Therapeutisch effect van Cistanoside A op het botmetabolisme van muizen waarbij de eierstokken zijn verwijderd

1. Inleiding

Osteoporose, een systemische ‘stille moordenaar’ van het skelet, is de afgelopen jaren een groot gevaar voor de gezondheid geworden waar ruim 2 miljard mensen wereldwijd last van hebben. Het wordt gekenmerkt door een lage botmassadichtheid (BMD) en micro-architecturale achteruitgang, die voortkomen uit een overmaat aan botresorptie ten opzichte van botvorming en uiteindelijk resulteren in osteoporotische fracturen. Tegenwoordig is de identificatie van middelen die de differentiatie en resorptie van osteoclasten blokkeren de gebruikelijke en succesvolle strategie voor de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen voor osteoporose, en er zijn inderdaad veel synthetische middelen, waaronder estradiolvaleraat en natriumalendronaat, die dit zouden kunnen doen.osteoporose voorkomen en behandelen. De medicijnen voor de ziekten zijn echter verre van ideaal; Sommige van deze geneesmiddelen kunnen het risico op endometrium- en borstkanker verhogen en hebben ook een zekere mate van bijwerkingen, zoals hypercalciëmie, hypercalciurie, enz., die hun klinische toepassingen beperken. Daarom worden traditionele Chinese medicijnen (TCM), vooral eetbare TCM met geïsoleerde bioactieve verbindingen en fracties, al meer dan een millennium op grote schaal veilig en effectief gebruikt in Aziatische landen om verschillende ziekten, waaronder osteoporose, te voorkomen en te behandelen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET BEHANDELEN EN VOORKOMEN VAN OSTEOPOROSE ZIEKTE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Osteoporose wordt gekarakteriseerd als een verhoogde botresorptie als gevolg van verhoogde osteoclastogenese, en dit proces omvat de inzet van hematopoietische monocyten in osteoclastvoorlopers, die samensmelten om meerkernige osteoclasten te vormen die zich richten op botplaatsen die hermodellering ondergaan [4]. Receptoractivator voor nucleaire factor-KB-ligand (RANKL), een sleutelfactor die wordt uitgescheiden door osteoblasten, stimuleert de differentiatie van monocyten tot osteoclasten [8,9]. De interactie van RANKL met zijn receptor RANK resulteert in een cascade van intracellulaire gebeurtenissen, waaronder NF-KB, PI3K/Akt en calcium/calmoduline-afhankelijke kinase door het rekruteren van het adaptersignaaleiwit TNF-receptor-geassocieerde factor (TRAF6). Als gevolg hiervan worden verschillende osteoclast-gerelateerde markergenen, waaronder TRAP, cathepsine K en DPD, opgereguleerd en wordt het proces van botresorptie versneld.

Fenylethanoïdeglycosiden worden gekenmerkt door kaneelzuur- en hydroxylfenylethylgroepen die via een glycosidische binding aan een glucopyranose (apiose, galactose, rhamnose, xylose, enz.) zijn gebonden, die wijd verspreid zijn in geneeskrachtige planten [10]. Cistanoside A (Cis A) is een actieve stoffenylethanoïde glycosidein Cistanche deserticola YC Ma. Volgens de gegevens van de Chinese farmacopee werd C. deserticola traditioneel gebruikt voor de behandeling van nier-yin-deficiëntie, spierzwakte, lumbale zwakte, enz., en zijn fenylethanoïdeglycosiden de belangrijkste bioactieve bestanddelen in dit kruid [11]. Gebaseerd op de 'nier'-theorie van TCM, zou de nier het botsysteem kunnen besturen, wat betekent dat de ontwikkeling en functies van de botten afhankelijk zijn van de nier-essentie, en deze nier-essentie kan transformeren in het beenmerg om de botten te voeden. bevorderen de groei en het herstel van het skelet en versterken het skelet [12]. Omdat C. deserticola de nieren kon versterken, veronderstelden we dat Cis A osteoporose kon voorkomen en behandelen. Het huidige onderzoek was daarom bedoeld om het potentieel vanCis A bij het voorkomen van osteoporosedoor gebruik te maken van een muizenmodel waarbij de eierstokken zijn verwijderd, werden botvormings- en resorptiemarkers, evenals de gerelateerde potentiële mechanismen, bepaald om de anti-osteoporotische bioactiviteit van dit middel te schatten.

