRD4 (Huang et al., 2009). Om te verifiëren of Cd de BRD4-functie reguleert door de BRD4-binding aan RelA-K310ac te verhogen, werd de interactie tussen RelA-K310ac en BRD4 gedetecteerd via Co-IP. Gegevens in Fig. 6A toonden aan dat Cd de interactie tussen RelA-K310ac en BRD4 in NRK-52E-cellen significant verhoogde, wat werd verlicht door JQ1-behandeling of BRD4-knockdown. Ook werd dezelfde trend waargenomen in nierweefsels van ratten (Fig. 6B). Deze resultaten tonen aan dat Cd de binding van BRD4 aan RelA-K310ac verbetert, wat NF-KB-afhankelijke transcriptie bevordert en vervolgens bijdraagt ​​aan de door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie.

4. Discussie

Cd is gemeld als een mogelijke trigger van ontsteking vanwege de hoge toxiciteit, terwijl het exacte mechanisme nog steeds niet volledig wordt begrepen (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Onze studie bevestigde dat Cd de expressie van inflammatoire cytokines induceert in niercellen van ratten, en ontdekte dat BRD4, een epigenetisch doelwit dat kritieke functies heeft in een reeks cellulaire processen, waaronder ontsteking, bijdraagt ​​aan de door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie. Verdere experimenten gaven aan dat BRD4 betrokken is bij door Cd bevorderde activering van de NF-KB-signaleringsroute. Ook verhoogde Cd het acetyleringsniveau van RelA K310, waardoor BRD4-binding aan geacetyleerd NF-KB RelA toenam om NF-KB-afhankelijke inflammatoire cytokinentranscriptie te bevorderen.

Ontsteking is een van de natuurlijke afweermechanismen tegen exogene chemicaliën, terwijl de ongecontroleerde en ongepaste ontstekingsreactie normale weefsels kan beschadigen en auto-immuunziekten kan veroorzaken (Jian et al., 2018). Cd-verhoogde biologische markers van ontsteking werden vaak geassocieerd met verschillende ziekten. Studies hebben aangetoond dat Cd-geïnduceerde ontsteking betrokken is bij atherogenese (Tinkov et al., 2018). Bovendien bevorderde Cd de expressie van inflammatoire cytokines, die bijdroegen aan long- en testisweefselbeschadiging en hepatotoxiciteit induceren (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Deze schadelijke effecten komen overeen met onze resultaten, dat de ontstekingsreactie betrokken is bij door Cd veroorzaakte nierbeschadiging. Toenemende onderzoeken hebben zich gericht op de mechanismen van optreden van door CD veroorzaakte ontsteking. Als een goed bestudeerd lid van de BET-eiwitfamilie speelt BRD4 een cruciale rol in veel biologische processen, waaronder ontstekingen. Hier werden JQ1 (een remmer van BRD4) en siRNA gebruikt om de functionele activiteit van BRD4 te dereguleren en ontdekten dat de remming van BRD4 de Cd-geïnduceerde transcriptie van inflammatoire cytokinen in rattennieren verminderde, wat suggereert dat BRD4 deelneemt aan de door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie . Algemeen wordt aangenomen dat de ontregeling van BRD4-expressie een cruciale gebeurtenis is bij het optreden van een ontstekingsreactie. Bij ruggenmergletsel, pathologische cardiale hypertrofie en andere met ontstekingen geassocieerde ziekten, droeg de verstoorde BRD4-expressie bij aan de expressie van inflammatoire cytokines (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Cd had echter geen effect op de expressieniveaus van BRD4 onder de huidige experimentele omstandigheden, wat ons ertoe bracht te overwegen of BRD4 de door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie via andere routes medieert.

