De RNA M6 A-lezer YTHDF2 controleert NK-cel-antitumor- en antivirale immuniteit Deel 2

YTHDF2 is vereist voor de antivirale functie van NK-cellen

Om te bepalen of Ythdf2-deficiëntie de antivirale activiteit van NK-cellen beïnvloedt, injecteerden we 2,5 x 104 PFU MCMV in Ythdf2WT-muizen en Ythdf2ΔNK-muizen.

De resultaten toonden aan dat Ythdf2ΔNK-muizen gevoeliger waren voor MCMV-infectie, zoals blijkt uit aanzienlijk gewichtsverlies en verhoogde virale titers in het bloed, de milt en de lever vergeleken met Ythdf2WT-muizen (Fig. 3, A en B; en Fig. S2, A en B). .

We hebben ook een significante afname waargenomen in het percentage en het absolute aantal totale NK-cellen in de milt en het bloed van Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met die in Ythdf2WT-muizen na infectie (Fig. 3, C en D; en Fig.S2, C en D). Verdere analyse toonde aan dat NK-cellen van Ythdf2ΔNK-muizen een significant lagere expressie van Ki67 hadden dan Ythdf2WT-muizen (Fig. 3, E-G).

De levensvatbaarheid van NK-cellen is echter vergelijkbaar tussen Ythdf2WT-muizen en Ythdf2ΔNK-muizen, zoals blijkt uit annexine V-kleuring (Fig. S2 E). Deze gegevens geven aan dat het tekort aan YTHDF2 in NK-cellen resulteert in een defect in de celproliferatie in plaats van in celoverleving tijdens virale infectie. NK-cellen remmen de MCMV-infectie via de activerende receptoren Ly49H en Ly49D, en het proces wordt gekenmerkt door een perforine- of IFN-gemedieerde antivirale respons (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

We ontdekten dat Ythdf2ΔNK-muizen de Ly49H+- en Ly49D+-NK-cellen in de milt en het bloed significant hadden verminderd vergeleken met Ythdf2WT-muizen na infectie (Fig. 3, H – J; en Fig. S2, F – K).

Verdere analyse toonde aan dat hoewel per percentage alleen Ly49D+Ly49H+-cellen een verschil vertoonden in Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met dat van Ythdf2WT-muizen, de absolute celaantallen van Ly49D−Ly49H+ NK-cellen, Ly49D+Ly49H− NK-cellen en Ly49D+Ly49H+ NK-cellen in de milt en bloed waren allemaal significant verlaagd bij Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met Ythdf2WT-muizen na infectie (Fig. S2, L – W).

Onze gegevens suggereren dat het beheersen van MCMV-infectie door YTHDF2 voornamelijk gemedieerd lijkt te worden door Ly49D+Ly49H+ NK-cellen. De granzyme B- en IFN-productie door NK-cellen in Ythdf2ΔNK-muizen was vergelijkbaar met die van Ythdf2WT-muizen (Fig. S2, X en Y).

We vonden een significant verminderde perforineproductie door Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met die van Ythdf2WT-muizen in zowel de milt als het bloed 7 dagen na infectie (Fig. 3, K – M), wat aangeeft dat YTHDF2 voornamelijk perforine-gemedieerde antivirale activiteit tegen MCMV in NK-cellen beïnvloedt. Deze gegevens suggereren dat YTHDF2 cruciaal is voor NK-celexpansie en effectorfunctie tijdens MCMV-infectie.

YTHDF2 regelt de homeostase van NK-cellen en de terminale rijping in een stabiele toestand

De bovenstaande bevindingen dat Ythdf2-deficiëntie in NK-cellen de tumormetastasen versterkte en het verminderde vermogen van NK-cellen om MCMV-infectie onder controle te houden, moedigden ons aan om te onderzoeken of YTHDF2 nodig is voor het onderhoud van NK-cellen in een stabiele toestand.

Zoals getoond in Fig. 4A waren de frequentie en het absolute aantal NK-cellen significant verminderd in het perifere bloed, de milt, de lever en de longen, maar niet in het beenmerg (BM) van Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met Ythdf2WT-muizen.

Er waren echter geen significante veranderingen tussen de gemeenschappelijke lymfoïde voorlopercellen, pre-NK-celvoorlopercellen en verfijnde NK-celvoorlopercellen (NKP) in de BM (Fathman et al., 2011) tussen Ythdf2WT- en Ythdf2ΔNK-muizen (Fig. S3 A), wat aangeeft dat YTHDF2 heeft mogelijk geen invloed op de vroege ontwikkeling van NK-cellen in ons model.

Om de potentiële mechanismen te onderzoeken die verantwoordelijk zijn voor de afname van NK-cellen in Ythdf2ΔNK-muizen, onderzochten we de celproliferatie, levensvatbaarheid en transportcapaciteit van NK-cellen na Ythdf2-deletie in een stabiele toestand. Het percentage prolifererende NK-cellen was vergelijkbaar tussen Ythdf2WT- en Ythdf2ΔNK-muizen, zoals blijkt uit Ki67-kleuring (Fig. S3 B).

De levensvatbaarheid van NK-cellen was ook gelijkwaardig tussen Ythdf2WT- en Ythdf2ΔNK-muizen, zoals blijkt uit annexine V-kleuring (Fig. S3 C). Om te controleren of YTHDF2 de uitgang van NK-cellen van BM naar de periferie beïnvloedt, werden Ythdf2WT- en Ythdf2ΔNK-muizen iv geïnjecteerd met een antiCD45-antilichaam om immuuncellen te markeren en na 2 minuten opgeofferd, en hun BM-cellen werden geanalyseerd.