2. Resultaten en discussie

2.1. Resultaten

2.1.1. Effecten van Cis A op driepuntsbuigtesten van botten

Om te analyseren of de behandeling met Cis A het bot sterker maakt, hebben we de dijbenen onderworpen aan de driepuntsbuigtest. Zoals weergegeven in Figuur 1 was de maximale belasting die werd uitgeoefend bij botbreuken 21,5% en 22,0% hoger bij de dieren behandeld met 20 mg/kg en 80 mg/ kg Cis A, respectievelijk, vergeleken met dieren in de groep waarbij de eierstokken zijn verwijderd (OVX) (p < 0.05). Ondertussen verbeterde de behandeling met Cis A ook de botstijfheid; alle met Cis A behandelde muizen vertoonden een significant verhoogde stijfheid met gegevens van respectievelijk 121.0 ± 12,1 (p < 0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) en 127,7 ± 9,6 (p < 0,01), vergeleken met 102,2 ± 10,7 van de OVX-muizen. De resultaten geven aan dat de toegenomen botsterkte bij de OVX-muizen behandeld met Cis A te wijten was aan een verhoogde hoeveelheid bot en een verbetering van de botkwaliteit.

2.1.2. Effecten van Cis A op botmicroarchitectuur

Driedimensionale trabeculaire botmicroarchitectuur van muizen gemeten met micro-CT (Figuur 2 en Tabel 1) laat intuïtief zien dat de muizen in de OVX-groep een opmerkelijke vermindering van het trabeculaire gebied en het trabeculaire aantal vertoonden in vergelijking met de schijngroep, wat aangeeft dat ovariëctomie zou een opmerkelijke afname kunnen veroorzaken in de botmassadichtheid (BMD, −46%), het botmineraalgehalte (BMC, −66%), het weefselmineraalgehalte (TMC, −85%), de botvolumefractie (BVF, −82%), trabekelgetal (Tb. N, −76%) en een toename in trabekelscheiding (Tb. Sp, +80%) zonder enige wijziging in de totale weefselmineraaldichtheid (TMD) en trabekeldikte (Tb. Th) na de werking van 12 weken. De OVX-muizen die met Cis A werden behandeld, resulteerden echter in dosisafhankelijke verhoogde BMD (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), grotere reductie in Tb. Sp (−79% ~88%) en verder verbeterde Tb. N (+73%~82%) vergeleken met de OVX-groep. TMD leek niet te worden beïnvloed door de ovariëctomie, maar werd significant verhoogd door behandeling met estradiolvaleraat (EV).

2.1.3. Effecten van Cis A op zowel de botvorming als de resorptiemarkers

De effecten van Cis A op botresorptiemarkers, waaronder TRAP, DPD, cathepsine K botvormingsindex ALP en bot Gla-eiwit (BGP), worden weergegeven in Figuur 3. Na 12 weken ovariëctomie zijn de activiteiten van TRAP, DPD en cathepsine K in de OVX-groep waren aanzienlijk verhoogd, vooral DPD, die met bijna 55,6% toenam; TRAP en cathepsine K waren respectievelijk met 43,5% en 38,1% verbeterd in vergelijking met de schijngroep. Cis A, oraal toegediend gedurende 12 weken, vertoonde een opmerkelijk potentieel bij het voorkomen van alle bovengenoemde botresorptiemarkers, vooral de hoge dosering (80 mg/kg) die een significant effect vertoonde op het onderdrukken van de activiteiten van DPD met respectievelijk 45,0%, TRAP met 49,0% en cathepsine K met 44,0% (p < 0,01), vergeleken met de OVX-groep (Figuur 3). Hoewel er een stijgende trend van ALP- en BGP-activiteiten werd aangetoond in de OVX-groep, werden er geen statistisch significante veranderingen waargenomen. Er werd echter een significante verbetering in ALP-activiteit waargenomen in groepen die met een lage en hoge Cis A-behandeling werden behandeld, vergeleken met de schijngroep (p < 0,01).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VOORKOMEN VAN OSTEOPOROSE ZIEKTEPHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. Effecten van Cis A op eiwitexpressieniveaus van TRAF6, NF-KB PI3K, Akt, OPG en RANKL

Uit Western blot-analyse bleek dat vergeleken met de schijngroep de eiwitniveaus van TRAF6, NF-KB en RANKL in de OVX-groep significant waren verhoogd (p < 0.05), terwijl OPG, PI3K en Akt waren aanzienlijk afgenomen (Figuur 4). Cis A (20 mg/kg of 80 mg/kg) verlaagde de TRAF6-expressie aanzienlijk (p < 0,05), gevolgd door een afname van de RANKL-expressie en een toename van OPG, wat betekent dat de OPG/RANKL-verhouding werd opgereguleerd. Bijgevolg werden de signaalcascades van NF-KB gedownreguleerd en werd PI3K/Akt opgereguleerd door behandeling met Cis A (p <0,05).

