Het programma van nierfibrogenese wordt gecontroleerd door microRNA's die het oxidatieve metabolisme reguleren

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc, d

Santiago Lamesa,**

een programma van fysiologische en pathologische processen, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Spanje

b Genomic Facility, Parque Científico de Madrid, Madrid, Spanje

c Afdeling Pathologie, Hospital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Spanje

d Afdeling Geneeskunde en Medische Specialiteiten, Onderzoeksstichting van het Universitair Ziekenhuis "Principe de Asturias", IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Spanje

Trefwoorden: MicroRNAS, Nierfibrose, Vetzuuroxidatie, Extracellulaire matrix, CPT1A, Mitochondriën

cistanche bodybuilding is erg goed voor de nierfunctie

A B S T R A C T

Overmatige accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) is het kenmerk van fibrotische ziekten. In de nieren is het de laatste gemeenschappelijke route van veel voorkomende ziekten, wat leidt tot chronisch nierfalen. Hoewel cytokinen zoals TGF- een fundamentele rol spelen bij de transformatie van myofibroblasten, heeft recent werk aangetoond dat mitochondriale disfunctie en defecte vetzuuroxidatie (FAO), die de belangrijkste energiebron voor tubulaire epitheelcellen van de nier in gevaar brengen, fundamentele bijdragen leveren. tot de ontwikkeling en progressie van nierfibrose. Van microRNA's (miRNA's), die de genexpressie post-transcriptioneel reguleren, is gemeld dat ze de nierfibrogenese regelen. Om miRNA's te identificeren die betrokken zijn bij de metabole verstoring van nierfibrose, hebben we een miRNA-arrayscherm uitgevoerd in het muismodel van unilaterale ureterale obstructie (UUO). MiR-150-5p en miR-495-3p werden geselecteerd vanwege hun verband met menselijke pathologie, hun rol in het mitochondriale metabolisme en hun targeting van het vetzuur-shuttling-enzym CPT1A. We vonden een 2- en 4-voudige opregulatie van respectievelijk miR-150-5p en miR-495-5p in zowel de UUO- als de foliumzuur-geïnduceerde nefropathie (FAN)-modellen , terwijl TGF- 1 hun expressies opreguleerde in de menselijke niertubulaire epitheelcellijn HKC-8. Deze miRNA's synergiseerden met TGF- met betrekking tot het pro-fibrotische effect door de fibrose-geassocieerde markers Acta2, Col1 1 en Fn1 te versterken. Bio-energetische studies toonden een verlaging van de FAO-geassocieerde zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) in HKC-8-cellen in aanwezigheid van beide miRNA's. Consistent werden de expressieniveaus van hun mitochondriaal-gerelateerde doelwitgenen CPT1A, PGC1 en de mitochondriale transcriptiefactor A (TFAM) met de helft verminderd in nierepitheelcellen die aan deze miRNA's waren blootgesteld. Daarentegen hebben we geen veranderingen in mitochondriale massa en transmembraanpotentiaal (ΔѰm) of mitochondriale superoxide-radicaal-anionproductie gedetecteerd. Onze gegevens ondersteunen dat miR-150 en miR- 495 kunnen bijdragen aan renale fibrogenese door het metabolische falen te verergeren dat kritisch betrokken is bij tubulaire epitheelcellen, wat uiteindelijk leidt tot fibrose.

1. Inleiding

Chronische nierziekte (CKD) is een klinische aandoening waarbij de vermindering van de nierfunctie wordt gehandhaafd. Het wordt over het algemeen als onomkeerbaar en progressief beschouwd. Het vertegenwoordigt een belangrijk volksgezondheidsprobleem dat 12-14 procent van de algemene bevolking kan treffen [1]. Het kan aanwezig zijn bij ongeveer 30-40 procent van de patiënten met veel voorkomende pathologieën zoals diabetes mellitus en hypertensie, waar het bijdraagt ​​​​aan het dicteren van evolutie en prognose. Ongeacht de etiologie van de ziekte leidt progressie van CKD tot tubulus-interstitiële en glomerulaire fibrose [2]. Tubulo-interstitiële fibrose omvat de uitbreiding van de ruimte tussen het tubulaire basaalmembraan en peritubulaire capillairen door de afzetting van matrixeiwitten (ECM) (voornamelijk collageen type I en III en fibronectine) in combinatie met ontstekingscellen, tubulair celverlies en myofibroblastaccumulatie [3].

Transforming growth factor- (TGF-) wordt beschouwd als een cruciale alomtegenwoordige pro-fibrotische cytokine en de hoofdregulator van myofibroblastdifferentiatie bij fibrose [4]. Recente studies hebben aangetoond dat een globaal defect in vetzuuroxidatie (FAO), leidend tot een compromis in de belangrijkste energiebron voor tubulaire epitheelcellen, een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van nierfibrose [5,6]. TGF- onderdrukt FAO op een SMAD3- en PGC1A-afhankelijke manier, en beïnvloedt daardoor de transcriptionele regulatoren van vetzuuropname en oxidatie, waaronder CPT1A [5]. Veranderingen in FAO resulteren uiteindelijk in intracellulaire lipidenaccumulatie en ATP-uitputting, wat leidt tot fibrose [5,7]. Strategieën die gericht zijn op het herstellen van de metabole stoornis die werkzaam zijn bij CKD, kunnen dus therapeutische opties bieden [8].

MicroRNA's (miRNA's) zijn naar voren gekomen als kritische regulatoren van genexpressie door hun actie op posttranscriptionele regulatie. In de nieren is aangetoond dat miR's een cruciale rol spelen bij nefrogenese, homeostase en ziekte [9]. MiRNA's zijn ook in staat om fibrotische processen te reguleren en worden "fibrose" genoemd [10]. Bovendien, vanwege het ontbreken van een effectieve therapie om nierfibrogenese te voorkomen of terug te draaien [11], is manipulatie van miRNA-expressie door in vivo levering van miRNA-nabootsers of -remmers voorgesteld als een veelbelovende therapeutische strategie voor CKD [12]. Bovendien kunnen circulerende miRNA's diagnostische en zelfs prognostische biomarkers vormen [13].

MiRNA-gemedieerde controle van nierfibrose vindt voornamelijk plaats door de regulatie van TGF- 1-signalering op een celafhankelijke en contextafhankelijke manier, waarbij de Smad-route als een van de belangrijkste doelen wordt gebruikt [14]. In eerder werk hebben we verschillende miRNA's geïdentificeerd die een impact hebben op nierfibrose door specifieke metabole routes te reguleren [15,16]. Overexpressie van miR-9-5p voorkomt dedifferentiatie van tubulaire epitheliale niercellen en herprogrammeert fibrose-gerelateerde metabole stoornis [16], terwijl functieverlies van miR-33, hetzij genetisch of farmacologisch, resulteert in verhoogde FAO en preventie van lipidenophoping in tubulaire epitheelcellen. Dit wordt geassocieerd met een verhoogde energievoorziening, verbeterde mitochondriale bio-energetica en de preventie van experimentele nierfibrose [15]. Dus miRNA's die cellulaire bio-energetica reguleren, zijn ook in staat om renale fibrogenese te reguleren. In deze studie hebben we een op miRNA-array gebaseerde strategie gebruikt in het unilaterale ureterale obstructie (UUO) chronische nierbeschadigingsmodel om miRNA's te identificeren die betrokken zijn bij het renale fibrotische fenotype door de wijziging van metabole routes. Door verschillende mitochondriale functiegerelateerde genen (CPT1A, TFAM, PGC1A) te selecteren, hebben we zowel miR-150 als miR-495 geïdentificeerd als miRNA's die in staat zijn om de FAO-geassocieerde zuurstofverbruiksnelheid (OCR) te verlagen en TGF te bevorderen{ {21}}geïnduceerde fibrogene transformatie in de menselijke niertubulaire epitheelcellijn HKC-8. Onze bevindingen benadrukken het belang van miRNA's als mitochondriale metabole regulatoren die betrokken zijn bij renale fibrogenese.

