Het beheer van opgeloste zuurstof door een polypropyleen holle vezelmembraanschakelaar beïnvloedt de veroudering van wijn
Mar 09, 2022
contact:tina.xiang@wecistanche.com
Abstract
Achtergrond: Talrijke oenologische praktijken kunnen een teveel aan opgeloste zuurstof in wijn veroorzaken, waardoor sensorische en chromatische defecten op korte tot lange termijn worden vastgesteld. Daarom is het noodzakelijk om het teveel aan zuurstof te beheersen voordat het wordt gebotteld. Methoden: In deze studie werd het beheer van het opgeloste zuurstofgehalte door een polypropyleen holle-vezelmembraancontactorapparaat uitgevoerd in twee wijnen van verschillende druivenrassen (Aglianico en Falanghina). De wijnen werden geanalyseerd na 11-maanden rijping. Anthocyanines en aceetaldehydegehalte werden geëvalueerd met HPLC. Bovendien, anderefenolischverbindingen en chromatische kenmerken werden geanalyseerd met spectrofotometrische methoden. NMR- en HR ESIMS-analyses werden uitgevoerd om het aantal proanthocyanines en polymere pigmenten te evalueren. Resultaten: Na 11 maanden rijping werd in beide wijnen een afname van vrij en totaal SO2 vastgesteld ten opzichte van de beginwaarden. Bij de wijnen met de hoogste opgeloste zuurstofgehaltes werd een opmerkelijker verlies waargenomen. Er werden geen significante verschillen in termen van kleurparameters gedetecteerd. In rode wijn met het hoogste zuurstofgehalte, een massale vorming van polymeerpigmentenen BSA-reactieve tannines werden waargenomen, in tegenstelling tot wijnen met een lager zuurstofgehalte. Conclusie: De studie toonde aan dat de membraancontactor een succesvol hulpmiddel kan zijn om opgeloste zuurstof in wijnen te beheren om hun oxidatieve bederf te voorkomen.
Trefwoorden: oxidatie; membraan contactor; wijn; polymere pigmenten
1. Inleiding
Wijn is een chemisch dynamisch systeem en zelfs na de fermentatie blijft de samenstelling evolueren tijdens de bewaring. Deze veranderingen na de gisting worden veroudering genoemd, maar er moet een onderscheid worden gemaakt tussen de veranderingen die optreden tijdens de rijpingsfase (bijv. bulkopslag van wijn in tank of vat), wanneer de tussenkomst van de wijnmaker nog is toegestaan, en die welke plaats tijdens de rijpingsfase nadat de wijn in flessen is verzegeld en de enige mogelijke interventie beperkt is tot de selectie van de meest geschikte bewaarcondities.
Van de wijnverbindingen zijn fenolen het meest aangetast door veroudering. Ze zijn afkomstig van druiven (flavonoïdenen niet-flavonoïden) en vormen een van de belangrijkste parameters voor wijnkwaliteit. Tijdens het maken en rijpen van wijn ondergaan fenolen voornamelijkoxidatiereacties, die niet alleen de fenolische samenstelling zelf beïnvloeden, maar ook veranderingen bepalen in termen van sensorische kenmerken, zoals kleur en astringentie.
Fenolverbindingen zijn de primaire reactanten die moeten worden geoxideerd in aanwezigheid van zuurstof en metalen (Fe3 plus Cu2 plus ), wat aanleiding geeft tot een cascade van chemische transformaties die kan leiden tot een overmatige verslechtering van wijn [1]. Wijnoxidatiebestaat uit een reeks reacties: ten eerste wordt zuurstof gereduceerd tot waterstofperoxide door interactie met overgangsmetalen, waaronder ijzer- en koperionen, in aanwezigheid van catechol-subeenheden die worden geoxideerd tot chinonen [2]. Chinonen reageren sterk met nucleofiele verbindingen, zoals antioxidanten (zwaveldioxide, glutathion, ascorbinezuur), gewenste aroma vluchtige thiolen
(dwz 3-sulfanylhexanol), ongewenste aromathiolen (dwz waterstofsulfide), aminozuren (dwz fenylalanine, methionine) en talrijke polyfenolen (voornamelijk flavonolen). De producten van deze reacties kunnen leiden tot de vorming van gecondenseerdepolymere pigmenten—met name belangrijk in rode wijnen—of zelfs voor het verlies van kleur en variëteitkenmerken [3]. In een volgende stap reageren ijzer- of kopersoorten met waterstofperoxide door de Fenton-reactie om het hydroxylradicaal op te leveren, een sterk oxidatiemiddel dat in staat is om te reageren met alle organische bestanddelen in verhouding tot de concentratie [4]. De meest voorkomende organische verbinding in wijn is ethanol, dat wordt omgezet in aceetaldehyde zodra het is geoxideerd door de hydroxylradicaal.
Als een gevolg vanoxidatieIn rode wijn worden inheemse anthocyaninepigmenten snel omgezet in stabielere pigmenten via verschillende soorten reacties, zoals aldehyde-gemedieerde condensatiereacties met tannines en cyclo-additiereacties die leiden tot de vorming van proanthocyanines [5]. Oxidatiereacties dragen ook bij aan het wijzigen van de astringentie van wijn door de tanninestructuur te veranderen als gevolg van intra- en intermoleculaire reacties die worden gemedieerd door zuurstof [6]. Deze "gestabiliseerde producten" anthocyanine of gepigmenteerde tannines blijven veel langer in wijn dan in hun oorspronkelijke vorm [7]. Lage hoeveelheden zuurstof in rode wijn zijn dus belangrijk om kleur of astringentie te stabiliseren. Pasteur zelf, in zijn studies over wijn, theoretiseerde dat alleen wanneer een wijn wordt blootgesteld aan zuurstof, deze eigenschappen kan ontwikkelen die hem tot een fijn gerijpt product van hoge kwaliteit maken. Tijdens het maken van wijn speelt zuurstof een cruciale rol in het fermentatieproces. Het bevordert de synthese van gistbiomassa en bevordert een goede fermentatie. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat het risico op vastzittende en trage fermentaties wordt verminderd na zuurstoftoevoeging van 10-20 mg/L [8].