2.2. Discussie

Gezien de beperkingen van de huidige therapeutische opties voor osteoporoseziekte, is er behoefte aan alternatieven uit voedsel of natuurlijke eetbare geneeskrachtige planten. Als onderdeel van onze voortdurende inspanningen om effectieve anti-osteoporotische middelen uit TCM te ontdekken, hebben we een reeks extracten, fracties en verbindingen gevonden die het effect van anti-osteoporotische eigenschappen bezitten [13,14]. Cistanche deserticola is een belangrijke klassieke TCM, waarvan werd vastgesteld dat deze een gunstig veiligheidsprofiel [15] en brede medicinale functies bezit voor de behandeling van nierdeficiëntie, enz. [16]. Volgens de theorie van TCM waren TCM meestal het effect van het stimuleren van de nierengebruikt voor de behandeling van osteoporose; fenylethanoïdeglycosiden zijn de belangrijkste bioactieve bestanddelen in dit kruid, wat dit impliceertfenylethanoïde glycosidenin C. deserticola kan een antiosteoporotische eigenschap bezitten. Het is bewezen dat het extract van C. deserticola de vermindering van de BMD aanzienlijk kan remmen en de verslechtering van de trabeculaire microarchitectuur veroorzaakt door OVX kan voorkomen [17]. In het in vitro experiment verhoogde het ook aanzienlijk de ALP, het botmorfogenetisch eiwit-2 en osteopontine-mRNA, evenals de botmineralisatie van gekweekte osteoblasten [18]. Echinacoside, een belangrijke bioactieve component in C. deserticola, officieel geregistreerd in de Chinese farmacopee [11], vertoonde anti-osteoporotische activiteit bij een hoge dosering van 30-270 mg/kg lichaamsgewicht/dag [19], en verdere in vitro resultaten lieten zien dat het zou botregeneratie kunnen bevorderen door de OPG/RANKL-rantsoen in MC3T3-E1 Subclone 14-cellen te verhogen [20]. Cis A was een van de fenylethanolglycosiden geïsoleerd uit C. deserticola, en verschillende rapporten onthulden dat deze verbinding antioxidatieve activiteit [21] en ontstekingsremmende eigenschappen bezat [22,23]. Een onlangs gepubliceerd artikel ontdekte dat Cis A beschermende activiteiten vertoonde op zowel CCl4 als door alcohol geïnduceerde hepatotoxiciteit bij muizen, en het toonde ook een beschermende eigenschap op door ethanol geïnduceerde schade in primair gekweekte hepatocyten van muizen in vitro [24]. In onze huidige studie toonden de resultaten aan dat Cis A antiosteoporotische activiteit bezat bij een lage dosering (20 ~ 80 mg/kg lichaamsgewicht/dag) door gebruik te maken van een muizenmodel waarbij de eierstokken waren verwijderd, en deze bioactiviteit werd uitgeoefend door het niveau van TRAF6 te verlagen, waardoor de expressie van RANKL en NF-KB en het stimuleren van OPG, PI3K en Akt, wat betekent dat het therapeutische effect van Cis A in OVX-muizen plaatsvond via het mechanisme van TRAF6-gemedieerde NF-kappaB-inactivatie en PI3K/Akt-activering.

Het is algemeen bekend dat ovariëctomie osteoporose kan veroorzaken met een duidelijke afname van de BMD, biomechanische sterkte, botkwaliteit en trabeculaire botmicroarchitectuur, en de bovengenoemde veranderingen zijn gedeeltelijk te wijten aan oestrogeendeficiëntie [25]. In het huidige in vivo experiment toont onze studie aan dat door ovariëctomie geïnduceerde osteoporose resulteerde in een significante vermindering van de biomechanische sterkte en trabeculaire structurele parameters, waaronder BMD, BMC, TMC en Tb. N, en toenemende Tb. Sp; en behandeling van Cis A verbeterde de botmechanische eigenschappen, waaronder maximale belasting en stijfheid, aanzienlijk, verbeterde de BMD en verbeterde de meeste structurele parameters van de trabeculaire microarchitectuur van het bot in vergelijking met de muizen in de OVX-groep, wat aangeeft dat Cis A effectief was in het verbeteren van de botkwaliteit en trabeculaire microarchitectuur in OVX-muizen.

