De functionele eigenschappen van eiwitten kunnen worden verbeterd door hydrolyse door bepaalde proteasen

Neem contact oposar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Abstract:Om methoden te onderzoeken voor het verbeteren van de verwerking van varkensafval, werd de varkenshuid gehydrolyseerd met behulp van verschillende commercieel beschikbare proteasen (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelaïne, Protamex en Papaïne) onder verschillende optimale omstandigheden. Na enzymatische hydrolyse werden de collageenhydrolysaten (CHs) gefractioneerd naar molecuulgewicht (3 kDa) via membraanultrafiltratie. De CHS werden geanalyseerd op fysieke eigenschappen (pH, eiwitterugwinning, gehalte aan vrije aminogroepen, molecuulgewichtsverdeling en aminosamenstelling) en op functionele eigenschappen (antioxidantactiviteiten en antiverouderingsactiviteiten). Van de CH's vertoonden CH's gehydrolyseerd door Alcalase (CH-Alcalase) de hoogste mate van hydrolyse in vergelijking met andere CH's. Zowel "CH-Alcalase" en "CH-Alcalase"<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

trefwoorden:hydrolyse; commerciële proteasen; collageen hydrolysaat; antioxidant; anti-veroudering

KSL01

Klik hier om meer te weten

1. Inleiding

Met de toenemende levensverwachting krijgen huidverouderingsprocedures veel aandacht. Collageen, gebruikt in huidverzorgingsproducten als cosmeceutisch ingrediënt voor anti-aging, wordt veel gebruikt in de cosmetische markt. Collageen is een vezelig eiwit met een hoog molecuulgewicht van dierlijke oorsprong, dat overvloedig wordt aangetroffen in bindweefsel, huid, pezen, kraakbeen, ligamenten, tanden, nagels en haar van mens en dier. Vee blijft de belangrijkste bron van industrieel collageen [1l. Jaarlijks worden wereldwijd grote hoeveelheden dierlijke bijproducten als afval weggegooid door de voedsel- en vleesverwerkende industrie. Deze kunnen echter worden gebruikt als belangrijke eiwitbronnen voor nieuwe voedingsmaterialen of worden omgezet in producten met toegevoegde waarde via hydrolyse, wat op grote schaal wordt toegepast om de functionele en nutritionele eigenschappen van eiwitten te verbeteren en te upgraden [2,3].cistanche genghis khanCollageen wordt ook steeds meer beschouwd als een bron van bioactieve peptiden, die veelbelovend zijn gebleken als heilzame verbindingen voor gebruik in voedings- of farmaceutische toepassingen. Daarom kan hydrolyse van collageen een belangrijke rol spelen bij het verbeteren van de biologische beschikbaarheid en geschiktheid voor gebruik in verschillende commerciële processen.

Fysiologische activiteiten van bioactieve peptiden, die gewoonlijk 2-20 aminozuurresiduen bevatten (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms="" [1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="" the="" degree="" of="" hydrolysis="" directly="" affects="" the="" molecular="" weight="" and="" amino="" acid="" composition="" of="" the="" hydrolysates="" [8].="" therefore,="" the="" hydrolysis="" process="" may="" be="" necessary="" for="" producing="" novel="" bioactive="">

KSL02

Cistanche kan anti-aging

Eiwithydrolyse, wat leidt tot de splitsing van peptidebindingen, kan worden uitgevoerd via enzymatische of chemische processen [9]. Chemische processen, waaronder alkalische of zure hydrolyse met behulp van oplosmiddelextracties, zijn niet alleen schadelijk voor het milieu, maar ook voor de mens die de resulterende producten consumeert [4,10]. Chemische processen, die moeilijk te beheersen zijn, leveren producten op die gemodificeerde aminozuren bevatten [9]. Daarentegen kan enzymatische hydrolyse worden uitgevoerd onder milde omstandigheden, waardoor extreme omgevingen worden vermeden die vereist zijn door chemische behandelingen.cistanche levensverlengingBovendien veroorzaken de processen geen nevenreacties en verminderen ze ook niet de voedingswaarde van de eiwitbron [8]. Verschillende proteasen, waaronder Alcalase, pepsine, Protamex, trypsine en Neutrase, worden vaak gebruikt om eiwitten te hydrolyseren, wat resulteert in verschillende soorten eiwithydrolysaten en peptiden met een verscheidenheid aan biofunctionele activiteiten. Eén studie rapporteerde de productie van collageenhydrolysaten met antioxiderende activiteit uit varkenshuidgelatine met behulp van enzymatische hydrolyse door pepsine en pancreatine [11]. Bijproducten van zalm werden gehydrolyseerd om peptische hydrolysaten te produceren met behulp van verschillende proteasen, waarbij de uiteindelijke peptiden uitstekende antioxiderende en ontstekingsremmende eigenschappen vertoonden [12].