Bij witte wijnen wordt oxidatie meestal geassocieerd met belangrijke kleurveranderingen. De bruine kleur is normaal gesproken ongewenst omdat het een teken is van oxidatie in witte tafelwijn. Bruine verkleuring kan worden veroorzaakt door enzymatische of chemische oxidatie die wordt gemedieerd door zuurstof. Dit laatste is langzamer dan de enzymatisch geïnduceerde oxidatie. Witte wijn is over het algemeen gevoeliger voor O dan rode wijn. Zelfs kleine toevoegingen van O. aan witte wijn kunnen leiden tot verlies van aroma, vooral fruitigheid met het verschijnen van bijsmaken die worden beschreven als karamel, ranzig, gekweekt voer, honingachtige en gekookte groenten. De chinonen die door oxidatie worden gegenereerd, kunnen reageren met thiolen door de Michael-additiereactie of H2O2 genereren, zoals hierboven vermeld. De oxidatieve omgeving door alle fasen van de wijnbereiding is positief gecorreleerd met de vorming van deze producten. Tijdens het rijpen van rode wijn in eikenhouten vaten, induceert het oxidatieproces ook de vorming van sotolon door de oxidatie van threonine of door de reactie van aceetaldehyde met -ketoboterzuur. De oxidatieve afbraak van fenylalanine en -fenylethanol in een vat leidt ook tot hogere concentraties fenylacetaldehyde [9].
Zoals hierboven beschreven, kan zuurstof zowel gunstige als nadelige effecten hebben op de wijnkwaliteit. Het niveau van zuurstofblootstelling van wijn tijdens het maken of rijpen van wijn is cruciaal omdat dit het eindproduct kan beïnvloeden. Singleton [10] schatte de hoeveelheid zuurstof die witte of rode wijn zou kunnen opnemen voordat oxidatieve defecten optreden. In witte wijn is de tolerantie ongeveer 10 luchtverzadigingen in tegenstelling tot rode wijn, die meer dan 30 luchtverzadigingen kan verdragen (180 mLO2/L). Hij adviseerde ook ongeveer 10 verzadigingen om de kwaliteit van rode wijn te verbeteren.
Zuurstofbeheer tijdens de fasen van vinificatie en opslag is daarom belangrijk en moet worden behandeld volgens de opgedane kennis om de opkomst van oxidatieve eigenschappen te voorkomen. Na de wijnbereiding ondergaat wijn gewoonlijk een reeks stabilisatiepraktijken zoals decanteren, koeling en filtratie die een ongecontroleerde zuurstofinlaat kunnen bepalen. Bovendien zijn nieuwe vinificatiemethoden die gebruikmaken van roestvrijstalen tanks en systemen die een gecontroleerde micro-toevoer van zuurstof (micro-oxygenatie) mogelijk maken, nu gebruikelijk. Zelfs wanneer specifieke inspanningen zijn geleverd om wijnen te produceren die zo goed mogelijk bestand zijn tegen verdere zuurstofopname, kan alle ongecontroleerde opgeloste zuurstof in wijn de verdere ontwikkeling van oxiderende karakters bepalen zodra deze is gebotteld. In deze context kan het gebruik van een membraancontactor om de zuurstof in een wijn te beheren vóór het bottelen een succesvolle strategie zijn om de best mogelijke wijnen te verkrijgen.
Membraancontactors behoren tot de meest gebruikte industriële systemen, en deze technologie is nuttig gebleken in een reeks vloeistof/vloeistof- en gas/vloeistoftoepassingen in fermentatie, farmaceutica, afvalwaterbehandeling, chirale scheidingen, halfgeleiderproductie, carbonatatie van dranken, extractie van metaalionen , eiwitextractie, VOS-verwijdering uit afvalgas, osmotische distillatie en dealcoholisatie van wijn [11,12]. Het is een apparaat dat gas/vloeistof of vloeistof/vloeistof massaoverdracht bereikt zonder dispersie van de ene fase in de andere. Hoewel membraancontactortechnologie werd geïntroduceerd als een hulpmiddel voor gasbeheer in wijnen [13,14], hebben tot nu toe weinig studies de effectiviteit van de toepassing ervan vóór het bottelen onderzocht om de evolutie van witte en rode wijn tijdens flesrijping te reguleren.
In deze studie werd een gedeeltelijke deoxygenatie uitgevoerd op twee monovarietal wijnen: Aglianico en Falanghina. Het effect van zuurstofverwijdering op verschillende wijnparameters zoals vrij en gebonden SO2 en aceetaldehydegehalte werd geëvalueerd na 1l maanden flesrijping. Voor rode wijn werd ook het effect op de chromatische kenmerken en de belangrijkste fenolische verbindingen geëvalueerd.
2. Resultaten en discussie
In deze studie werden twee commerciële wijnen (Aglianico (R) en Falanghina (W)) onderworpen aan een deoxygenatieproces met behulp van membraancontactortechnologie om drie wijnen te verkrijgen met afnemende niveaus van opgeloste zuurstof (hoog (H), gemiddeld (M), en laag (L) voor elke wijn) vóór de bottelfase. Na 11 maanden flesrijping zijn de effecten op zwaveldioxide, aceetaldehyde, chromatische karakters,polymere pigmenten, VRF, BSA-tannines en totaal fenolisch S werden geëvalueerd.
2.1. Zwaveldioxide
De concentratie van vrij en totaal SO2 werd gecontroleerd na 11 maanden rijping in de Aglianico-wijn (Tabel 1). Voor alle monsters werd een verlies van SO2 met betrekking tot botteltijd (vrij SO, 18 mg/L, tot SO, 43 mg/L) waargenomen, en de grootste daling van de waarden van totaal SO2 werd waargenomen in de wijnen met hogere zuurstofgehalte bij het bottelen (RHO2 en RMO2), zoals verwacht.