2. Materiaal en methoden

Cellijnen en kweekomstandigheden. Menselijke renale proximale tubulaire epitheelcellen (HKC-8) werden gekweekt in DMEM/F12 (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) aangevuld met 15 mM HEPES, 5 procent (vol/vol) foetaal runderserum (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insuline-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0,5 ug/ml hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 50 eenheden/ ml penicilline en 50 ug/ml streptomycine (Gibco, Rockville, MD) bij 37◦ C en 5 procent CO2. Deze cellijn werd vriendelijk ter beschikking gesteld door het laboratorium van Dr. Susztak (Philadelphia, Pennsylvania, VS). Behandelingen met humaan recombinant 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) werden uitgevoerd na serumvrije uithongering van HKC-8-cellen gedurende 12 uur.

Transfectie procedure. Cellen werden uitgezaaid in kweekschalen van 60 mm om een ​​samenvloeiing van 70 procent te bereiken. Ze werden getransfecteerd met 40 nM van ofwel mirVana™ miRNA-nabootsing van miR-150, miR-495, of mirVana™ miRNA-nabootsing van negatieve controle (Ambion company, VS) met behulp van lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Cellen werden 6 uur geïncubeerd met het lipofectamine-pre-miRNA 37 C. Vervolgens werd 5 ml vers medium met 10% FBS aan de kweekschalen toegevoegd en werden de cellen 6 uur in kweek gehouden totdat ze voor volgende experimenten werden gebruikt. In het geval van combinatie met TGF- 1-behandeling, werd het volgens de vorige sectie op de cellen aangebracht na overexpressie van miRNA's.

Immunoblot. Cellen werden gewassen in PBS, gehomogeniseerd en gelyseerd in 100 μL RIPA-lysisbuffer met 150 mM NaCl, 0,1 procent SDS, 1 procent natriumdeoxycholaat, 1 procent NP-40 en 25 mM Tris– HCl pH 7,6, in aanwezigheid van protease (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) en fosfataseremmers (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en geoogst door te schrapen. Een kwart stuk van elk niermonster (verkregen na dissectie doormidden zowel in de lengte als in de dwarsrichting) werd gehomogeniseerd in 300 ul RIPA-buffer met 5 mm roestvrijstalen kralen (Qiagen, Valencia, CA) met behulp van TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) trillend op 50 Hz gedurende 15 min bij 4 C. Monsters werden geklaard door centrifugatie bij 10 000 g gedurende 15 min bij 4 C. De pellet werd vervolgens weggegooid en het supernatant werd bewaard als eiwitlysaat. Eiwitconcentraties werden bepaald door de BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL) en werden gemeten in het Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Gelijke hoeveelheden eiwit (10-50 ug) van het totale extract werden gescheiden op 8-10 procent SDS-polyacrylamidegels en overgebracht op nitrocellulose-blottingmembranen (GE Healthcare, Chicago, IL) bij 12 V gedurende 20 minuten in een halfdroge Trans-Blot Turbo-systeem (Bio-Rad, Hercules, Californië).

Membranen werden geblokkeerd door incubatie gedurende 1 uur met 5 procent magere melk in PBS met 0,5 procent Tween-20 en 's nachts geblot met de specifieke antilichamen: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C 's nachts), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C 's nachts), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 uur, kamertemperatuur ). Na incubatie met IRDye 800 geit anti-konijn en IRDye 600 geit anti-muis (1:15.000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) secundaire antilichamen, werden membranen in drievoud afgebeeld met het Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Banddensitometrie werd uitgevoerd met behulp van de ImageJ 1.48-software (//rsb.info.nih.gov/ij) en relatieve eiwitexpressie werd bepaald door te normaliseren naar GAPDH. Vouwveranderingen werden genormaliseerd naar waarden van de controleconditie.

RNA-extractie. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit HKC-8-cellen of muizennieren met behulp van de miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) volgens de instructies van de fabrikant. De kwantiteit en kwaliteit van RNA werden bepaald bij 260 nm door een Nanodrop-1000-spectrofotometer (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Analyse van mRNA-expressie. Omgekeerde transcriptie (RT) werd uitgevoerd met 500 ng totaal RNA met behulp van de iScript™ cDNA-synthesekit (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT-PCR werd uitgevoerd met de iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), met behulp van een 96-well Bio-Rad CFX96 RT-PCR-systeem met een C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) volgens de instructies van de fabrikant. Een Ct-waarde werd verkregen van elke amplificatiecurve met behulp van CFX96-analysesoftware die door de fabrikant werd geleverd. Relatieve mRNA-expressie werd bepaald met behulp van de 2 − ΔΔCt-methode [17]. Het 18S-gen werd gebruikt voor normalisatiedoeleinden. De primersequenties die werden gebruikt voor mRNA-kwantificering waren: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA-TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGG), GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATC: AGGGGAAT: AGGGGATC: AGGGGAATG). Vouwveranderingen werden genormaliseerd naar waarden van de controleconditie.

Kwantificering van miRNA-expressie. Kwantificering van miRNA-expressie werd uitgevoerd met behulp van de miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Denemarken). Na RT werd de cDNA-template geamplificeerd met behulp van microRNA-specifieke LNA-primers voor rijpe miR150-5p of miR-495-3p (Exiqon, Feedback, Denemarken). qRT–PCR werd uitgevoerd in een 96-well Bio-Rad CFX96 real-time PCR-systeem met een C1000 Thermal Cycler met behulp van iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) volgens de instructies van de fabrikant . Een Ct-waarde voor putjes in drievoud werd verkregen uit elke amplificatiecurve met behulp van de CFX Manager Bio-Rad-software (Bio-Rad, Hercules, CA). Ct-waarden werden genormaliseerd naar het endogene controle 5S-rRNA. Plasma-miRNA-spiegels werden genormaliseerd naar miR-103a-5p. Relatieve miRNA-expressie werd bepaald met behulp van de 2 − ΔΔCt-methode [17]. Vouwveranderingen werden genormaliseerd naar waarden van de controleconditie.

Muismodellen van nierfibrose. Muizen werden gehuisvest in de Specific Pathogen Free (SPF) dierfaciliteit bij de CBMSO in overeenstemming met de EU-regelgeving voor alle procedures. Dieren werden behandeld in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren in Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement. Goedkeuring werd verleend door de lokale ethische beoordelingsraad van het Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" in Madrid, de ethische commissie van CSIC en de regelgevende eenheid voor dierexperimentele procedures van de Comunidad de Madrid.

