De weg naar vooruitgang in preklinisch onderzoek naar leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten: een perspectief op knaagdier- en HiPSC-afgeleide modellen, deel 3

Vergelijkbare benaderingen van virale vectoren zijn beoordeeld in verschillende modellen van Parkinson, waarbij bij de vroegste uitvoeringen gebruik werd gemaakt van AAV2/2 of LV's. Deze vectoren, geïnjecteerd in de hersenen van volwassen ratten, werden gebruikt om WT-, A30P- of A53T-mutanten van menselijke a-syn voor ziekte af te leveren. inductie.

De relatie tussen virussen en geheugen kan voor veel mensen negatief lijken, omdat virussen vaak lichamelijk ongemak en ziekte veroorzaken. Virussen kunnen echter ook een positief effect hebben op het verbeteren van het geheugen, vooral omdat virusaanvallen de activiteit van het immuunsysteem kunnen bevorderen.

Studies hebben aangetoond dat virale aanvallen ervoor kunnen zorgen dat het immuunsysteem van het lichaam reageert, waardoor de weerstand van het lichaam tegen virussen wordt verbeterd. Deze reactie van het immuunsysteem omvat het verhogen van het aantal geproduceerde witte bloedcellen en andere immuuncellen, evenals de productie van antilichamen. Deze reacties helpen het lichaam niet alleen om virale invasie te weerstaan, maar helpen ook de functie van het immuunsysteem te versterken en de algehele gezondheid van het lichaam te verbeteren.

Virale aanvallen activeren ook immuuncellen in de hersenen. Deze immuuncellen kunnen afval en beschadigde cellen uit de hersenen verwijderen, de functie van het zenuwstelsel verbeteren en de overdracht van informatie en geheugenverwerking bevorderen. Studies hebben ook aangetoond dat mensen met bepaalde virale infecties beter kunnen presteren bij het omgaan met geheugentaken.

Bovendien hebben sommige onderzoeken aangetoond dat bepaalde virussen het lichaam kunnen stimuleren om van de hersenen afkomstige neurotrofe factor (BDNF) te produceren, een stof die de groei en ontwikkeling van neuronen bevordert. Deze stof heeft een positief effect op de hersenfunctie en kan lichamelijk herstel en geheugenverbetering bevorderen.

Natuurlijk moeten we in de strijd tegen het virus de juiste aanpak en strategie volgen, goede hygiënische gewoonten aanhouden en voldoende slaap en lichaamsbeweging krijgen, zodat ons immuunsysteem in de beste conditie verkeert. Kortom, hoewel het virus ons lichamelijk ongemak kan bezorgen, zijn er steeds meer aanwijzingen dat het ook de activiteit van het immuunsysteem kan bevorderen en een positieve invloed kan hebben op onze gezondheid en ons geheugen. Het is duidelijk dat we ons geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan ons geheugen aanzienlijk verbeteren omdat Cistanche ook de balans van neurotransmitters kan reguleren, zoals het verhogen van de niveaus van acetylcholine en groeifactoren, die erg belangrijk zijn voor het geheugen en het leren. Bovendien kan Cistanche ook de bloedstroom verbeteren en de zuurstoftoevoer bevorderen, wat ervoor kan zorgen dat de hersenen voldoende voeding en energie krijgen, waardoor de vitaliteit en het uithoudingsvermogen van de hersenen worden verbeterd.

Klik op supplementen kennen om het geheugen te verbeteren

De auteurs hebben een efficiënte expressie van a-syn in nigrale DA-neuronen aangetoond, vergezeld van moleculaire en cellulaire pathologieën en nigrale DA-degeneratie die zich geleidelijk in de loop van de tijd ontwikkelde.