Tijdens het verouderingsproces worden de meest voorkomende vormen van vrij SO2 bij de pH van de wijn, het bisulfietion (HSO, in evenwicht met moleculair SO), verbruikt door de reactie met waterstofperoxide en verschillende elektrofiele wijncomponenten, zoals die geproduceerd door de oxidatiecascade, waaronder chinon en aceetaldehyde [15]. In wijnmakerijomgevingen is het gebruikelijk om het zogenaamde "vrije SO" te meten, dat is de som van moleculair SO en bisulfietion. Deze laatste verbinding kan covalente adducten vormen met elektrofielen, SO2-bindmiddelen genaamd, die kunnen worden geclassificeerd als zwak of sterk op basis van de dissociatieconstante van de gevormde sulfietadducten. Deze sulfietadducten worden gebonden SO genoemd, en de som
van vrije en gebonden SO geeft de "totale SO",. De vrije en gebonden SO zijn in wijn met elkaar in evenwicht. Bovendien komt tijdens oxidatie door het evenwicht tussen deze twee vormen van SO2 en door de consumptie van vrij SO2 de gecombineerde vorm vrij om het evenwicht te herstellen. In alle behandelde rode wijnen werden waarden van vrij SO2 van minder dan 3,84 mg/L gedetecteerd na 11 maanden flesrijping. Deze waarden liggen ruim onder de kwantificeringslimiet van officiële analysemethoden van vrij SO2 [16]; daarom is het juister om de waarde van vrij SO te verwaarlozen, terwijl de waarden van totaal SO lager waren in monsters die werden gebotteld met een hoger gehalte aan opgeloste zuurstof (RHO2). De verschuiving tussen vrije en gecombineerde wijnrijping zou de reden kunnen zijn waarom in wijnen dalende niveaus van totaal SO2 werden gedetecteerd naarmate de opgeloste zuurstof bij het bottelen toenam. Afgezien van het verbruik van SO2 door oxidatiereacties, kan een deel ervan ook verloren gaan tijdens veroudering door de reacties van zwaveldioxide met flavanolen. Het mechanisme van vorming van 4/ß-gesulfoneerde producten is nog onzeker. Er wordt verondersteld dat monomere 4ß-gesulfoneerde derivaten worden gevormd door de door zuur gekatalyseerde depolymerisatie van proanthocyanidinen [17].
De concentraties van vrij en totaal SO2 (Tabel 1) werden gecontroleerd na 11 maanden rijping in witte wijn waarvan het gedrag hetzelfde bleek te zijn als in rode wijn. Verder werd in dit geval een verlies van vrij en totaal SO2 ten opzichte van de initiële waarden gedetecteerd (vrij SO,26 mg/L en tot. SO, 89 mg/L). Bovendien werden wijnen met een hoger zuurstofgehalte bij botteling (WHO2) vertoonde een lager gehalte aan vrij en totaal SO2.
Aceetaldehyde, gevormd door de metaalgekatalyseerde oxidatie van ethanol tijdens wijnoxidatie, was hoger na 11 maanden veroudering in monster WHO, met betrekking tot monster WMO en WLO, zoals verwacht gezien het lagere gehalte aan vrij en totaal SO, in WHO, monsters (tabel 2). Omdat de gewichtsverhouding tussen aceetaldehyde en zwaveldioxide 1,4/1 (1,4 mg SO2 verbruikt per 1 mg CH3CHO) is, konden we beoordelen dat de hoeveelheid aceetaldehyde in monster WHO volledig is gecombineerd met SO, (50 mg aceetaldehyde gecombineerd met 70 mg SO2) en gezien de verwaarloosbare niveaus van vrij zwaveldioxide na 11 maanden veroudering, wordt verwacht dat verdere blootstelling aan zuurstof kan leiden tot het verschijnen van vrij aceetaldehyde.
In rode wijnen verschilt de aceetaldehydeconcentratie niet tussen de geanalyseerde monsters. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat, in aanwezigheid van anthocyanines en een hogere concentratie aan flavanolen, aceetaldehyde tijdens veroudering betrokken is bij een aantal reacties met deze fenolen. Zoals hieronder besproken, is de belangrijkste reactie waarbij aceetaldehyde, anthocyanines en flavonolen betrokken zijn de vorming van ethyl-gebrugde verbindingen [18,19] en ethyl-gekoppelde oligomeren, die verder kunnen reageren met extra aceetaldehyde, anthocyanines en flavanolen om een pyran te genereren ring of andere structuren van het polymeertype. Uiteindelijk kunnen deze producten de sensorische eigenschappen van wijn veranderen [20] door enkele belangrijke wijnkenmerken zoals kleur, smaak en samentrekking te beïnvloeden.
2.2. Effect op pigmenten en chromatische karakters
Gegevens over het gehalte aan monomere anthocyanines in behandelde rode wijnen na 11 maanden flesrijping toonden (tabel 3 en aanvullende materialen figuur S1) een verlies van malvidine-3-glucoside in het RHO2-monster met een hogere zuurstofconcentratie dan in RMO2 en RLO2. Consequent werden verschillen in termen van totale anthocyanines gedetecteerd tussen wijnen (Figuur 1). Wijn met een lage zuurstofconcentratie bij het bottelen vertoonde een hogere concentratie totale natuurlijke anthocyanines in vergelijking met wijnen met hogere concentraties opgeloste zuurstof. Het effect van de membraancontactorbehandeling op verschillende pigmentklassen, bepaald door de Harbertson-methode, omvatte een verwachte significant lage concentratie in SPP (korte polymere pigmenten) in monsters RLO, vergeleken met de monsters RHO2 en RMO2 die de hoogste toename van deze belangrijke stabiele verbindingen (Tabel 4). LPP (lange polymere pigmenten) waren niet significant verschillend in alle monsters. Polymere pigmenten (SPP en LPP) worden gedefinieerd als pigmenten die bestand zijn tegen bisulfietbleking. Ze worden gevormd door de reactie tussen anthocyanines en tannines tijdens het rijpen van de wijn [21], wat leidt tot een stabilisatie van de kleur na verloop van tijd. Het belangrijkste verschil tussen deze twee klassen van pigmenten is dat LPP, in tegenstelling tot SPP, de neiging heeft te precipiteren met eiwit [22]. Naarmate rode wijn ouder wordt, wordt gewoonlijk een grotere vorming van LPP waargenomen in vergelijking met SPP. De veranderingen die zijn gedetecteerd voor SPP en niet voor LPP, kunnen dus wijzen op een vroege oxidatieve staat van Aglianico-wijnen na 11 maanden rijping. De betrokkenheid van natieve anthocyanines bij reacties die nieuwe polymere pigmenten opleveren, komt overeen met de afname van de totale natieve anthocyanines die wordt weergegeven in (Tabel 4), en met vergelijkbare effecten die worden waargenomen in rode wijnen tijdens micro-oxygenatie [23].