Unilaterale ureterobstructie (UUO): UUO-chirurgieprocedure werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [18]. In het kort werden muizen verdoofd met isofluraan (3-5 procent voor inductie en 1-3 procent voor onderhoud) en verdeeld in twee experimentele groepen: de UUO-groep en de schijnoperatiegroep. In de UUO-groep werden muizen aan de linkerkant van de buik geschoren, werd een verticale incisie door de huid gemaakt met een scalpel en werd de huid teruggetrokken. Een tweede incisie werd gemaakt door het peritoneum om de nier bloot te leggen. De linker ureter werd tweemaal 15 mm onder het nierbekken afgebonden met chirurgische zijde en de ureter werd vervolgens doorgesneden tussen de twee ligaturen. Vervolgens werd de afgebonden nier voorzichtig teruggeplaatst in zijn correcte anatomische positie en werd steriele zoutoplossing toegevoegd om het verlies aan vloeistof aan te vullen. De incisies werden gehecht en muizen werden individueel gekooid. De schijnoperatie werd op een vergelijkbare manier uitgevoerd, maar zonder ureterligatie. Buprenorfine werd gebruikt als pijnstiller. Een eerste dosis werd 30 min voor de operatie toegediend en daarna om de 12 uur gedurende 72 uur, in een dosis van 0,05 mg/kg subcutaan. In dit model worden de renale bloedstroom en glomerulaire filtratiesnelheid significant verminderd binnen 24 uur en interstitiële ontsteking (piek na 2-3 dagen), tubulaire dilatatie, tubulaire atrofie en fibrose zijn duidelijk na 7 dagen. De verstopte nier bereikt ongeveer 2 weken na de procedure maximale disfunctie. Muizen werden opgeofferd door een overdosis CO2 en controle- en verstopte nier- en bloedmonsters werden geoogst na perfusie met PBS op 3, 5, 7, 10 en 15 dagen na UUO.

Foliumzuur-geïnduceerde nefropathie (FAN): In dit model werd nierfibrose geïnduceerd door intraperitoneale (ip) injectie met 250 mg foliumzuur (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) per kg lichaamsgewicht opgelost in 0.3 M natriumbicarbonaat (voertuig) zoals eerder beschreven [19]. Controledieren ontvingen 0,3 ml vehikel (ip). Muizen werden opgeofferd door een overdosis CO2 en nieren en bloedmonsters werden geoogst na perfusie met PBS na 15 dagen toediening van FA.

microRNA-profilering. Om specifieke miRNA's te identificeren die de fibrotische uitkomst reguleren, werd een aangepaste miRCURY LNA-microRNA-array (Exiqon, Feedback, Denemarken) geselecteerd als het platform voor microRNA-profilering. Dit platform bestond uit in totaal 175 unieke assays die specifiek zijn voor miRNA's van muizen die aanwezig zijn in de Sanger miRBase v22.1 (//microrn a.sanger.ac. het VK). Voor elk microRNA werd de overheersende streng geselecteerd voor analyse. MiR-selectie was gebaseerd op voorspelde doelwitgenen die verband houden met nierfibrose, mitochondriaal metabolisme, redoxprocessen en circadiaans ritme. Deze analyse werd gedaan met de bioinformatica-tools voor op sequentie gebaseerde miRNA-doelvoorspelling, microcosm [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) en miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Na RNA-extractie van 7-daagse UUO-niermonsters, werd de miRNA-fractie die aanwezig is in 20 ng totaal RNA onderworpen aan reverse transcriptie met behulp van miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Denemarken) volgens de instructies van de fabrikant. De resulterende cDNA's werden geanalyseerd met de miRCURY miRNA PCR Panels in een Roche LightCycler 480 real-time PCR-systeem met behulp van miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Denemarken). Elk monster werd in duplo geanalyseerd. Deze procedure werd uitgevoerd in de Genomics Facility van de Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Spanje). De LC480-software werd gebruikt om Cq-waarden (Cq) voor elk miRNA te verkrijgen. De delta Ct (ΔCt) -waarde werd berekend door de Ct-waarden te normaliseren naar de endogene huishoudsnRNAU6. De warmtekaart werd gegenereerd met de realtime PCR-gegevens gepresenteerd als ΔCt. Hiërarchische clustering werd gebouwd volgens ΔCt-waarden. De delta Ct (ΔΔCt)-waarde werd berekend door de ΔCt van de referentiemonstergroep (controlenier) af te trekken van de ΔCt van elk belemmerd niermonster. Relatieve kwantificering (RQ) of vouwverandering van elk miRNA werd gegenereerd met behulp van de 2 − ΔΔCt-methode [17]. Differentieel tot expressie gebrachte miRNA's werden geïdentificeerd door de parametrische Limma-test. Om rekening te houden met het testen van meerdere hypothesen, werden P-waarden aangepast (adj.) met behulp van de Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR) -correctie [25]. De resultaten werden grafisch weergegeven in een vulkaanplot.

miRNA-analyse in bloedplasma van CKD-patiënten. De niveaus van geselecteerde miRNA's werden geanalyseerd in plasmamonsters van een cohort van 100 CKD-patiënten, wat hieronder wordt beschreven. Perifeer veneus bloed werd verzameld in met EDTA gesproeide vacutainers (BD, Franklin Lakes, NJ). Om plasma te verkrijgen, werd bloed gedurende 20 minuten bij 400 g gecentrifugeerd, het supernatant werd overgebracht in een nieuwe buis en gedurende 20 minuten bij 800 g gecentrifugeerd. Plasma werd verzameld en ingevroren opgeslagen in porties bij -80 C. Plasma-miRNA werd uit bloed geëxtraheerd met behulp van miRCURYTM RNA Isolation Kit-Biofluids en UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Denemarken). Analyses van miR-150-niveaus in deze monsters werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie kwantificering van miRNA-expressieprocedure. Metingen van het zuurstofverbruik. Vetzuuroxidatie-geassocieerde zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) (geligeerd aan oxidatieve fosforylering) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) (geassocieerd met lactaatproductie en glycolyse) werden bestudeerd met behulp van de Seahorse Bioscience metabole analysator volgens de instructies van de fabrikant [26]. HKC-8-cellen werden uitgezaaid in een p60-plaat en microRNA-transfectie werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven toen ze 48 uur later een samenvloeiing van 70 procent bereikten, HKC-8-cellen werden behandeld met 10 ng/ml TGF{{ 18}} gedurende 48 uur. Vervolgens werden cellen gezaaid met 2 x 104 cellen per putje in een Seahorse Bioscience XFe24-celcultuurmicroplaat (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Na celhechting werd het groeimedium vervangen door een substraatbeperkt medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 0,5 mM glucose en 1 mM glutamaat. Een uur voor de testmeting werden cellen geïncubeerd met Krebs-Henseleit Buffer (KHB) testmedium aangevuld met 0,2 procent carnitine bij 37 ° C zonder CO2. Vijftien minuten voor de test werd de CPT1-remmer Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 M aan de overeenkomstige putjes toegevoegd en werden cellen zonder CO2 bij 37 ◦C geïncubeerd. Ten slotte werd onmiddellijk voorafgaand aan de test BSA of 200 μM Palmitate-BSA FAO-substraat (Agilent Technology, Santa Clara, CA, VS) toegevoegd. Onmiddellijk werd de XF Cell Mito Stress Test uitgevoerd in een Seahorse XFe24 energieanalysator door achtereenvolgens verschillende modulatoren van de mitochondriale functie toe te voegen. Eerst werd de ATP-synthaseremmer oligomycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM) gebruikt na basale meting. Dit vermindert de elektronenstroom door de ETC, wat resulteert in een vermindering van de mitochondriale ademhaling. Vervolgens werd het ontkoppelingsmiddel cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM) toegevoegd, dat de protongradiënt doet instorten en het mitochondriale membraanpotentieel verstoort. Als gevolg hiervan is de elektronenstroom door de ETC ongeremd en bereikt het zuurstofverbruik door complex IV zijn maximum. De derde en laatste injectie is een mengsel van de complexe III- en I-remmers anti-mycine/rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 M). Deze combinatie schakelt de mitochondriale ademhaling uit en maakt de berekening van niet-mitochondriale ademhaling mogelijk die wordt aangedreven door processen buiten de mitochondriën. Substraten/remmers werden bereid in hetzelfde medium waarin het experiment werd uitgevoerd en werden automatisch op de aangegeven tijden vanuit de reagenspoorten geïnjecteerd. Metingen werden geregistreerd gedurende 3-min tijdsperioden (over een totale periode van 2 uur) en waarden werden genormaliseerd voor het totale eiwitgehalte. Eiwit werd uit putjes geëxtraheerd met 0,1 procent NP-40-PBS-oplossing en gekwantificeerd met een BCA-eiwitassay (Thermo Scientific, Rockford, IL). Voor elke experimentele groep werden vier putjes gebruikt. De Seahorse XFp Cell Mito Stress Test werd gebruikt om de belangrijkste parameters van de mitochondriale functie te bepalen: basale mitochondriale ademhaling, ATP-gebonden ademhaling, protonlek (niet-- ATP-gebonden zuurstofverbruik), maximale ademhaling, niet-mitochondriale ademhaling en reserve ademhalingscapaciteit, zoals eerder beschreven [27].