Naast de totale BMD konden de driepuntsbuigtest en trabeculaire botmicroarchitectuurmeting osteoporose direct diagnosticeren, de botvormingsmarkers, waaronder ALP en BGP, en de botresorptie-index, waaronder TRAP, DPD en cathepsine K, werden ook gebruikt om de gerelateerde antiosteoporotische mechanismen van Cis A ophelderen. In onze studie vertoonde ALP-activiteit in de muizen uit de OVX-groep een niet-significante stijgende trend, die duidde op een verhoogde snelheid van botombouw [26,27] bij postmenopauzale osteoporose; de hoge (80 mg/kg lichaamsgewicht/dag) en lage (20 mg/kg lichaamsgewicht/dag) dosering van Cis A-behandelingen vertoonden een significante verbetering van de ALP-activiteit vergeleken met de schijngroep, terwijl de BGP-activiteit niet leek te worden beïnvloed door de ovariëctomie in alle behandelde groepen; TRAP, DPD en cathepsine K waren significant verhoogd in de OVX-groep, en toediening van Cis A verlaagde met name alle drie de botresorptiemarkers. De bovenstaande gegevens impliceerden dat Cis A potentiële antiosteoporotische activiteit bezat, en dit effect werd uitgeoefend door de regulatie van het botmetabolisme, waaronder zowel het onderdrukken van botresorptie als het verhogen van de botvorming.

De coördinatie tussen osteoblast en osteoclast is een kritische factor bij het behoud van de skeletintegriteit. Osteoclasten, die TRAP tot expressie brengen, hechten zich aan het botoppervlak door de vorming van aan actine gebonden afdichtingszones, waarbinnen proteolytische enzymen, zoals cathepsine K, vrijkomen, wat leidt tot de vorming van resorptieputten. De modulatie van osteoclastogenese door onrijpe cellen van de osteoblastische lijn wordt gemedieerd door RANKL en OPG [28]. OPG is een lokreceptor die de RANKL-activering van osteoclastogenese remt, waardoor de botresorptie wordt verminderd. RANKL, dat een belangrijk signaal levert aan osteoclastvoorlopercellen, is een membraangebonden molecuul van de tumornecrosefactorligandfamilie dat de vorming van osteoclasten bevordert. Aangenomen wordt dat de verhouding van OPG/RANKL-expressie een sleutelparameter is van osteoclastogene activiteit, en signaalcascades geactiveerd door RANKL omvatten de NF-KB- en PI3K-routes [29]. Het belang van de NF-KB-route voor osteoclastogenese wordt aangetoond door het feit dat deletie van NF-KB bij muizen resulteerde in de afwezigheid van volwassen osteoclasten [30]. TRAF6 bleek een veelbelovend doelwit voor nieuwe anti-osteoporotische geneesmiddelen. TRAF6-deficiënte muizen die defectieve osteoclastogenese en ernstige osteopetrose vertoonden, toonden dus het belang van TRAF6 in het botmetabolisme aan. Opkomend bewijs wijst op een kritische regulerende functie voor TRAF6 in RANKL/RANK-gemedieerde signaalcascades [4,31]. De gegevens van de huidige studie gaven aan dat Cis A-behandeling op de OVX-muizen resulteerde in de downregulatie van TRAF6-eiwitexpressieniveaus, verlaagde RANKL en verhoogde OPG-expressies, waardoor RANKL-activering van stroomafwaartse NF-KB werd voorkomen en de PI3K / Akt-signaalroutes werden geactiveerd. wat suggereert dat Cis A de differentiatie van osteoclast remt door TRAF6-gemedieerde NF-kappaB-inactivatie en PI3K/Akt-activering en het verhogen van de OPG/RANKL-ratio, waardoor vervolgens de osteoclastogenese wordt geremd en de botvorming wordt bevorderd.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOORANTIOSTEOPOROTISCHE ACTIVITEITPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Materialen en methoden

3.1. Plantmaterialen, voorbereiding en bepaling

Stengels van Cistanche deserticolaYC Ma, geïdentificeerd door prof. Xue-yan Fu van de afdeling Farmacie, Ningxia Medical University, werd op 2015 september verzameld in Yongning County, provincie Ningxia, China. Een bonexemplaar (#20150901) werd bewaard in het herbarium van de apotheekafdeling. In totaal werd 30,0 kg aan de lucht gedroogde stengels van C. deserticola driemaal onder reflux geëxtraheerd met 70% ethanol (180 l, 3 x 2 uur). De filtraten werden gecombineerd en onderworpen aan een macroporeuze harskolom (AB-8) met een stapsgewijs gradiënt-oplosmiddelsysteem van toenemende ethanol in water (0%, 20% en 60%, elk 60 L), waardoor drie fracties werden verkregen. 60% van de fractie werd verder gezuiverd met Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Zweden) en semi-preparatieve hoogwaardige vloeistofchromatografie (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Duitsland) om lichtgeel te verkrijgen cistanoside A 4,5 g (Cis A; de opbrengst was 0,015%). De structuur werd voornamelijk opgehelderd door NMR- (Bruker Avance, 400 MHz, Duitsland) en MS-spectra (Agilent 6540, Agilent Technologies) data-analyses, die consistent waren met de gerapporteerde gegevens [19]. De zuiverheid ervan werd bepaald met behulp van de HPLC-gebiednormalisatiemethode (Figuur 5). In dierproeven, gebaseerd op ons voorlopige experiment, was de dosering van Cis A 20-80 mg/kg/dag.