Naarmate wijn ouder wordt en door verschillende blootstelling aan zuurstof, worden deze polymere pigmenten van cruciaal belang voor de wijnkleur en kunnen kleine hoeveelheden aceetaldehyde reageren met anthocyanines om nieuwe stabiele rode pigmenten te produceren [19,24]. Het feit dat er geen significante verschillen in kleurintensiteit en tint werden gedetecteerd (Tabel 5) kan waarschijnlijk te wijten zijn aan de relatief korte tijd van veroudering, zoals al waargenomen voor LPP.
2.3. Effect op rode wijnpigmenten: NMR- en HR ESIMS-analyses
Om de moleculaire basis van de waargenomen veranderingen in de met verschillende zuurstofniveaus behandelde wijnen te begrijpen, werden monsters van RHO2, RMO2 en RLO onderworpen aan op NMR gebaseerde analyse, zoals beschreven in hoofdstuk 3. Een zorgvuldige inspectie van de verkregen H-NMR-spectra van de drie monsters brachten geen waarneembaar verschil tussen de drie vergeleken wijnen aan het licht (aanvullende materialen figuur S2). Daarom hebben we besloten om dezelfde wijnen te onderzoeken door middel van HR ESIMS gezien de intrinsieke hogere gevoeligheid van de techniek in vergelijking met NMR-spectroscopie. De drie wijnen werden gefractioneerd door HPLC/Vis met behulp van een C-18-kolom. Voor elke wijn werden drie fracties verkregen: de eerste fractie werd verzameld van 15 tot 25 min (fractie 1), de tweede van 25 tot 30 min (fractie 2) en tenslotte een derde fractie (fractie 1). 3) vanaf 30 min tot het einde van de chromatografische run. In overeenstemming met gegevens vermeld in de literatuur [25], werd verwacht dat in de eerste fractie niet-geacetyleerde anthocyanines zouden voorkomen, terwijl potentiële pyranoanthocyanines in de tweede fractie zouden worden verzameld. De drie verkregen fracties (1-3) voor elk van de drie geanalyseerde wijnen (RHO,, RMO en RLO,) werden allemaal onderworpen aan een volledige scan HR ESIMS-analyse in de positieve ionenmodus. Bij overtreding 1 van alle wijnen ontdekten we een ionenpiek die was toegewezen aan malvidine-3-O-glucoside (493.1332;△=-1.648; overeenkomend met C23H2sO12 plus ), terwijl ionenpieken gerelateerd waren aan de andere veel voorkomende wijn anthocyanines, wanneer ze werden gedetecteerd, vertoonden fouten boven 10 ppm en werden niet als betrouwbaar beschouwd (aanvullende materialen figuur S3). Met betrekking tot fracties 2 en 3 van RMO2 en RLO bleken ze in principe op elkaar te stapelen, terwijl de massaspectra van fracties 2 en 3 van de RHO vertoonde de wijn enkele interessante eigenaardigheden. Meer specifiek werd in RHO, fractie 2, een ionenpiek gecentreerd op m/z517.1317(△=-4.569; overeenkomend met C25H25O12) waargenomen. Deze piek werd toegeschreven aan Vitisin B (aanvullende materialen figuur S4) [26]. In het massaspectrum van fractie 3 van RHO, twee ionenpieken bij m/z809.2294(△=0.827; overeenkomend met Ca0H4O18)(Aanvullende materialen Figuur S5) en 1029.2871(△=-0.065 ; overeenkomend met respectievelijk CsH53O25) (aanvullende materialen figuur S6) waren aanwezig. Deze ionenpieken waren indicatief voor het optreden van polymere pigmenten. De piek bij m/z 809 werd toegeschreven aan ethylideen-gebrugde dimeren bestaande uit één malvidine-3-O-glucoside-eenheid en één (epi)catechine-eenheid[27I, en de piek bij m/z1029 werd toegewezen aan de ethylideen- gebrugd dimeer bestaande uit twee malvidine-3-O-glucoside-eenheden, waarvan één in zijn flavyliumvorm en de andere in zijn pseudo-basevorm [28,29].