Desalniettemin vertoonde de eerste generatie rAAV2/2-vectoren die in deze onderzoeken werden gebruikt progressief neuronaal verlies, hoewel de neurodegeneratie van de tyrosine-hydroxylase-positieve neuronen, evenals het tijdsverloop, behoorlijk variabel was (25% -80% en 6 weken tot 1 jaar). respectievelijk).123,124

Daarentegen waren LV's die coderen voor WT-, A30P- of A53T-gemuteerde a-syn in staat neuronaal celverlies bij ratten te induceren op een meer vertraagde en meer consistente manier (respectievelijk 25% -40% en 5 maanden).126 Beide onderzoeken hebben aangetoond een progressief verlies van de lengte van de neurieten en gezwollen perikarya in de resterende DA-neuronen.

Bovendien werden enorme cytoplasmatische accumulaties van a-syn gevonden in zowel cellichamen als neurieten. Deze resultaten zijn onlangs herhaald in meerdere onderzoeken waarbij gebruik werd gemaakt van beide virale platforms.127-131

LV's zijn ook gebruikt in een verscheidenheid aan PD-modellen van muizen. Lauwers en collega's125 toonden bijvoorbeeld aan dat injectie van LV met de WT- of A30P-mutant van a-syn in het striatum, de amygdala of SN van muizen in staat was neurodegeneratieve veranderingen geassocieerd met Parkinson op een tijdsafhankelijke manier te induceren en een onafhankelijke neuritische vergroting omvatte. en cytoplasmatische insluitsels.

Verder toonde deze studie aan dat nigale overexpressie van A30P-a-syn resulteerde in ongeveer 25% celverlies na 10-12 maanden.125 De levering van A30P, E57K en E35K aan de SN van de rat met behulp van LV toonde een vergelijkbare mate aan in DA-neuronen. verlies (ongeveer 50%) vergeleken met de WT (30%), terwijl de snellere fibrilvormende mutant A53T die in hetzelfde onderzoek werd gebruikt geen significante afname in het aantal DA-cellen vertoonde.

Interessant genoeg leken de algemene neuropathologische kenmerken die werden waargenomen bij muizen (dwz het begin en de ernst) minder ernstig vergeleken met die bij ratten, hoewel deze verschillen een artefact kunnen zijn van de virale zuiverheid of productietiters van het geïnjecteerde virus en/of andere gerelateerde technische discrepanties.

Belangrijke overwegingen voor AD- en PD-virale vectormodellen

De ontwikkeling van nieuwe serotypen, waaronder AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ en DJ8, heeft de cellulaire doelwitten verbreed en de efficiëntie van de AAV-transductie verbeterd.

De AAV's die met deze nieuwe capsiden zijn geserotypeerd, zijn getest bij ratten en niet-menselijke primaten om a-syn tot overexpressie te brengen.132–137 Overexpressie van de S129A-vorm geleverd via AAV2/5 en AAV2/6 vertoont consequent verhoogde toxiciteit in het neurodegeneratieproces.134,138

Deze experimenten toonden ook aan dat een zorgvuldige dosering van het overexpressie-transgen cruciaal is, omdat zelfs controlevectoren die alleen fluorescerende reporters dragen die in hoge titers worden afgeleverd, niet-specifieke toxische effecten kunnen aantonen.135

Met dit voorbehoud moet zorgvuldig rekening worden gehouden bij het ontwerpen van reddingsexperimenten op basis van AAV. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat het therapeutische AAV dat klein interfererend RNA (siRNA) herbergt dat zich richt op SNCA, resulteerde in een hoog niveau van toxiciteit en een aanzienlijk verlies van nigrostriatale DA-neuronen veroorzaakte. Deze studie benadrukte verder de beperkingen van AAV-toepassingen in dierstudies.

Het kan echter niet worden uitgesloten dat de neurotoxiciteit werd veroorzaakt door de robuuste reductie van SNCA-niveaus in rattenmodellen; asa-syn speelt een cruciale biochemische rol in DA-neuronen, en de robuuste reductie ervan zou de levensvatbaarheid van de cellen kunnen verminderen.139 Alles bij elkaar genomen onderstreept dit het belang van het ontwikkelen van een hulpmiddel voor het verfijnen van de expressie van ziekte-geassocieerde genen voor het ontwerpen van gentherapiebenaderingen.