NF-KB is een belangrijke regulerende factor bij ontstekingsprocessen en is verantwoordelijk voor het beheersen van de expressie van veel ontstekingsmediatoren (Lawrence, 2009). Studies zijn gemeld dat BRD4 betrokken is bij de regulatie van de NF-KB-signaleringsroute. Huang et al. (2017) suggereerde dat BRD4 IKK-gemedieerde NF-KB-activering reguleerde via de p38- en JNK-MAPK-routes. Wang et al. (2019a) ontdekten dat BRD4-knockdown of JQ1-behandeling de door lipopolysaccharide (LPS) geactiveerde NF-KB-signaleringsroute in microglia blokkeerde. Meng et al. (2014) toonden aan dat JQ1-behandeling de expressie van de inflammatoire cytokinen blokkeerde door de activering van NF-KB in met LPS behandelde RAW 264.7-cellen te remmen. Deze rapporten gaven aan dat BRD4 de activering van NF-KB in veel ontstekingsmodellen medieert, terwijl het remmen van BRD4 een effectieve therapeutische benadering van ontstekingsremmende middelen is. In de huidige studie blokkeerde de remming van BRD4 de nucleaire translocatie van NF-KB in aan Cd blootgestelde nierweefsels van ratten en NRK-52E-cellen, wat suggereert dat BRD4 de door Cd geactiveerde NF-KB-signaleringsroute medieert.

Nadat NF-KB door verschillende stimuli was geactiveerd en zich naar de kern verplaatst, bindt BRD4 zich typisch aan geacetyleerd NF-KB RelA op de K310-plaats, wat de stabiliteit en transcriptionele activiteit in de kern verhoogt (Hajmirza et al., 2018). Het acetyleringsniveau van RelA K310 beïnvloedt dus de regulerende functie van BRD4 op de ontstekingsreactie. In hippocampale neuronen medieerde de deacetylase Sirt1 RelA K310-deacetylering om BACE1-expressie te reguleren, wat bijdroeg aan de productie van neuronaal amyloïde (Flores-Leon et al., 2019). In glioblastoomcellen reguleerde fotodynamische therapiestress het deacetylase Sirt1 naar beneden en activeerde het acetylase Ep300, wat de RelA-K310ac-spiegels verhoogde en leidde tot een verhoogde productie van het pro-overlevingsstikstofmonoxide (Fahey et al., 2019). Uit onze studie bleek dat Cd het acetyleringsniveau van RelA K310 bevordert door de Ep300-expressie te verhogen en de Sirt1-expressie te verminderen, wat aangeeft dat Cd de regulerende functie BRD4 beïnvloedt door de acetyleringsniveaus van RelA K310 te verhogen.

Onze resultaten toonden met name aan dat JQ1-behandeling effectiever was dan BRD4-knockdown bij het verlichten van door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie. JQ1 heeft een hoge bindingsaffiniteit met BRD4 en kan BRD4-binding aan het chromosoom bijna volledig blokkeren, terwijl siBRD4 alleen kan interfereren met BRD4-eiwitexpressie om BRD4-binding aan de doelplaats te verminderen, wat suggereert dat BRD4 door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie medieert. binding met geacetyleerd NF-KB RelA. Recente studies hebben een vergelijkbaar regulerend mechanisme aangetoond: na nucleaire translocatie en activering van NF-KB interageerde BRD4 vervolgens met geacetyleerd RelA om de transcriptionele activering van NF-KB te coactiveren (Huang et al., 2009). RelA-BRD4 werd gerekruteerd voor NF-KB-doelpromoters in verschillende inflammatoire stimulatieomstandigheden, terwijl JQ1-behandeling werkte door BRD4-binding aan geacetyleerd NF-KB RelA te voorkomen, waardoor de transcriptionele activiteit van NF-KB werd verminderd (Zou et al., 2014). Onze resultaten toonden aan dat de remming van BRD4 de door Cd versterkte interactie tussen BRD4 en RelA-K310ac in rattennieren blokkeert, wat onze bovenstaande resultaten ondersteunt dat het remmen van BRD4 de door Cd geïnduceerde transcriptionele activiteit van NF-KB onderdrukt, wat aangeeft dat Cd de BRD4-binding aan geacetyleerd NF-KB RelA om de transcriptie van inflammatoire cytokines te verhogen.

Samenvattend onthulde onze studie de regulerende mechanismen van BRD4 in door Cd veroorzaakte ontstekingsreactie in rattennieren: (1) BRD4 medieert door Cd geïnduceerde NF-KB nucleaire translocatie en activering. (2) Cd verhoogt de RelA K310-acetyleringsniveaus en verbetert de BRD4-binding aan geacetyleerd NF-KB RelA, wat NF-KB-afhankelijke inflammatoire cytokines transcriptie bevordert. Bovendien verlichtte de remming van BRD4 de Cd-verhoogde inflammatoire cytokineniveaus significant, wat suggereert dat gerichte BRD4 het potentieel heeft om te worden ontwikkeld als een effectief middel voor de behandeling van ontstekingsziekten, waaronder door Cd geïnduceerde nefritis.