Vitis in B en ethylideen-gebrugde pigmenten (m/z 809 en 1029) zijn het resultaat van de chemische reactie tussen aceetaldehyde en anthocyanines of flavan-3-olen. Acetaldehyde kan werken als een nucleofiel op de alfa-positie of als een elektrofiel op de carbonylfunctionaliteit. De reactie tussen het nucleofiele acetaldehyde en de elektrofiele C4-positie van anthocyanines leidt tot de vorming van Vitisine B, een vrij stabiele verbinding die geclassificeerd is als een pyranoanthocyanine. Omgekeerd, wanneer aceetaldehyde als een elektrofiel werkt door een nucleofiele aanval te ondergaan door de C8, en in mindere mate zelfs door de C6-posities van ofwel flavan-3-olen of anthocyanines, worden ethylideen-gebrugde dimeren gevormd. Het is niet verwonderlijk dat we Vitisine B en rode pigmenten alleen in de RHO2-wijn hebben waargenomen, aangezien dergelijke producten, zoals hierboven besproken, worden gevormd door de reactie van acetaldehyde met anthocyanines en flavan-3-olen, en acetaldehyde is een molecuul dat voornamelijk als gevolg van het oxidatieproces dat wijn in de loop van de tijd heeft ondergaan door middel van blootstelling aan zuurstof uit de lucht. Daarom zijn er zeker grotere hoeveelheden aceetaldehyde aanwezig in RHO dan in RMO en RLO, wijnen die beschermd lijken te zijn tegen zuurstof tot een
2.4. Effect op VRF, BSA-tannines en totaal fenolen
Hoewel kort na de behandeling met de membraancontactor de niveaus van totale fenolen vergelijkbaar waren bij de behandelde wijnen, was na 11 maanden flesrijping het aantal totale fenolen hoger in het monster met hogere zuurstofconcentraties bij het bottelen, zoals weergegeven in Tabel 6. Dit kan waarschijnlijk te wijten zijn aan de rol die zuurstof speelt bij de vorming van fenolische verbindingen die reactiever zijn op ijzer en in een variatie van de moleculaire structuur van monomere en polymere fenolische structuren, zoals al is aangetoond in wijnen die tijdens het rijpen verschillende zuurstofopnames ondergaan [6]. Dit wordt bevestigd door de trend die is waargenomen in Tabel 6 voor BSA-reactief voor tannines en flavans die reactief zijn voor vanilline en in Tabel 4 voor SPP, die een statistisch verschil vertoonden na de 11 maanden van veroudering.
grotere mate dan RHO2.
Tannineconcentraties die reactief zijn voor BSA-eiwitten werden bepaald door de Habertson-methode in RHO, RMO en RLO. Tijdens de veroudering werd een toename van het niveau van tannines die reactief waren voor BSA in RHO2 waargenomen, consistent met een mogelijke polymerisatie van tanninestructuren [27] ]. Harbertson [30] toonde inderdaad aan dat de BSA-precipitatie toenam als een functie van de toenemende mate van polymerisatie (of grootte) van trimeren naar octameren. Als gevolg hiervan kan elke verandering in tanninesamenstelling en -grootte hun reactievermogen met BSA beïnvloeden. De oxidatie van tannines veroorzaakt de vorming van zowel intramoleculaire als intermoleculaire bindingen tussen flavonoïden. Dit laatste zorgt ervoor dat de polymeren langer worden en reactiever worden op speekseleiwitten [31]. Dit soort reacties kan namelijk de tanninestructuur wijzigen en daarmee de waterstofbruggen en hydrofobe interacties met eiwitten [32].
Omdat astringentie wordt veroorzaakt door de door tannine geïnduceerde aggregatie en de precipitatie van speekseleiwitten [33], suggereert de toename van BSA-tannines in RHO2 dat de veranderingen
ondergaan door tannines door middel van deze reacties tijdens het ouder worden, zou kunnen bijdragen aan het wijzigen van de perceptie van astringentie.
Vanilline-reactieve flavans (VRF) kunnen in plaats daarvan meer informatie geven over de grootte van gecondenseerde tannines. In feite reageert vanilline met de A-ring van flavanolen op positie 6 of 8, maar ook acetaldehyde reageert met dezelfde posities van de A-ring van flavanolen. Daarom kan een afname van VRF worden beschouwd als een indirecte maatstaf voor de oxidatieve polymerisatie van flavanolen gekoppeld aan reacties veroorzaakt door aceetaldehyde en waarbij tannines en anthocyanines betrokken zijn [34].
In onze studie werd een iets lagere VRF-concentratie waargenomen in het RMO2-monster. Het ontbreken van een duidelijke trend als functie van de zuurstofhoeveelheid kan te wijten zijn aan het feit dat deze moleculen ook hydrolytische splitsing kunnen ondergaan in aanwezigheid van zuurstof door nieuwe moleculaire herschikkingen met de vorming van nieuwe intra- en intermoleculaire bindingen [6].
3. Materialen en methoden
3.1. wijnen
Er werden twee commerciële rode Aglianico- en witte Falanghina-wijnen gebruikt, geproduceerd in Zuid-Italië door de wijnmakerij Cantina del Taburno. Details van de monsters samen met enkele basisparameters worden weergegeven in Tabel 7. Basisparameters werden bepaald volgens het OIV-compendium van internationale methoden voor wijn- en mostanalyse (2007).
3.2. Wijnzuurstofbeheer
Een industrieel systeem ISIOX (Tebaldi srl) uitgerust met een gas-vloeistofmembraancontactor (Liqui-Cel9, Transverse-flow, South Lakes Dr. Charlotte, NC, VS, afgesneden 50 g/mol) en een centrifugaalpomp in roestvrij staal was gebruikt. Het membraan biedt een vaste en welbepaalde interface voor gas/vloeistof-massaoverdracht zonder de ene fase in de andere over te dragen. De structuur van de membraancontactor (hydrofobe holle vezel) is gemaakt van polypropyleen （PP） en biedt een zeer groot contactoppervlak （gas/vloeistof） van 20 m²2.
Het deoxygenatieproces bestaat uit continue cycli waarin N, vacuüm of een combinatie van de eerste twee processen (mix) die circuleert op het ene oppervlak van het polypropyleenmembraan, geleidelijk wordt verrijkt met zuurstof afkomstig van wijn die aan de andere kant van het membraan circuleert. De drijvende kracht voor het proces is het verschil in partiële zuurstofdruk over het membraan. Tijdens het proces circuleert de wijn continu van een gesloten tank naar het deoxygenatie-apparaat.
Om het vereiste zuurstofniveau te bereiken, werd het zuurstofgehalte in de wijn door alle processen gecontroleerd totdat het doelniveau werd bereikt.
De procescontrole werd uitgevoerd door het O-gehalte in wijnen te bewaken met behulp van een pc die is ingebouwd met zeer eenvoudige programmeerlogica en specifieke sensoren, die de temperatuur en het zuurstofgehalte bewaken (luminescentiesysteem, Hach Lange, meetbereik {{{{2} }}} tot 20 mg/LO, resolutie: 0,01 mg/L O2, nauwkeurigheid:0-5mg/LO2±0,1). Om de inlaat- en uitlaatdruk te regelen, werden elektronische drukschakelaars gebruikt, evenals de druk van het gas in het proces en het niveau van een eventueel vacuüm.