Luciferase-test. Voor het karakteriseren van de miRNA-150- en miRNA-495-kandidaat-bindingsplaatsen in de menselijke CPT1A 3'-UTR, een luciferasereportertest die de CPT1A 3'-UTR bevat (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347) werd gebruikt. Plaatsgerichte mutaties in de zaadgebieden van voorspelde miR-150- en miR-495-plaatsen binnen de 3'-UTR's werden gegenereerd met behulp van de Multisite-QuikChange-gerichte mutagenesekit (Stratagene, La Jolla, CA) volgens volgens het protocol van de fabrikant. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Alle constructen werden vóór gebruik gesequenced om te bevestigen dat ze de juiste structuur hebben. HKC-8-cellen werden gezaaid in ap24-well-plaat en werden tijdelijk gecotransfecteerd met 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (intacte of gemuteerde constructies) en 4 ng pGL3-Promoter (een vuurvliegluciferase onder controle van de SV40-promotor) (Promega Corporation, Madison, WI, VS) reporterplasmiden en 40 nM van ofwel mirVana™ miRNA-nabootsing van miR-150, miR -495 of mirVana™ miRNA bootsen negatieve controle na (Ambion company, VS) met lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wanneer ze een samenvloeiing van 70 procent bereikten zoals hierboven beschreven. Voor elke experimentele groep werden vier putjes gebruikt. Luciferase-assays werden 24 uur later uitgevoerd met behulp van het Dual-Luciferase-reportersysteem (Promega, Madison, WI). De luciferasesignalen van vanille en vuurvlieg werden gedetecteerd met behulp van een Glomax multi-detectiesysteem (Promega Corporation, Madison, WI, VS). De activiteit van renilla-luciferase werd genormaliseerd door de luciferase-activiteit van de vuurvlieg.

Mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP). Veranderingen in MMP werden bepaald als verschillen in tetramethylrhodaminemethylester (TMRM) fluorescentie (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Het hoopt zich op in negatief geladen gepolariseerde mitochondriën en fluoresceert in oranje. Wanneer het mitochondriale membraanpotentieel instort in apoptotische of metabolisch gestresste cellen, wordt het TMRM-reagens door het celcytosol verspreid en dalen de fluorescentieniveaus dramatisch. HKC-8-cellen werden gekweekt en getransfecteerd zoals beschreven in de secties van de celkweek- en transfectieprocedure. Vervolgens werd het groeimedium vervangen door fenolroodvrije Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10 mM Hepes. Behandelingen met oligomycine (5 M) en FCCP (4 M) gedurende 5 minuten werden gebruikt als positieve en negatieve controleomstandigheden. Vervolgens werden cellen gekleurd met 250 nM TMRM gedurende 30 minuten bij 37 C. Cellen werden geoogst met trypsine, gecentrifugeerd (3000 rpm, 5 min) en de pellet werd geresuspendeerd in 200 μL HBSS met 1 procent Bovine Serum Albumine (BSA) en 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). De fluorescentie-intensiteit werd gemeten met flowcytometrie met behulp van een emissiegolflengte van 570 nm voor TMRM (FL2) [28] in een BD FacsCantoTM II-systeem (BD Bioscience, San Jos, CA) en geanalyseerd met de FlowJo 10.2-software (FlowJo, LLC, Ashland , OF). Voor elke experimentele conditie werden ten minste 20.000 singlets in drievoud geanalyseerd.

Mitochondriale superoxide radicale anionproductie. Evaluatie van de productie van superoxide-radicaalanionen werd uitgevoerd met behulp van Mito-SOX ™ Red mitochondriale superoxide-radicaal-anionindicator (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS), een zeer selectieve fluorogene kleurstof voor mitochondriaal superoxide-radicaalanion in levende cellen, volgens de fabrikant instructies. HKC-8-cellen werden gekweekt en getransfecteerd zoals beschreven in de secties van de celkweek- en transfectieprocedure. Vervolgens werd het groeimedium vervangen door fenolroodvrije Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10 mM Hepes. Behandeling met antimycine A (150 M) en carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP) (50 M) gedurende 5 minuten werden gebruikt als positieve en negatieve controleomstandigheden. Vervolgens werden cellen gekleurd met 5 μM MitoSOX ™ Red gedurende 30 minuten bij 37 ◦C. Cellen werden geoogst zoals beschreven in de mitochondriale membraanpotentiaalsectie. De fluorescentie-intensiteit werd gemeten met flowcytometrie met behulp van een emissiegolflengte van 580 nm voor MitoSOX™ Red (FL2) in een BD FacsCantoTM II-systeem (BD Bioscience, San Jos, CA) en geanalyseerd met de FlowJo 10.2-software (FlowJo, LLC, Ashland, OF). Voor elke experimentele conditie werden ten minste 20 000 singlets in drievoud geanalyseerd.

Mitochondriale etikettering. Evaluatie van de mitochondriale inhoud werd uitgevoerd met behulp van MitoTracker ™ groene FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS), die passief over het plasmamembraan diffundeert en zich ophoopt in actieve mitochondriën, ongeacht het mitochondriale membraanpotentieel, volgens de instructies van de fabrikant. HKC-8-cellen werden gekweekt en getransfecteerd zoals beschreven in de secties van de celkweek- en transfectieprocedure. Vervolgens werd het groeimedium vervangen door fenolroodvrije Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10 mM Hepes. Cellen werden gekleurd met 150 nM met MitoTracker ™ green FM gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Voor flowcytometrie-analyse werden cellen geoogst zoals beschreven in de mitochondriale membraanpotentiaalsectie. De fluorescentie-intensiteit werd gemeten met een emissiegolflengte van 516 nm voor met MitoTracker™ green FM (FL1) in een BD FacsCantoTM II-systeem (BD Bioscience, San Jos, CA) en geanalyseerd met de FlowJo 10.2-software (FlowJo, LLC , Ashland, OR). Voor elke experimentele conditie werden ten minste 20 000 singlets in drievoud geanalyseerd. Voor fluorescentiebeeldvorming werden kernen ook gekleurd met DAPI (Sigma, St. Louis, MO) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Levende cellen werden gevisualiseerd door een omgekeerde Zeiss LSM 710 confocale microscoop met een waargenomen cel, een 63X/1.2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 objectief en geanalyseerd met de Zeiss Zen2010B sp1-software (Zeiss, Oberkochen, Duitsland) .