In dit opzicht zou het recentere op CRISPR-dCas9-gebaseerde systeem wellicht een voordeliger systeem kunnen zijn voor het moduleren van genexpressie op een precieze en verfijnde manier.

Langs deze lijn hebben we onlangs het LV-CRISPR-Cas9-systeem ontwikkeld om een ​​nauwkeurige en verfijnde regulatie van SNCA-genexpressie te bereiken. De studie leverde proof-of-concept dat de manipulatie van genexpressie (bijvoorbeeld het omkeren van overexpressie) door middel van epigenoombewerking een waardevolle therapeutische strategie is voor neurologische aandoeningen, zoals Parkinson,140 veroorzaakt door ontregeling van genen.

Als zodanig vertonen de virale vector-PD-modellen die LV en AAV gebruiken voor de overexpressie van a-syn-eiwit PD-pathologie geassocieerd met DA-neurodegeneratie, en het gebruik van nieuwe AAV-serotypen verbetert de a-syn-expressie in DA-neuronen vergeleken met AAV2/2.

Over het algemeen zijn zowel AAV's als LV's in staat transgenexpressie te induceren en vertonen ze een hoog niveau van tropisme voor DA-neuronen, resulterend in vergelijkbare niveaus van neurodegeneratie. Verdere verbetering van deze virale systemen zal nodig zijn om een ​​langzame progressie van de cellulaire Parkinson-fenotypes en relatief lage niveaus van gedragsstoornissen te omzeilen.

In vitro celcultuurmodellen Overzicht van huidige in vitro AD- en PD-modellen: beperkingen en kansen

In de afgelopen veertig jaar is een verscheidenheid aan AD- en Parkinson-in-vitromodellen ontwikkeld om de interacties tussen sleutelaspecten van hun relatieve ziektepathofysiologie te onderzoeken, en vervolgens gebruikt voor preklinische therapeutische screening.

De huidige in vitro modellen voor AD en PD zijn primair gericht op het recapituleren van kenmerken van moleculaire en cellulaire ziekten, zoals mitochondriale disfunctie, oxidatieve stress, celoverleving en de aanwezigheid van intracellulaire en/of extracellulaire eiwitaggregaten. De meest prominente en meest gebruikte cellulaire modellen van AD zijn bijvoorbeeld gebaseerd op inductie van Ab4042-aggregaten of tau-hyperfosforylering en -aggregatie141,142 (Tabel 1).

Op vergelijkbare wijze zijn in vitro-modellen van de ziekte van Parkinson gebaseerd op de bovengenoemde door toxine geïnduceerde mitochondriale disfunctie (bijv. MPTP, rotenon, paraquat, 6-OHDA) en verstoorde proteostase (bijv. thapsigargin, ionomycine, tunicamycine), overexpressie van a-syn en expressie van de gemuteerde PD familiale genen (bijv. a-syn, Parkin, PINK1)92 (Tabel 2).

Hoewel deze celcultuurmodellen van onschatbare waarde zijn geweest bij het vergroten van ons begrip van de relevante neurobiologie, hebben ze nog niet geresulteerd in levensvatbare DMT's gericht op preventie, het uitstellen van het begin of het vertragen van de ziekteprogressie, waardoor hun relevantie en translationele validiteit in twijfel worden getrokken.

Het is belangrijk om verschillende duidelijke beperkingen in deze modellen te onderkennen om de huidige preklinische praktijken te verbeteren.