Verschillende deoxygenatiebehandelingen werden toegepast op wijn om verschillende monsters met verschillende zuurstofgehaltes te verkrijgen. De hoeveelheid zuurstof in witte wijn was respectievelijk witte High O2, WHO2=2,7 mg/L, witte Medium O2, WMO2=1 mg/L, witte Low O2, WLO2= 0. 25mg/L.
De hoeveelheid zuurstof in rode wijn was respectievelijk rood hoog O, RHO,=1 mg/L, rood Medium O2, RMO2=0.5 mg/L, rood Laag O2, RLO2=0 .2 mg/L. Beide sets wijnen werden gefilterd op 1 m voordat ze in de machine werden geïnjecteerd, met als doel het voorkomen van vervuiling en bevochtiging van het membraan [35].
3.3. Monsters Bottelen en veroudering
Na de behandelingen werden de wijnen gebotteld en werden alle flessen verzegeld met behulp van gecoëxtrudeerde synthetische Nomacorc-sluitingen (Nomacorc SA, Thimister Clermont, België)select green 100, die zuurstof door de kurk laten gaan in een gecontroleerde manier (0,4 mg O2 na 3 maanden, 0,7 mg O, na 6 maanden, 1,2 mg O, na 12 maanden en 1,1 mg O, jaar na het eerste jaar van veroudering). Flessen werden 11 maanden gerijpt op 15 graden.
3.4. Analysemethoden
3.4.1. High-performance vloeistofchromatografie Bepaling van aceetaldehyde
Analyses van aceetaldehyde werden uitgevoerd door experimentele monsterwijn en HPLC te derivatiseren.
De derivatiseringsanalyse was als volgt: 100 L wijnmonster werd in een flesje gedaan, gevolgd door toevoeging van 20 L vers bereide 1,120 mg/L SO, oplossing, 20 L 25 procent zwavelzuur, Carlo Erba-reagens 96 procent ） en 140 μL van 2 g /L2,4-dinitrofenylhydrazine-reagens. Na mengen liet men de oplossing 15 min reageren bij 65 graden en werd daarna prompt afgekoeld tot kamertemperatuur [36].
De gebruikte HPLC was een Shimadzu LC10 ADVP-apparaat (Shimadzu Italië, Milaan, Italië) uitgerust met een SCL-10AVP-systeemcontroller, twee LC-10ADVP-pompen om de benodigde oplosmiddelgradiënt te creëren , een SPD-M 10 AVP-detector en een injectiesysteem vol Rheodyne model 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, VS). De scheiding werd uitgevoerd op een Waters Spherisorb-kolom (C18, Silica-deeltjessubstraat, ODS2 250 x 4,6 mm, 5 urn deeltjesdiameter, 80 A poriegrootte) uitgerust met een bewakingskolom. Optimale efficiëntie van scheiding werd verkregen onder gebruikmaking van een stroomsnelheid van 0,75 ml/min, kolomtemperatuur van 35 graden; mobiele fase oplosmiddelen waren: (A) 0,5 procent mierenzuur (Sigma Aldrich groter dan of gelijk aan 95 procent) in water milli-Q (Sigma Aldrich) en (B) acetonitril (Sigma Aldrich groter dan of gelijk aan 99,9 procent) ; gradiëntelutieprotocol was: 35 procent B tot 60 procent B(t=8min), 60 procent B tot 90 procent B(t=13}min), 90 procent B tot 95 procent B(t{{29) }} min,2-min vasthouden), 95 procent B tot 35 procent B（t=17 min, 4-min vasthouden）, totale looptijd, 21 min, monsters injecties 50μL en de detectie werd uitgevoerd door de absorptiesignalen bij 365 nm te volgen.
The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Drie analytische replica's werden uitgevoerd voor elk experimenteel replicaat.
3.4.2. High-performance vloeistofchromatografieanalyses van anthocyanines
Analyses van inheemse anthocyanines werden uitgevoerd door een HPLC Shimadzu LC10 ADVP-apparaat (Shimadzu Italië, Milaan, Italië) uitgerust met een SCL-10AVP-systeemcontroller, twee LC-10ADVP-pompen om de benodigde oplosmiddelgradiënt te creëren, een SPD-M 10 AVP-detector en een injectiesysteem vol Rheodyne model7725 (Rheodyne, Cotati, CA, VS). Volgens de methode beschreven in het OIV Compendium of International Methods of Analysis of Wine and Musts [37].
De HPLC-oplosmiddelen waren de volgende: oplosmiddel A: water milli-O (Sigma-Aldrich, Milaan, Italië)/mierenzuur (Sigma-Aldrich groter dan of gelijk aan 95 procent)/acetonitril (SigmaAldrich groter dan of gelijk aan 99,9 procent) (87:10:3)/v; oplosmiddel B: water/mierenzuur/acetonitril(40:10:50)o/v. De gradiënt was: nul-tijd-omstandigheden 94 procent A en 6 procent B; na 15 min werden de pompen afgesteld op 70 procent A en 30 procent B, op 30 min op 50 procent A en 50 procent B, op 35 min op 40 procent A en 60 procent B, op 41 min, einde van de analyse, op 94 procent A en 6 procent B. Een her-equilibratietijd van 5 minuten werd toegepast vóór de opeenvolgende analyse zoals gerapporteerd door [38]. De kolom die voor de analyses werd gebruikt, was een water
bolbolkolom（C 18, Silicadeeltjessubstraat, ODS2 250 ×4,6 mm,5 μm deeltjesdiameter, 80 Een poriegrootte） met een voorkolom werd gebruikt. Een hoeveelheid van 50 μL kalibratiestandaarden of wijn werd op de kolom geïnjecteerd. De absorptiesignalen bij 520 nm werden gedetecteerd. De gevoeligheid van de detector was 0,01 Absorptie-eenheden volledige schaal (AUFS). Alle monsters werden door 0,45 um Durapore-membraanfilters (Millipore-Ierland) in glazen flesjes gefiltreerd en onmiddellijk in het HPLC-systeem geïnjecteerd.