Mitochondriale bepaling van het aantal kopieën. Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit HKC-8-cellen met behulp van de DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) volgens de instructies van de fabrikant. Mitochondriale abundantie werd bepaald met de Human Mitochondrial DNA Copy Number Assay Kit (Detroit R&D, Detroit, MI). Het relatieve aantal mtDNA-kopieën werd gepresenteerd als de verhouding van mtDNA tot nucleair DNA.

Menselijke CKD-patiëntenmonsters. Een cohort van 100 CKD-patiënten (stadium 3-4) van Hospital Principe de Asturias werd geselecteerd voor de analyse van miRNA-plasmaspiegels. Het omvatte twee verschillende subgroepen geclassificeerd volgens de evolutie van hun nierfunctie op basis van de GFR MDRD-indicator [29] over een periode van 24 maanden: 50 patiënten presenteerden minder dan 10 procent van denierverslechtering van de functie, terwijl de rest van hen een vermindering van de nierfunctie van ten minste 40 procent had ervaren of was begonnenniervervangende therapie (dialyse). We kwantificeerden ook de mate van fibrose innierbiopsieën van een ander cohort van 26 patiënten met transplantaatdisfunctie die volgdenniertransplantatie van ziekenhuis Ramn y Cajal. Alle biopsieën werden beoordeeld volgens de criteria van Banff 2007 [30].

Statistische analyse. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van niet-parametrische tests, behalve waar aangegeven. Het verschil tussen de twee onafhankelijke groepen werd onderzocht met de Mann-Whitney-test, terwijl meer dan twee groepen werden vergeleken met de Kruskall-Wallis-test. Een P-waarde van 0.05 of minder werd als statistisch significant beschouwd (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0.001).="" gegevens="" werden="" geanalyseerd="" met="" behulp="" van="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" gegevens="" worden="" gerapporteerd="" als="" gemiddelde="" ±="" standaardfout="" van="" het="" gemiddelde="">

3. Resultaten

miRNA-expressiegegevens in UUO-geïnduceerde fibrotischenieren. De bijdrage van miRNA's aan de metabole regulatie vannierfibrogenese werd het 7 dagen UUO-model uitgevoerd in WT-muizen. RNA werd geïsoleerd uit controle en fibrotischniermonsters en het miRNA-expressieprofiel werd geanalyseerd in een aangepaste microRNA-array. De selectie van miRNA's was gebaseerd op hun potentiële targeting van sleutelenzymen die betrokken zijn bij mitochondriaal metabolisme, redoxprocessen en circadiaans ritme na "in silico" -analyse (meer details in de sectie Methoden). De warmtekaart onthulde duidelijk verschillende expressiepatronen in sommige miRNA's bij het vergelijken van fibrotische en controleniermonsters (Fig. 1A). De vulkaanplotanalyse toonde aan dat 73 van de 175 miRNA's differentieel tot expressie werden gebracht, 17 opwaarts en 56 neerwaarts gereguleerd, in de fibrotische niermonsters vergeleken met de controlemonsters (figuur 1B, aanvullende tabel 1). Onder hen werden specifieke miRNA's geselecteerd die de fibrotische uitkomst in de nier via metabole routes zouden kunnen reguleren. Voor dat doel werd in silico-analyse van de 3'UTR (niet-vertaalde regio) van specifieke genen die betrokken zijn bij metabole en mitochondriale functies, CPT1A, TFAM, PGC1A uitgevoerd met drie onafhankelijke voorspellingstools (Targetscan, miRWalk en miRanda). Selectiecriteria omvatten ook het expressieniveau in de nieren, nieuwheid van doelwitten, mate van kennis over de metabole route en biologische significantie. Verband met menselijke pathologie, het expressieniveau van nierweefsel, hun rol in het mitochondriale metabolisme en hun potentiële targeting van het vetzuurshuttle-enzym CPT1A moedigde ons aan om ons te concentreren op drie miRNA's, miR-150-5p, miR-495-3p en miR -33-5 p, als kandidaten die in staat zijn om metabole veranderingen geassocieerd met renale fibrogenese te reguleren (Fig. 1C). Merk op dat CPT1A 3'-UTR één seed-site voor miR-150 en twee seed-sites voor miR-495 bevat. We hebben waargenomen dat miR-150 en miR-495 de activiteit van een luciferasereportertest met de CPT1A 3'-UTR met respectievelijk ~15 procent en 25 procent verlaagden. Deze downregulatie werd volledig opgeheven in het geval van puntmutaties (PM's) in de 3'-UTR van CPT1A voor de miR-150-bindingsplaats (PM2) en gedeeltelijk afwezig in beide miR-495-bindingsplaatsen (PM1 en PM3) (Aanvullende Fig. 1A en B). Deze gegevens duiden op een directe interactie van CPT1A met miR-150 en miR-495. MiR-33-5p is onderwerp geweest van een aparte studie [15]. MiR-150-5p en miR-495-3p werden opgereguleerd in fibrotische niermonsters in vergelijking met de controlemonsters, met een vouwverandering van 3,69 (P-waarde: 0.012 ) en 1,95 (P-waarde: 0,012), respectievelijk.

MiR-150 en miR-495 versterken de TGF-profibrotische respons bij de mensniertubulaire epitheelcellen. Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (qRT-PCR) werd uitgevoerd om de verandering van miR-150-5p- en miR-495-3p-expressie te bevestigen die was geïdentificeerd door miRNA-expressieprofilering in de UUOniermonsters (Fig. 2A en B). Bovendien werd de kinetiek van miR-150-5p- en miR- 495-3p-expressie in de nieren 3, 5, 7, 10 en 15 dagen na de UUO-procedure geanalyseerd met qRT-PCR. De expressie van deze miRNA's was significant verhoogd met 2- maal 5 dagen na UUO en bleef 15 dagen na UUO verhoogd (Fig. 2C en D). Het expressieniveau van deze miRNA's werd ook geëvalueerd in het foliumzuurnefropathie (FAN) -model. We vonden een 4- en 2-voudige opregulatie van respectievelijk miR-495-3p en miR-150-5p in fibrotischeniermonsters van het FAN-model (Fig. 2E). TGF- 1, een van de belangrijkste regulatoren van fibrogenese, induceerde ook miR-150- en miR-495-expressie in HKC-8-cellen meer dan 2-voudig en {{ 6}}voudig respectievelijk na 48 uur, wat een mogelijke rol voor deze miRNA's in TGF-signaleringsgerelateerde gebeurtenissen ondersteunt (Fig. 3A en B). Om te beoordelen of miR-150 en miR-495 betrokken waren bij de pro-fibrotische transformatie van tubulaire epitheelcellen door TGF- 1, werd de menselijke cellijn HKC-8 getransfecteerd met miR -150-5p of miR-495-3p en behandeld met TGF- 1 voor verschillende tijden. Toenemende miR-150-5p- en miR-495-3p-niveaus versterkten significant de TGF- 1-geïnduceerde mRNA-expressie van de fibrose-geassocieerde markers Acta2, Col1 1 en Fn1 ( Fig. 3C en D). Evenzo verminderde overexpressie van miR -150-5 p of miR -495-3 p sterk CPT1A en verhoogde -SMA-eiwitovervloed (Fig. 3E en F). Deze gegevens suggereren dat deze miRNA's kunnen deelnemen aan de pathogenese vannierfibrose door TGF- 1-afhankelijke epitheliale dedifferentiatie van tubulaire cellen te bevorderen, evenals door de expressie van een cruciaal enzym dat betrokken is bij FAO in gevaar te brengen.