Het doel van het onderzoek was: (a) het identificeren van de meest actieve collageenhydrolysaten geproduceerd door enzymatische hydrolyse met behulp van verschillende commercieel beschikbare proteasen (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelaïne en Papaïne); (b) om het fractioneringseffect van collageenhydrolysaten verkregen uit enzymatische hydrolyse, en (c) om hun in vitro antioxiderende en anti-verouderingsactiviteiten te bepalen.

2. Resultaten en discussie

2.1. Enzymatisch hydrolyse-effect op collageenhydrolysaten

2.1.1.pH

De functionele eigenschappen van eiwitten kunnen worden verbeterd door hydrolyse door bepaalde proteasen. In deze studie werden zes verschillende proteasen (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelaïne, Protamex en Papaïne) gebruikt om collageen uit de varkenshuid te hydrolyseren om actieve collageenhydrolysaten met een laag molecuulgewicht te verkrijgen. De verandering van pH in collageenhydrolysaten (CH) wordt getoond in figuur 1. De pH van de collageensuspensie (5 procent varkenshuidmengsel) was aanvankelijk 6,39-6,55 (bij 0h). CH-Alcalase en CH-Flavorzyme bereikten een optimale pH (pH 8.0) na 12 uur incubatie. CH-Protamex, CH-bromelaïne en CH-papaïne bereikten een optimale pH (pH 7,0) na 6 uur incubatie, terwijl CH-Flavorzyme bleef dalen van pH 6,39 tot pH 5,69 gedurende 24 incubatie (Figuur 1 ). De pH van een eiwithydrolysaat is een belangrijke factor die enzymatische hydrolysereacties reguleert [13].cistanche nzDaarom kan de vorming van collageenhydrolysaten onder omstandigheden met verschillende pH te wijten zijn aan pH-afhankelijke veranderingen in de enzymconformatie, die hun bio-activering en fysisch-chemische eigenschappen kunnen beïnvloeden.

2.1.2.Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)

Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) profielen van CH's die gedurende 24 uur met verschillende proteasen zijn behandeld, worden getoond (Figuur 2). Het peptideprofiel van de collageensuspensie (op 0 uur) vertoonde een zichtbare band in het bereik van laag tot hoog molecuulgewicht. De resultaten wezen op snelle hydrolyse in CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bromelain en CH-Protamex, aangezien er geen banden waren na 3 uur incubatie. De banden met hoog molecuulgewicht van CH-Alcalase, CH-Neutrase en CH-Protamex namen af op een tijdsafhankelijke incubatiewijze. CH-Bromeline varieerde echter niet met de incubatietijd omdat het na slechts 1 uur incubatie volledig is gehydrolyseerd. Interessant is dat de CH's volledig verdwenen toen het monster gedurende 6 uur reageerde met Alcalase of Neutrase, wat aangeeft dat collageen fungeerde als een geschikt substraat voor sommige van de andere geteste enzymen. Banden van CH-Flavorzyme en CH-Papaïne verschenen echter na 24 uur in het bereik van laag tot hoog molecuulgewicht. Eiwitten kunnen gedeeltelijk worden gehydrolyseerd tot peptiden of aminozuren door enzymatische hydrolyse, afhankelijk van het proteasetype, de incubatietijd en de protease-substraatverhouding (eiwithoeveelheid) [14]. Het enzymatische hydrolyseproces wordt voornamelijk bepaald door of het betrokken proteasetype een endopeptidase of een exopeptidase is [15,16]. Aangezien Alcalase, Neutrase en Protamex endopeptidasen zijn, kan worden verwacht dat hun hydrolyseprocessen willekeurig peptidebindingen van niet-terminale aminozuren verbreken, waardoor verdere hydrolyse van eiwitten wordt vergemakkelijkt. Aan de andere kant is Flavorzyme zowel een endo- als een exopeptidase, dat de niet- of N-terminale peptideketens breekt. In deze studie bevatte collageeneiwit bindingsplaatsen die gevoeliger waren voor exopeptidase-activiteit dan voor endopeptidase-activiteit van Flavorzyme. Als gevolg van exopeptidase-activiteit hield hydrolyse van collageeneiwitten door Flavorzyme het stapsgewijze verbreken van peptidebindingen van het N-uiteinde van aminozuren in, wat de eiwithydrolyse vertraagde.