Hierdoor konden we het aantal NK-cellen in de sinusoïdale versus parenchymale gebieden van de BM kwantificeren, een indicator van de NK-celhandel van BM naar perifeer bloed in een stabiele toestand (Leong et al., 2015). De resultaten toonden een significante vermindering aan van de frequentie van CD45+ NK-cellen in Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met Ythdf2WT-muizen in de sinusoïden (Fig. 4 B), wat aangeeft dat Ythdf2-deficiëntie de uitgang van NK-cellen van BM naar het circulatiesysteem in vivo belemmert. .

Immuuncellen ondergaan homeostatische proliferatie tijdens lymfopenie veroorzaakt door bepaalde virale infecties of veroorzaakt door chemotherapie (Sun et al., 2011). Hoewel we ontdekten dat YTHDF2 overbodig is voor de proliferatie van NK-cellen in een stabiele toestand, hebben we een significante afname van de celproliferatie waargenomen tijdens MCMV-infectie (Fig. 3, E-G). We onderzochten daarom de rol van YTHDF2 bij het reguleren van de homeostatische proliferatie van NK-cellen in een lymfopenische setting in vivo.

We hebben een gelijk aantal milt-NK-cellen van CD45.2 Ythdf2ΔNK-muizen of CD45.1-congene muizen gecotransfereerd naar lymfocyt-deficiënte Rag2−/−Il2rg−/− muizen. De resultaten toonden aan dat een groter deel van de NK-cellen afkomstig was van CD45.1WT-controlemuizen dan van CD45.2 Ythdf2ΔNK-muizen op dag 3 na celoverdracht (Fig. S3 D).

Verdere analyse toonde aan dat de reductie van NK-cellen van Ythdf2ΔNK-muizen het gevolg was van verminderde celproliferatie (Fig. S3 E) maar niet van celapoptose (Fig. S3 F), wat suggereert dat YTHDF2 de homeostatische proliferatie van NK-cellen in vivo aanstuurt onder lymfopenische omstandigheden.

Verdere differentiatie van NK-cellen van muizen kan worden geclassificeerd in onvolwassen (CD11b−CD27+), intermediair volwassen (CD11b+CD27+) en terminaal volwassen (CD11b+CD27−) stadia op basis van CD11b- en CD27-niveaus ( Chiossone et al., 2009; Geiger en Sun, 2016).

We ontdekten dat de Ythdf2-expressie toenam met de rijping en dat CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− respectievelijk de laagste, gemiddelde en hoogste expressieniveaus van Ythdf2 vertoonden (Fig. S3 G), wat aangeeft dat YTHDF2 mogelijk betrokken is bij de rijping van NK-cellen. We onderzochten daarom de rol van YTHDF2 in de rijping van NK-cellen, gedefinieerd door de celoppervlakmarkers CD11b en CD27.

We ontdekten dat verlies van Ythdf2 in NK-cellen resulteerde in een significante afname van de frequentie van terminale rijpe NK-cellen en/of een toename van onrijpe en intermediaire rijpe NK-cellen in de milt, lever, long en bloed, maar niet in BM (Fig. 4C en 7). Fig. S3 H), wat aangeeft dat YTHDF2 de rijping van terminale NK-cellen positief reguleert. In overeenstemming met deze gegevens waren de niveaus van KLRG1, een marker voor terminale NK-celrijping, significant lager bij Ythdf2ΔNK-muizen in de milt, lever en long, maar niet in BM vergeleken met die van Ythdf2WT-muizen in de overeenkomstige organen of weefselcompartimenten (Fig. 4 D).

Om te bepalen of het verminderde aantal volwassen NK-cellen door Ythdf2-deficiëntie cel-intrinsiek is, creëerden we hersenschimmen in Rag2−/−Il2rg−/− muizen door BM-cellen van CD45.1 WT- en CD45.2 Ythdf2ΔNK-muizen te injecteren, gemengd in een verhouding van 1:1 verhouding. Zoals blijkt uit flowcytometrie 8 weken na transplantatie, werd een kleiner aandeel terminale rijpe NK-cellen afgeleid van CD45.2 Ythdf2ΔNK BM-cellen dan die van CD45.1 WT-controlecellen (Fig. 4 E), wat suggereert dat de terminale rijping van NK-cellen wordt gecontroleerd door YTHDF2 is celintrinsiek.

T-box-transcriptiefactoren Eomes en Tbet zijn cruciaal voor de rijping van NK-cellen (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Intracellulaire kleuring onthulde een significante reductie in de eiwitniveaus van Eomes in NK-cellen van Ythdf2ΔNK-muizen vergeleken met Ythdf2WT-muizen (Fig. S3 I). Bovendien ontdekten we dat de reductie van eiwit- en mRNA-niveaus van Eomes specifiek plaatsvond in terminaal volwassen (CD11b + CD27-) NK-cellen (Fig. S3, J-L).

In tegenstelling tot Eomes was de expressie van Tbet echter equivalent in NK-cellen tussen Ythdf2ΔNK- en Ythdf2WT-muizen (Fig. S3, I en K), wat aangeeft dat YTHDF2 mogelijk de terminale rijping van NK-cellen reguleert door zich op Eomes te richten.