Modellen die zijn gebaseerd op overexpressie en knock-out/down van relevante ziekte-geassocieerde genen zijn bijvoorbeeld notoir variabel in de kwantitatieve veranderingen in eiwitniveaus en de methoden die worden gebruikt om veranderingen in genexpressie te induceren (dat wil zeggen, door virussen gemedieerde, op voortplanting gebaseerde, constitutieve of voorbijgaande expressie). dat kan leiden tot tegenstrijdige gegevens en gevolgtrekkingen.92

Dit gebrek aan consistentie bij het opwekken van ziektegerelateerde fenotypen introduceert een voorbehoud bij preklinische onderzoeken waarbij deze modellen worden gebruikt om potentiële DMT's te testen. Bovendien duidt de variabiliteit in cellulaire fenotypes en methodologie waargenomen in preklinische NDD-modellen (bijvoorbeeld de verandering van de vouw van overexpressie of knockdown van eiwitten) sterk op een grotere genetische heterogeniteit die niet volledig kan worden onderzocht in de huidige celmodellen.

Dit wordt verder gecompliceerd door de prevalentie van celmodellen gebaseerd op genetische varianten geïdentificeerd in familiale cohorten, ondanks familiale varianten die een kleine minderheid vertegenwoordigen van de totale NDD-gevallen.109,143

Vanwege de blootgelegde genetische oorzaken blijft het moeilijk om sporadische NDD-cohorten of ziektesubtypen met niet-Mendeliaanse genetica nauwkeurig weer te geven in preklinische modellen, waardoor een aanzienlijke barrière ontstaat bij het ophelderen van relevante ziektemechanismen, het identificeren van potentiële therapeutische doelen en de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Gezien deze uitdagingen zijn onderzoekers genoodzaakt deze modellen te evalueren om gebieden voor verbetering te identificeren en de kansen te beoordelen die nieuwe celcultuurtechnieken bieden.

De afgelopen jaren hebben we voortgebouwd op deze modellen, door nieuwe technologie voor het bewerken van genen te integreren en belangrijke genetische ziekteassociaties verkregen in GWAS's te evalueren in verbeterde weefselkweekmodellen.144,145

De toegenomen integratie van hiPSC-technologie vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang op het gebied van NDD in vitro-modellering en biedt voorheen niet-beschikbare mogelijkheden om ziekterelevante celtypen afkomstig van patiënten te gebruiken om ziektepathogenese in de context van het menselijk genoom te onderzoeken.

Het volledige spectrum van voordelen en beperkingen van van hiPSC afgeleide NDD-modellen, vooral die over AD en PD, worden in de volgende sectie volledig onderzocht.

Van hipsc afgeleide modellen van NDD's: veelzijdig en genetisch "trouw"

Moderne ontwikkelingen op het gebied van celcultuurtechnologie vertegenwoordigen een van de meest opwindende doorbraken in het onderzoek naar NDD’s, en bieden mogelijkheden voor verbeterde ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde.

Tot voor kort werd postmortem hersenonderzoek beschouwd als het gouden standaard, op mensen gebaseerde biologische materiaal voor het verkrijgen van inzichten in pathologische processen van menselijke neurodegeneratieve aandoeningen.

Moderne stamceltechnologieën, waaronder de analyse van patiëntspecifieke neuronen en gliacellen, hebben echter nieuwe wegen geopend voor het onderzoeken van de pathologische mechanismen van NDD’s en worden steeds vaker ingezet bij de moleculaire dissectie van NDD’s met verhoogde genetische complexiteit, zoals AD en PD.

Door middel van een eenvoudige, niet-invasieve biopsie van huidmonsters van patiënten, naast een verscheidenheid aan alternatieve biologische monsters, stelt het genereren van hiPSC's onderzoekers in staat moleculaire paden en ziektemechanismen te onthullen die ten grondslag liggen aan NDD's op een manier die onmogelijk was met eerdere celcultuurmethoden.