2.1.3. Eiwitherstel en vrije aminogroepinhoud

Eiwit herstel van de CHs verkregen via verschillende commerciële proteasen wordt getoond (Figuur 3A). De controle (collageensuspensie) had een eiwitterugwinningsgehalte van 1,19 mg/ml. Eiwitterugwinning is een parameter van de efficiëntie van enzymatische hydrolyse. Het lage eiwitterugwinningsgehalte van CH is indicatief voor een verhoogde eiwitafbraak. Bovendien correleert eiwitterugwinning goed met eiwitoplosbaarheid. Een hogere hydrolytische activiteit kan worden veroorzaakt door een toename van blootgestelde hydrofobe zijketens, wat leidt tot verhoogde hydrofobe interacties tussen eiwitten en/of peptiden.cistanche penisgrootteDeze hydrofobe zijketens kunnen leiden tot een verminderde oplosbaarheid van eiwitten, wat resulteert in een verhoogde eiwitterugwinning van hydrolysaten. In onze studie was het eiwitherstelgehalte goed gecorreleerd met veranderingen in de SDS-PAGE-patronen. De laagste en hoogste eiwitterugwinningsniveaus werden geregistreerd voor respectievelijk Alcalase- en Flavorzyme-hydrolyse. Voor hydrolyse-efficiëntie gerelateerd aan incubatietijd, namen CH-Alcalase, CH-Bromelain en CH-Protamex drastisch af binnen een uur na incubatie in vergelijking met de controle. De afname van het eiwitterugwinningsgehalte als gevolg van eiwithydrolyse vertoonde een omgekeerd verband met het aminogroepgehalte. Bovendien vertoonden de meeste CH's, behalve CH-neutrase, een laag eiwitgehalte tussen 3 uur en 12 uur. Na 24 uur incubatie nam hun eiwitgehalte weer toe in CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex en CH-Papaïne als volgt:0,83 mg/ml, 1,29 mg/ml,0,75 mg/ml,0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml en 1,11 mg/ml, respectievelijk. Sommige rapporten geven aan dat de optimale hydrolysetijd afhankelijk is van verschillende factoren, zoals de geselecteerde soort, de grondstof, het gebruikte enzym, de grondstof/enzymsnelheid, de concentratie van het enzym en de mate van hydrolyse die wordt nagestreefd, enz. [16] ]. Sommige rapporten geven aan dat langdurige enzymatische hydrolyse (meer dan 24 uur) kan leiden tot een vermindering van de protease-activiteit; dus enzymatische hydrolyse moet worden uitgevoerd binnen 24 uur na enzymatische hydrolyse [17,18].

KSL03

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated (Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase(1.00 mg/mL)> CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme(0.53mg/mL)>CH-papaïne (0,40 mg/ml). Gewoonlijk kunnen verschillen in het totale eiwit- of vrije aminogroepgehalte van enzymatisch gehydrolyseerde monsters verband houden met de enzymspecificiteit. Het is afhankelijk van de eigenschappen van een enzym tijdens het enzymatische hydrolyseproces [16,17].cistanche poeder,Alkalische proteasen (zoals Alcalase) vertonen bijvoorbeeld hogere hydrolytische activiteiten in vergelijking met zure of neutrale proteasen.

Figuur 3. Verandering in eiwitterugwinning (A) en vrije aminogroepen (B) van collageenhydrolysaten (CH) afhankelijk van incubatietijd. Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Gegevens aangegeven met verschillende letters (ad) tonen statistisch significante verschillen, afhankelijk van de incubatietijd (p<>

KSL04