De kalibratiecurve werd verkregen door 5 oplossingen (in drievoud) te injecteren die toenemende concentraties malvidine-3-monoglucoside bevatten (Extrasynthese, Lyon, Frankrijk). De kalibratie werd gekenmerkt door een correlatiecoëfficiënt (R')=0.996. Het lineariteitsbereik van de kalibratiecurve was 2-200 mg/L. De nauwkeurigheid van de gebruikte methode werd getest door zes herhalingsanalyses van een rode wijnmonster dat 118,4 mg/L totale monomere anthocyanines bevatte. De variatiecoëfficiënt was opgenomen tussen 1,1 procent (voor malvidine 3-monoglucoside) en 9,1 procent (voor malvidine 3-(6II-coumaroyl)-glucoside) en toonde de goede reproduceerbaarheid van de HPLC-analyse aan. De concentraties van monomere anthocyanines werden uitgedrukt als mg/L malvidine-3-monoglucoside.
Fractionering van RLO2-, RMO2- en RHO2-wijnen werd uitgevoerd volgens de OIV-analysemethode door gebruik te maken van dezelfde HPLC Shimadzu LC10 ADVP als hierboven vermeld. Drie analytische replica's werden uitgevoerd voor elk experimenteel replicaat.
3.4.3. Hoge resolutie Electrospray Ionization Mass Spectrometry (HR ESIMS) analyses van rode wijnen
De HPLC-scheiding van rode wijn uitgevoerd zoals hierboven beschreven leverde drie fracties voor elke wijn op. De eerste fractie werd verzameld van 15 tot 25 min (fractie 1), de tweede van 25 tot 30 min (fractie 2) en de derde fractie (fractie 3) van 30 min tot het einde van de chromatografische hardlopen (45 minuten). Elke verzamelde fractie werd gedroogd, opgelost in methanol en geanalyseerd door HR-ESIMS in continue stroominjectie in de positieve ionenmodus. HR ESIMS-experimenten werden uitgevoerd op een Agilent 1260 Infinity IⅡ HPLCquaternair systeem gekoppeld aan een lineaire ionenval LTQOrbitrap XL hybride Fourier-transformatie MS (FTMS)-instrument uitgerust met een ESI ION MAX-bron (Thermo-Fisher). De volgende broninstellingen zijn gebruikt (massabereik m/z 100-2000): spuitspanning 4,5 kV, capillaire temperatuur 300 graden, capillaire spanning 15 V, mantelgas 20 en hulpgas 21 (willekeurige eenheden), buislensspanning 140 V en 25 procent botsingsenergie. Berekening van elementaire formules werd uitgevoerd met behulp van Xcalibur-software v 2.0.7 met een massatolerantiebeperking van 5 ppm.
3.4.4. NMR-experimenten
Een hoeveelheid van 2 ml van elk wijnmonster (RHO2, RMO2 en RLO2) werd gevriesdroogd en opgelost in 700 L CDOD（6H 3,31;5c49.0ppm）. NMR-experimenten werden uitgevoerd op een Varian Unity Inova 700-spectrometer uitgerust met een 13C Enhanced HCN Cold Probe en met behulp van Shigemi 5 mm NMR-buizen. De H-NMR-standaard Varian-pulssequentie werd gebruikt.
3.4.5.Standaard chemische analyses en spectrofotometrische metingen
Volgens "OIV Compendium of International Wine and Must Analysis of Wine and Musts Analysis 2007" [37], standaard chemische analyse (alcoholgehalte berekend op basis van volume, reducerende suiker, totale zuurgraad, pH, vluchtige zuren, appelzuur en totale droge stof ) was gemeten.
Spectrofotometrische analyses werden uitgevoerd door een Jenway 7305 spectrofotometer. Chromatische kenmerken, kleurintensiteit en tint werden bepaald volgens de OIV-methoden [37]. De kleurintensiteit werd bepaald als de som van abs 420 nm, abs 520 nm en abs 620 nm, en tint als de verhouding abs 420 nm/abs 520 nm.
BSA-reactieve tannines, korte polymere pigmenten (SPP), grote polymere pigmenten (LPP) en totale fenolen werden bepaald door de Harbertson et al. bepaling [22]. Korte polymere pigmenten (SPP) en grote polymere pigmenten (LPP) werden verkregen door analyse van supernatant verkregen na eiwitprecipitatie te combineren met behulp van runderserumalbumine BSA
(Sigma-Aldrich) met het bisulfietbleken van pigmenten in wijn. BSA-tanninecomplex in de pellet werd opnieuw opgelost, er werd ijzerchloride aan toegevoegd en afgelezen bij 510 nm. Het totaal aan fenolen werd gekwantificeerd door bij 510 nm het monster als volgt af te lezen: 50 L wijn werd toegevoegd aan 825 L buffer C en afgelezen op de spectrofotometer als een blanco oplossing. Na de toevoeging van 125 L ferrichloride werd het monster opnieuw afgelezen om de hoeveelheid ijzer-reactieve fenolen te kwantificeren.
Vanilline-reactieve flavans (VRF) werden bepaald volgens Gambuti et al. [39]. In het kort werd 750 L van een oplossing van vanilline （4 procent in methanol） toegevoegd aan 125 μL verdunde wijn en na 5 min werd 375 μL geconcentreerd zoutzuur toegevoegd. Na een 15-min incubatie van het mengsel bij 20 graden werd de absorptie bepaald bij 500 nm en afgelezen tegen een blanco oplossing waarin pure methanol werd gebruikt in plaats van de oplossing van vanilline. Concentraties werden berekend als (plus)-catechine (mg/L).