MiR-150 en miR-495 induceren mitochondriale bio-energetische veranderingen en verminderen de expressie van genen die betrokken zijn bij cruciale mitochondriale functie. Om inzicht te krijgen in de metabole gevolgen van de toediening van miR-150-5p of miR-495-3p hebben we het bio-energetisch profiel van mensen bestudeerd.niertubulaire epitheelcellen.

Fig. 1. miRNA-expressiegegevens in UUO-geïnduceerde fibrose. (A) Warmtekaart met relatieve miRNA-expressie van contralateraal en belemmerdnierenvan C57/BL6-J-muizen onderworpen aan de UUO-procedure gedurende 7 dagen (n=6). De schaalbalk varieert van groen tot rood (hoge tot lage expressie) en getallen vertegenwoordigen ΔCt-waarden. Aan de linkerkant worden de miRNA's aangegeven die voor studie zijn geselecteerd. (B) Vulkaanplotanalyse van UUO-gemoduleerde miRNA's. Log10 relatieve kwantificering (RQ) en negatieve ( ) log10 gecorrigeerde (adj.) P-waarden worden respectievelijk op de x- en y-as uitgezet. Elke miRNA wordt weergegeven door een punt. 73 van de 175 miRNA's vertoonden een veranderde expressie in de fibrotische monsters (adj. P-waarde groter dan of gelijk aan 0,05). Geselecteerde miRNA's voor verdere analyse worden gemarkeerd. (C) miR-150-5p en miR-495-3p werden geselecteerd op basis van hun kracht voor in silico targeting van de genen CPT1A, TFAM en PGC1A. Voor elk geselecteerd microRNA worden geconserveerde zaaddoelplaatsen in de 3'UTR van deze genen, hun vouwverandering en significantie (adj. P-waarde) aangegeven.

Fig. 2. Expressieniveaus van miR-150-5p en miR-495-5p innierenvan de modellen UUO en FAN. (A, B) qRT-PCR-analyse van miR-150-5p (A) en miR-495- 3p (B)-expressie innierenvan muizen 7 dagen na UUO in monsters die eerder zijn geanalyseerd met de microRNA-array. (C–E) qRT-PCR-analyse van miR-150-5p- en miR-495-3p-expressie na het FAN-model (C) en 3, 5, 7, 10 en 15 dagen na UUO voor miR-150-5p (D) en miR{{10}}p (E). Staafdiagrammen vertegenwoordigen het gemiddelde van de expressieniveaus van de vouwverandering ± sem van 6 (A, B, E) en 3 (C en D) muizen per groep. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><0.001 vergeleken="" met="" hun="" overeenkomstige="" controlecondities;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" vergeleken="" met="">nierenvan muizen met dezelfde experimentele behandeling.

TGF- 1 werd gebruikt als het modelcytokine dat betrokken is bij pro-fibrotische geassocieerde veranderingen. Om de bio-energetische status van deze cellen te bepalen, werden de FAO-geassocieerde zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van HKC-8-cellen gemeten tijdens opeenvolgende behandeling met verbindingen die mitochondriale activiteit moduleren in de aanwezigheid van palmitaat , met behulp van een Seahorse XF24 Extracellulaire Flux Analyzer (meer details in de sectie Methoden). Na 48 uur met TGF- 1 vertoonden HKC-8-cellen in aanwezigheid van miR-150-5p een consistente afname in basale, OCR gekoppeld aan ATP-generatie, ATP-gekoppelde ademhaling en maximale ademhaling, wat heeft betrekking op FCCP-gevoelige OCR (Fig. 4A). De stoornis in de OXPHOS werd weerspiegeld door een afname van het ATP-gehalte in HKC -8-cellen die miR -150-5 p tot overexpressie brengen (figuur 4C). We hebben niet waargenomen dat deze miRNA's variaties in ECAR induceerden (gegevens niet getoond). In overeenstemming hiermee zijn mRNA-expressieniveaus van hun mitochondriale

gerelateerde doelwitgenen CPT1A, PGC1 en de mitochondriale transcriptiefactor A (TFAM), werden met de helft verminderd in cellen die waren behandeld met miR -150-nabootsing in vergelijking met miRNA-nabootsende NC-behandelde cellen (Fig. 4E). Studies met dezelfde experimentele benadering met miR -495-3p leverden vergelijkbare resultaten op (Fig. 4B, D, F). De mitochondriale massa, bepaald door het aantal mtDNA-kopieën en mitochondriale kleuring met MitoTrackerTM green FM, werd echter niet significant gemoduleerd door miRNA-150 en miRNA- 495, zowel in basale omstandigheden als onder TGF-behandeling. Basaal werd een afnemende trend in deze parameter waargenomen (aanvullende figuur 2A, B, C). Over het algemeen ondersteunen deze gegevens dat miR-150 en miR-495 een

pro-fibrotische werking in tubulaire epitheelcellen door de verslechtering van de mitochondriale functie.

MiR-150 en miR-495 veranderen het mitochondriale transmembraanpotentieel (ΔѰm) en de mitochondriale superoxideradicaal niet

Fig. 3. MiR-150 en miR-495 versterken de TGF- 1-afhankelijke profibrotische respons bij mensenniertubulaire epitheelcellen. (A, B) RT-PCR-analyse van miR{{0}}p (A) en miR-495-3p (B)-expressie in HKC-8-cellen behandeld met 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 voor de aangegeven tijden. (C, D) mRNA-niveaus van alfa-gladde spieractine (-SMA), alfa-1 type -1 collageen (Col1 1), fibronectine (FN) van cellen die zijn getransfecteerd met miR-NC en mimic miR -150-5p (C) of miR-495-3p (D) werden bepaald met qRT-PCR met Sybr green. Cellen werden behandeld met TGF- 1 (10 ng/ml) na overexpressie van miRNA waar aangegeven (zie ook de sectie methoden). (E, F) Immunoblots die CPT1A- en -SMA-niveaus eiwitniveaus weergeven in cellen die zijn getransfecteerd met miR-NC en miR-150-5p (E) of miR{{20}}p (F) nabootsen voor de aangegeven tijdstippen. GAPDH werd gebruikt voor normalisatiedoeleinden. Staafdiagrammen (rechterpanelen) vertegenwoordigen het gemiddelde van de uitdrukking van de vouwverandering ± sem van 3 onafhankelijke experimenten. *P < {{30}},05,="" **p=""><0,01, ***p=""><0,001 vergeleken="" met="" hun="" overeenkomstige="" controlecondities;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 vergeleken="" met="" cellen="" behandeld="" met="" mir-nc="" met="" dezelfde="" experimentele="">

Fig. 4. MiR-150 en miR-495 versterken door TGF 1-geïnduceerde FAO-repressie in HKC-8-cellen. (A, B) Zuurstofverbruik (OCR) van HKC-8-cellen getransfecteerd met