CrediT auteursbijdrage verklaring

Zhongguo Gong: Conceptualisering, Methodologie, Visualisatie, Formele analyse, Validatie, Onderzoek, Formele analyse, Datacuratie, Schrijven - origineel ontwerp. Gang Liu: Conceptualisering, Methodologie, Visualisatie, Datacuratie, Schrijven - origineel ontwerp, Projectadministratie, Financieringsacquisitie. Wenjing Liu: Software, bronnen, methodologie, formele analyse. Hui Zou: Projectadministratie, Supervisie. Ruilong Song: Software, Formele analyse, Supervisie. Hongyan Zhao: Software, Formele analyse, Supervisie. Yan Yuan: Toezicht. Jianhong Gu: Toezicht. Jianchun Bian: Financieringsacquisitie, Toezicht. Jiaqiao Zhu: Schrijven - recensie & redactie, Supervisie. Zongping Liu: Schrijven – recensie & redactie, Supervisie,

Projectadministratie, Financieringsacquisitie, Conceptualisering.

Verklaring van concurrerend belang

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed zouden kunnen zijn op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Erkenning

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nrs. 31872533, 31902329, 32072933), het National Key Research and Development Program van China (nr. 2016YFD0501208), en het project van de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Instelling (PADP). Het manuscript is bewerkt voor de juiste Engelse taal, grammatica, interpunctie, spelling en algemene stijl door een of meer van de hooggekwalificeerde native Engelssprekende redacteuren bij ELIXIGEN.

Referenties

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Royal jelly verzwakt door cadmium geïnduceerde nefrotoxiciteit bij mannelijke muizen. Wetenschap. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Gelijktijdige blootstelling aan niet-toxische niveaus van cadmium en fluoride induceert hepatotoxiciteit bij ratten via mitochondriale oxidatieve schade, apoptose en NF-kB-routes teweegbrengen. omgeving. Wetenschap. Vervuiling. Onderzoek Int. 27 (19), 24048-24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Fenegriekzaadpoeder vermindert door cadmium geïnduceerde testiculaire schade en hepatotoxiciteit bij mannelijke ratten. Exp. Toxicol. pad. 66 (7), 293-300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting op Nrf2: hoe Nrf2-signalering de therapeutische activiteiten van BET-eiwitremmers kan beïnvloeden. Bio-essays 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Rollen van selenoproteïne S in reactieve zuurstofsoort-afhankelijke neutrofiele extracellulaire valvorming geïnduceerd door selenium- deficiënte arteritis. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 stuurt de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen en moduleert ontstekingsreacties van macrofagen. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Born, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Blootstelling aan cadmium wordt geassocieerd met oplosbare urokinase-plasminogeenactivatorreceptor, een circulerende marker van ontsteking en toekomstige hart- en vaatziekten. omgeving. Onderzoek 152, 185-191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Stroomopwaartse signaleringsgebeurtenissen leiden tot verhoogde productie van pro-survival stikstofmonoxide in fotodynamisch uitgedaagde glioblastoomcellen. Vrije Radicaal. Biol. Med. 137, 37-45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variatie van verschillende metabolieten en zware metalen in Oryza sativa L., gerelateerd aan chronische nierziekte van onbekende etiologie in Sri Lanka. Chemosfeer 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Door palmitinezuur geïnduceerde NAD(plus) uitputting is geassocieerd met de verminderde functie van SIRT1 en verhoogde expressie van BACE1 in hippocampale neuronen. Neurochem. Onderzoek 44 (7), 1745– 1754.

Ghosh, KNI, 2018. Behandeling met cadmium induceert echinokokkose, DNA-schade, ontsteking en apoptose in hartweefsel van albino Wistar-ratten. omgeving. Toxicol. Pharmacol. 59, 43-52. ontstekingen en kanker. Biomedicijnen 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Acute blootstelling aan cadmium induceert langdurige neutrofilie samen met vertraagde inductie van granulocytkoloniestimulerende factor in de lever van muizen. Boog. Toxicol. 90 (12), 3005-3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. De effecten van blootstelling aan cadmium bij de inductie van ontsteking. Immunofarmacol. Immunotoxicol. 42 (1), 1–8.