Op dit moment zijn de meest voorkomende donorcellen fibroblasten, die worden gebruikt in meer dan 80% van alle gepubliceerde herprogrammeringsexperimenten;146 hiPSC’s kunnen echter worden verkregen uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder stamcellen uit embryonale stamcellen, navelstrengbloed, epitheelcellen van het hoornvlies, en bloedcellen, zoals mononucleaire cellen uit het perifere bloed (Figuur 1).

Bijgevolg vertegenwoordigen van hiPSC afgeleide modellen een veelzijdig alternatief voor bestaande cellulaire ziektemodellen en worden ze verkregen uit somatische weefsels van patiënten die tot pluripotentie worden gedwongen door het gebruik van een verscheidenheid aan herprogrammeringsinstrumenten, zoals plasmiden, vectoren (bijv. episomale) en virale transductie (bijv. , adenovirus, Sendai-virus, lentivirus-methoden worden uitvoerig besproken in Brouweret al.150 en Malik en Rao151).

Deze cellen zijn zelfvernieuwend en bieden een alternatief voor embryonale stamcellen (ESC's), die gepaard gaan met ethische overwegingen en sociale zorgen. Er zijn momenteel verschillende hiPSC-opslagplaatsen die hiPSC-lijnen verzamelen en distribueren die zijn afgeleid van patiënten met NDD's en op gezondheidsleeftijd afgestemde controles om monsters te centraliseren en deze direct beschikbaar te maken voor onderzoekers (Tabel S2).

Een van de belangrijkste toepassingen van hiPSC's is de differentiatie in specifieke celtypen, die vervolgens in een verscheidenheid aan biologische contexten zijn gebruikt, waaronder onderzoeken naar neurologische ontwikkeling en neurodegeneratie, ex vivo transplantatie, ziektemodellering, doelvalidatie en de ontdekking van geneesmiddelen.

Tot op heden zijn er verschillende cellulaire differentiatieprotocollen ontwikkeld die niet alleen generieke neuronen genereren, maar ook specifieke neuronale celtypepopulaties, waaronder prikkelende, cholinerge, DA's en remmende GABAergische neuronen.156-158 Een verscheidenheid aan specifieke gliale subpopulatiecellen is ook afgeleid van hiPSC's, inclusief astrocyten, 159–161 oligodendrocyten, 162,163 en microglia. 164–166

Verschillende nieuwe technieken voor het bewerken van genen, waaronder CRISPR-Cas9, zinkvingernucleasen (ZFN) en transcriptie-activatorachtige effectornucleasen (TALENS), introduceerden een extra dimensie aan het van hiPSC afgeleide systeem: het creëren van isogene modellen die dezelfde genetische achtergrond bezitten. en verschillen alleen in de gekozen mutatie.167

De diversiteit aan celdifferentiatieprotocollen heeft mechanistische studies vergemakkelijkt, en de beschikbaarheid van isogene lijnen heeft genetische analyses van genfunctie en de pathogene rol ervan bij NDD's ondersteund. Van hiPSC afgeleide modellen zijn geschikt voor deze onderzoeken, omdat ze belangrijke ziektegerelateerde kenmerken vertonen.

Bijvoorbeeld, van fAD en sAD afgeleide hiPSC-neuronale modellen met PS1- en PS2-mutaties (respectievelijk A246E en N14II) en APP-duplicatiemutatie169 vertonen belangrijke AD-biochemische kenmerken, waaronder Ab-secretie, verhoogde Ab42: Ab40-ratio en verhoogd hypergefosforyleerd tau.

Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van hiPSC-modellen die Ab-gerelateerde fenotypen genereren een nauwkeuriger middel is om de rol van Ab-expressie bij AD-neurodegeneratie te onderzoeken in vergelijking met traditionele ectopische expressiemodellen of modellen die aanvulling en/of inductie van Ab-aggregaten vereisen, aangezien deze nemen de "natuurlijke" voorkomende pathologische processen over die verband houden met Ab-afzettingen.

For more information:1950477648nn@gmail.com