40 nM miR-NC en bootsen miR-150-5p (A) of miR-495-3p (B) na en blootgesteld aan 10 ng/ml TGF{{5} } na miRNA-overexpressie (zie ook sectie methoden). Staafdiagrammen (rechterpanelen) tonen de OCR-snelheden die verband houden met basale, proton-lek, ATP-gekoppelde, maximale en reservecapaciteiten en niet-mitochondriale ademhalingsstatussen. Gegevens worden weergegeven na normalisatie door eiwithoeveelheid. (C, E) ATP-niveaus in HKC-8-cellen die zijn getransfecteerd met miR-NC en miR-150-5p (C) of miR-495-3p (E) nabootsen. (D, F) mRNA-niveaus van CPT1A, PGC1A en TFAM in HKC-8-cellen getransfecteerd met miR-NC en mimic miR-150-5p (D) of miR-495-3p (F) waren bepaald door qRT-PCR met behulp van Sybr green. Staafdiagrammen tonen het gemiddelde ± sem van 4 onafhankelijke experimenten. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" vergeleken="" met="" hun="" overeenkomstige="" controlecondities;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 vergeleken="" met="" cellen="" behandeld="" met="" mir-nc="" met="" dezelfde="" experimentele="">

productie van anionen. Mitochondriaal membraanpotentiaal (ΔΨm) gegenereerd door protonpompen (complexen I, III en IV) is een essentieel onderdeel in het proces van energieopslag tijdens oxidatieve fosforylering. Verhoogde ΔѰm kan leiden tot mitochondriale redoxverstoring, terwijl de afname ervan een vermindering van de ATP-productie veroorzaakt, waardoor de levensvatbaarheid van de cellen in gevaar komt [254]. Superoxide radicaal anion (O2•− ) is een vrije radicaal die kan worden gegenereerd in de mitochondriën als gevolg van elektronenlekkage die kan optreden binnen verschillende stappen van de ETC. De vorming van O2•− in de mitochondriale matrix hangt ook kritisch af van de NADH/NAD plus- en CoQH2/CoQ-verhoudingen en de lokale O2-concentratie [255]. De overproductie ervan kan leiden tot het verlies van mitochondriale redoxhomeostase via verschillende mechanismen, een aandoening die verband houdt met veel pathologische toestanden, waaronder AKI en CKD [201]. ΔѰm werd onderzocht met de TMRM-kleurstof en de superoxide-radicaalanionproductie met MitoSOX-kleurstof. Eerst hebben we deze testen gevalideerd door de behandeling van cellen met FCCP en CCCP als negatieve controles, voor respectievelijk TMRM en MitoSOX, en Oligomycine en Antimycin A als positieve controles, voor respectievelijk TMRM en MitoSOX, in de menselijke cellijn HKC{{7} }. In het geval van de TMRM-assay induceerde behandeling met oligomycine een 3--voudige toename van het fluorescentiegemiddelde van de TMRM in vergelijking met de controlekleurstof, terwijl FCCP-behandeling resulteerde in een 9--voudige afname. Antimycine A en CCCP produceerden respectievelijk een 35--voudige toename en een 2--voudige afname in de MitoSOX-assay (aanvullende Fig. 3A en B). Om te bepalen of miR-150- en miR-495-effecten op het mitochondriaal metabolisme veranderingen in deze parameters veroorzaakten, werden HKC-8-cellen getransfecteerd met een miR-150-5p of miR{{17} }p nabootsen of de corresponderende miR-NC. Er werden geen statistisch significante verschillen gevonden in de fluorescentiekwantificering van de TMRM- of MitoSOX-sondes tussen de behandelingsomstandigheden met de geselecteerde miR's en miR-NC (aanvullende figuur 3C).

MiR-150- en miR-495-spiegels worden niet beïnvloed in plasma- en niermonsters van CKD-patiënten. We beoordeelden de expressie van de geselecteerde miRNA's in plasma- en nierbiopten van patiënten met CKD. Analyse van nierbiopten van 26 patiënten (Hospital Ramn y Cajal) liet geen correlatie zien tussen de mate van fibrose en respectievelijk miR-150-5p- en miR-495-3p-niveaus (aanvullende figuren 4A en B) . Circulerende plasmaspiegels van miR-150-5p, het miRNA met de hoogste nierexpressie van de twee, werden ook bepaald in een cohort van 100 CKD-patiënten (Hospital Príncipe de Asturias). Vanwege beperkingen in de beschikbaarheid van monsters konden we de serumwaarden van miR- 495-3p in dit cohort niet bepalen. Deze patiënten werden eerder verdeeld in twee subgroepen op basis van de evolutie van hun nierfunctie over een periode van 24 maanden, zodat 50 patiënten minder dan 10 procent verslechtering van de nierfunctie vertoonden, terwijl de rest van hen een nierfunctiestoornis van ten minste 40 procent had ervaren. functie. De qRT-PCR-kwantificering van plasmaspiegels van miR -150-5 p vertoonde geen duidelijke trend naar een differentiële expressie in de twee subgroepen van patiënten (aanvullende figuur 4C).

4. Discussie

De ontdekking van miRNA's als belangrijke regulatoren van pathofysiologische processen heeft geleid tot onderzoek naar hun gebruik als therapeutische middelen in bijna elke klinische setting, inclusief nierziekte [31]. Nierfibrose is een veel voorkomende uitkomst van chronische nierziekte (CKD) met de onafhankelijkheid van de etiologie, en de aanwezigheid ervan is een duidelijke voorspeller van evolutie. Daarom is er veel moeite gedaan om miRNA's te identificeren die verband houden met nierfibrose [32,33]. In deze studie hebben we ons gericht op de steeds belangrijker wordende rol van metabole stoornissen innierschadeen we identificeerden twee miRNA's, miR-150 en miR-495, die voorheen onbekende actoren in de scene waren. Bovendien vonden we dat ze een diepgaand effect uitoefenen op de cellulaire bio-energetica door synergie met TGF- en het modificeren van belangrijke metabole routes die verband houden met vet.zuur oxidatie.

Epitheliaal letsel gaat samen met een defect in vetzuuroxidatie, de belangrijkste energiebron voor tubulaire epitheelcellen [5]. Het leidt tot hun dedifferentiatie, waardoor de tubulaire functie wordt aangetast, de celcyclus wordt stopgezet en de afgifte van kritische pro-fibrotische cytokinen wordt bevorderd die kunnen bijdragen aan het activeren van interstitiële myofibroblasten [5,34]. MiR-150 en miR-495 expressie waren verhoogd in muisfibrotischnierenen inmenselijk nierepitheelcellen (HKC-8) na behandeling met TGF-, wat suggereert dat ze betrokken zijn bij de pro-fibrotische respons. Van belang is dat in silico-analyse van de genomische regio's die coderen voor miR-150 en miR-495 de identificatie van bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren gerelateerd aan TGF-signalering en andere routes die betrokken zijn bij UUO-schade (zoekopdrachten in genecards.org voor miR-150 en miR-495). Zowel miR-150 als miR-495 verlaagden het expressieniveau van hun doelgenen CPT1A, PGC1 en TFAM, wat tot uiting kwam in een verlaagd basaal, ATP-gekoppeld en maximaal OCR- en ATP-gehalte na behandeling met miR-150 en miR-495. Dit effect ging gepaard met een verhoogde TGF-pro-fibrotische respons in HKC-8-cellen. We ontdekten dat TGF de mitochondriale massa en mitochondriaal DNA verminderde. Na behandeling met miRNA-150 en miRNA-495 werd een dalende trend waargenomen in mitochondriale inhoud in basale omstandigheden, hoewel deze geen significantie bereikte. Dit wijst op een mechanisme dat onafhankelijk is van de rol van PGC1 of TFAM en hoogstwaarschijnlijk gerelateerd is aan een metabool effect dat verband houdt met CPT1A-downregulatie als de belangrijkste variabele die wordt beïnvloed door de aanwezigheid van de miRNA's. Veranderingen in mitochondriale bio-energetica zijn van cruciaal belang bij nieraandoeningen [35]. In overeenstemming hiermee hebben we onlangs aangetoond dat CPT1A een cruciaal enzym is voor het behoud van een gezond tubulair compartiment, omdat de overexpressie ervan beschermt tegen nierfibrose [6]. Echter, PGC1

en TFAM-genen zijn ook nauw verwant aan de mitochondriale functie en biogenese [36]. De verminderde expressie van deze genen is geassocieerd met CKD, terwijl het behoud ervan bijdraagt ​​aan de integriteit van de nieren, zoals blijkt uit verschillende modellen van schade. Zo hebben Han et al. ontdekte dat tubulaire gain-of-function van PGC1 muizen beschermde tegen door Notch geïnduceerde nierfibrose en de mitochondriale disfunctie die met dit model gepaard ging, omkeerde [37]. Evenzo verhinderde herexpressie van Tfam in tubuluscellen door Notch geïnduceerde metabole en pro-fibrotische herprogrammering [38]. Het is dus denkbaar dat de verminderde mRNA-expressie van deze mitochondriale genen, geïnduceerd door miR-150 en miR-495, ook bijdraagt ​​aan een beschadigd epitheliaal fenotype.