3.4.6. Statistische analyse
Kwantitatieve gegevens werden vergeleken met behulp van Tukey's minst significante verschillen procedure, alle variantie resulteerde homogeen. Wanneer de varianties niet homogeen waren, werden de gegevens geanalyseerd met behulp van de Kruskal-Wallis-test. Wanneer de resultaten van de Kruskal-Wallis-test significant waren (p<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">
4. Conclusies
De resultaten van deze studie bevestigden dat verschillende zuurstofgehaltes in gebottelde wijn een invloed hebben op de veroudering en oxidatie van wijn.
Het zuurstofbeheer in de Aglianico-wijn door middel van een polypropyleen holle vezelmembraan aannemer bepaalde, na 11 maanden rijping, een lager gehalte aan vrij en totaal SO2 in het monster met een hoger gehalte aan opgeloste zuurstof. Hetzelfde gedrag werd waargenomen in de Falanghina-wijn met een toename van het aceetaldehyde in het monster met hogere zuurstofniveaus.
Met betrekking tot fenolische verbindingen werd een groter verlies van totale natuurlijke anthocyanines waargenomen in rode wijnen. Hun gehalte was hoger in de wijn met een lagere zuurstofconcentratie. Het verlies van totale inheemse anthocyanines had echter geen invloed op de kleurparameters van wijnen, zoals kleurintensiteit en tonaliteit.
BSA-reactieve tannines en vanilline-reactieve flavans waren lager in monsters met een gemiddeld en laag zuurstofgehalte in vergelijking met de monsters met een hoger zuurstofgehalte. Dit komt door het feit dat zuurstof, door deel te nemen aan oxidatiereacties, meewerkt aan de vorming van polymere pigmenten. Zoals verwacht waren in rode wijnen met het hoogste gehalte aan opgeloste zuurstof na de behandeling met de membraancontactor Vitisine B, ethylideen-gebrugde dimeren en acetaldehyde meer aanwezig in vergelijking met wijnen die behandeld werden met een lager zuurstofgehalte in de pre-bottelfase .
Concluderend, het deoxygeneren van wijn door membraanaannemers zou een geschikte techniek kunnen zijn voor de wijnindustrie om al die oxidatieve verschijnselen te voorkomen die de uiteindelijke kwaliteit van rode en witte wijn zouden kunnen veranderen en die het gehalte aan zwaveldioxide en aceetaldehyde beïnvloeden (vooral in witte wijnen) . Desalniettemin moeten oenologen er rekening mee houden dat de afname van het zuurstofgehalte de kleurstabiliteit van rode wijnen kan beïnvloeden.
Aanvullende materialen: De volgende zijn online beschikbaar. Figuur S1: Uitbreidingen van H-NMR-spectra van wijnen RHO, RMO2 en RLO, geregistreerd in CD: OD. Figuur S2: Structuur van malvidine 3-O-glucoside en relatieve HR ESIMS in de positieve ionenmodus. Figuur S3: Structuur van Vitisin B en relatieve HR ESIMS in de positieve ionenmodus. Figuur S4: Structuur van ethylideen-gebrugd dimeer bestaande uit één eenheid malvidine 3-O-glucoside (onder) en één eenheid (epi) catechine (boven) met de relatieve HR ESIMS in de positieve ionenmodus. Figuur S5: Structuur van een ethylideen-gebrugd dimeer bestaande uit twee eenheden malvidine 3-O-glucoside, waarvan de onderste in zijn flavyliumvorm en die bovenaan in zijn pseudo-basevorm, samen met de relatieve HR ESIMS in positieve ionenmodus.
Referenties
1. Waterhuis, AL; Laurie, VF Oxidatie van wijnfenolen: een kritische evaluatie en hypothesen. Ben. J. Enol. Vitisch. 2006, 57, 306-313.
2. Danilewicz, JC Mechanisme van auto-oxidatie van polyfenolen en deelname van sulfiet in wijn: sleutelrol van ijzer. Ben. J. Enol. Vitisch. 2011, 62, 319-328. [Kruisref]
3. Nikolantonaki, M.; Waterhouse, AL Een methode om chinonreactiesnelheden te kwantificeren met wijnrelevante nucleofielen: een sleutel tot het begrip van het oxidatieve verlies van thiolen van rassen. J. Agric. Voedsel Chem. 2012, 60, 8484-8491. [CrossRef] [PubMed]
4. Elias, RJ; Andersen, ML; Skibted, LH; Waterhouse, AL Identificatie van vrije radicalen tussenproducten in geoxideerde wijn met behulp van elektronen paramagnetische resonantie spin trapping. J. Agric. Voedsel Chem. 2009, 57, 4359-4365. [CrossRef] [PubMed]
5. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AM Oxidatiemechanismen die voorkomen in wijnen. Voedsel res. Int. 2011, 44, 1115-1126. [Kruisref]
6. Mouls, L.; Fulcrand, H. UPLC-ESI-MS-studie van de oxidatiemarkers die vrijkomen bij tanninedepolymerisatie: naar een betere karakterisering van de tannine-evolutie over voedsel- en drankverwerking. J. Massaspectrum. 2012, 47, 1450-1457. [CrossRef] [PubMed]
7. Waterhouse, AL Wijnfenolen. Ann. NY Acad. Wetenschap. 2002, 957, 21-36. [Kruisref]
8. Rosenfeld, E.; Schaeffer, J.; Beauvoir, B.; Zalm, JM Isolatie en eigenschappen van pro mitochondriën van anaërobe stationaire fase gistcellen. Antonie Van Leeuwenhoek 2004, 85, 9-21. [Kruisref]
9. Jarauta, I.; Cacho, J.; Ferreira, V. Gelijktijdige verschijnselen die bijdragen aan de vorming van het aroma van wijn tijdens veroudering in eikenhout: een analytische studie. J. Agric. Voedsel Chem. 2005, 53, 4166-4177. [Kruisref]
10. Singleton, VL; Trousdale, E.; Zaya, J. Oxidatie van wijnen. 1. Jonge witte wijnen die periodiek aan de lucht worden blootgesteld. Ben. J. Enol. Vitisch. 1979, 30, 49-54.