De afname die we hebben waargenomen in OCR geassocieerd met epitheelcelbeschadiging is in overeenstemming met eerdere rapporten, waaronder onze onderzoeken met miR-33 en miR-9 [15,16]. Terwijl Kang et al. rapporteerde ook dat glucose-oxidatie lager was in menselijke en muismodellen van nierfibrose [5], onze gegevens laten zien dat de microRNA-gemedieerde afname in OCR niet per se variaties in ECAR induceert, wat suggereert dat de glycolytische stopzetting in fibrotische omstandigheden hoogstwaarschijnlijk afhangt van op fibrotische stimuli in plaats van op verminderde oxidatieve fosforylering. Verschillende miRNA's zijn geïdentificeerd als belangrijke modificatoren van de mitochondriale functie, waaronder het archetypische pro-fibrotische miRNA, miR-21 [39]. De onderdrukking van PPAR-expressie door miR-21 is ingeroepen als een mechanisme waarmee dit miRNA zijn pro-fibrotische werking uitoefent. Naast het remmen van FAO, gaven de doelgenen voor miR-21 aan dat dit miRNA een breed scala aan mitochondriale processen tot zwijgen brengt. Andere voorbeelden zijn mir-9 [16], miR-33 [15] en miR-30e [40,41]. Voor zover wij weten, zijn er echter weinig rapporten over de microRNA-regulatie van CPT1A-, PGC1- en TFAM-genen in de context van nierfibrose. Interessant is dat microRNA-214 dat de epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT) bevordert tijdens nierfibrose, direct gericht is op TFAM in darmkankercellen [42]. Deze repressie werd ook gemeld voor miR-590-3p [43]. De miR-29-familie, een van de best gekarakteriseerde regulatoren van ECM-productie bij orgaanfibrose, richt zich direct op PGC1, waardoor de cardiale homeostase behouden blijft. Pathologische silencing van miR-29 leidt dus tot PGC1-upregulatie, waardoor diepgaande veranderingen in mitochondriale biogenese worden gegenereerd die bijdragen aan hartaandoeningen [44]. Hoewel onze gegevens duidelijk een rol voor miR-150 en miR-495 bij nierfibrose ondersteunen, zouden verdere in vivo studies nodig zijn om deze bewering te bevestigen.

Om de integriteit van de mitochondriale elektronentransportketen (ETC) te evalueren, hebben we ons gericht op twee kenmerken: ΔѰm en superoxide-radicaalanionproductie. We hebben vastgesteld dat miR-150 en miR-495 deze parameters niet hebben gewijzigd. Een stabiele ΔѰm is vereist voor de levensvatbaarheid van cellen en de grootte ervan varieert tussen celtypen [45]. Het onderhoud ervan is strikt nauwkeurig afgesteld, aangezien een toename in ΔѰm kan leiden tot verstoringen in de redoxtoestand, terwijl de afname ervan een vermindering van de ATP-productie veroorzaakt en apoptose kan veroorzaken. In onze studie werden veranderingen in ΔѰm gekwantificeerd met de kationische fluorescerende kleurstof TMRM, terwijl mitochondriale superoxide radicale anionproductie werd gemeten met de fluorogene kleurstof MitoSOX Red. Het gebruik van deze hulpmiddelen bij aandoeningen die de nierfunctie beïnvloeden, is niet opvallend in de literatuur. Desalniettemin hebben we, gezien de afwezigheid van veranderingen in onze studie, geen diepgaande andere strategieën nagestreefd om redox-hormese te evalueren, en daarom kunnen we niet uitsluiten dat deze miRNA's de nucleofiele toon of de functie van de verschillende componenten van de ETC.

In de klinische setting is miR-150 gesuggereerd als een pro-fibrotisch miRNA bij lupus nefritis door TGF-signalering te moduleren [46,47], terwijl miR-495 werd geassocieerd met een beschermende rol bij diabetische cardiale fibrose [48]. Om hun mogelijke betrokkenheid bij CKD te achterhalen, evalueerden we hun serum- en parenchymale niveaus in twee verschillende patiëntencohorten. Serumspiegels van miRNA's zijn voorgesteld als potentiële biomarkers voor CKD-progressie [49,50]. Aldus correleren serum circulerende miR-21-niveaus en overvloed aan miR-29c in urinaire exosomen met nierfibrose, wat hun potentiële rol als biomarkers suggereert [51, 52]. De miR-150- en miR-495-spiegels waren echter niet verschillend in plasma- of niermonsters van CKD-patiënten. De verschillende microRNA-expressiepatronen tussen soorten en celtypen kunnen deze afwezigheid van verschil in miR-150- en miR-495-niveaus in fibrotisch weefsel verklaren [53]. Hoewel in sommige gevallen gerapporteerde microRNA-plasmaspiegels die in het nierweefsel kunnen weerspiegelen, moeten ook andere mechanismen die verband houden met de uitscheiding van miRNA's naar de bloedsomloop of een tegenwicht van deze uitscheiding door andere organen worden overwogen [13,54].

Over het algemeen ondersteunen onze resultaten dat miR-150 en miR-495 promotennierepitheelceldedifferentiatie hoogstwaarschijnlijk door energiegebrek, overgebracht door de onderdrukking van CPT1A-, PGC1- en TFAM-mitochondriale functiegerelateerde genen. Ze bieden ook een basis om hun rol in vivo na te streven, evenals hun potentiële bruikbaarheid als diagnostische of prognostische biomarkers.

Bijdragen van auteurs

SL bedacht en leidde het onderzoek. VM ontwierp, voerde en analyseerde de meeste experimenten. RR assisteerde bij de analyse van de microRNA-array. DRP en LGB hebben studies uitgevoerd in twee verschillende cohorten van CKD-patiënten. Alle auteurs hielpen bij de bespreking van de resultaten en SL en VM schreven het manuscript.

Verklaring van concurrerend belang

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie van Wetenschap SAF2015-66107-R en PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP), medegefinancierd door de Europese Fonds voor Regionale Ontwikkeling, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 en RD16/0009/0016 (SL en DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751 (SL en DRP), een subsidie ​​van de Spaanse Vereniging voor Nefrologie (Fundacin Senefro 2017) aan SL en Fundacionnier"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) allemaal uit Spanje. Het CBMSO krijgt institutionele steun van Fundacion "Ramn Areces". VM werd ondersteund door een predoctorale beurs van het FPI-programma (BES- 2013-065986) van het Spaanse ministerie van Wetenschap.