3.2. Chemicaliën en oplosmiddelen

Het volgende werd gebruikt: totale eiwitextractiekit en BCA-eiwitkwantiseringskits (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, China), primaire antilichamen van TRAF6, NF-KB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -actine en tubuline ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS), secundaire antilichamen van mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geit-anti-konijn IgG (ZSGB-BIO, Beijing, China), estradiolvaleraat (1 mg, Delpharm Lille SAS, Parijs, Frankrijk), bot Gla -eiwit en deoxypyridinoline crosslinks ELISA-kits (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China) en de cathepsine K ELISA-kit (Biovision, Mountain View, CA, VS). Alle andere gebruikte chemicaliën en biochemische middelen waren reagentia van AR-analytische kwaliteit.

3.3. Dierproeven

Zestig vrouwelijke muizen van de Kunming-stam, 8 weken oud en een lichaamsgewicht van 26,0 ± 1,62 g, werden gekocht bij de Ningxia Medical University, en 10 muizen werden in één kooi gehouden met een standaard laboratoriumdieet en kraanwater onder luchtgecontroleerde omstandigheden (24,0 ± 0,5 ◦C, 45%–50% vochtigheid en 12 uur/12 uur licht-donker verlichtingscycli). Na 1 week te zijn geacclimatiseerd, werd de operatie onder aseptische omstandigheden uitgevoerd en werden alle muizen verdoofd met chloraalhydraat (100 mg/kg, ip); de muizen die werden blootgesteld aan een chirurgische ingreep zonder de eierstokken te verwijderen, waren de schijngroep (n=10); de anderen werden onderworpen aan bilaterale ovariëctomie als de OVX-groepen (n=50). De bovenstaande dierproeven zijn uitgevoerd volgens de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de Bio-ethische Commissie van de Ningxia Medical University.

Na nog een herstelperiode van {0}} weken werden de bovengenoemde 50 OVX-muizen willekeurig en gelijk verdeeld in 5 groepen: oraal behandeld met estradiolvaleraat (1 mg/kg/dag) als de positieve controle (EV); met respectievelijk 20, 40 en 80 mg/kg/dag Cis A als de lage, matige en hoge doseringsgroepen; met het voertuig (0,5% carboxymethylcellulose()-Na) als modelgroep (OVX). Aan alle muizen werd oraal een gelijk volume van 1 ml/100 g lichaamsgewicht vehikel, EV of Cis A, toegediend, dat begon in de tweede week na de operatie en 12 weken duurde. Het lichaamsgewicht werd tweewekelijks gemeten, waarbij de dosis dienovereenkomstig werd aangepast. Na de laatste orale toediening werden bloedmonsters uit de femorale slagader van verdoofde muizen genomen, laten stollen en gedurende 10 minuten bij 3000 x g gecentrifugeerd om serum op te leveren; de rechter femora en tibia werden ontleed. Alle monsters werden bewaard bij -80 ◦C voor verdere evaluatie van de botmicroarchitectuur en osteoporotisch-gerelateerde serumbiochemische parameters.

3.4. Driepuntsbuigtesten

De biomechanische eigenschap van het rechterdijbeen van de muis werd bepaald met behulp van een driepuntsbuigopstelling. De buigmal heeft een V-vormige steun om de distale en proximale uiteinden van het femur tijdens het testen vast te zetten. Het dijbeen werd horizontaal geplaatst met de voorkant naar boven, en de belasting werd naar beneden uitgeoefend in het midden van het middendijbeen. De afstand tussen de steunen bedroeg 8 mm. De botten werden belast met een constante verplaatsingssnelheid van 0,02 mm/s totdat ze faalden met behulp van een BOSE Testing Machine (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, VS). De belasting-verplaatsingscurven werden verkregen en gebruikt voor de berekening van de structurele en materiaaleigenschappen, inclusief maximale belasting, piekbelasting, elastische modulus, buigsterkte, enz.

3.5. Micro-computertomografie-analyse

De rechter dijbenen van alle muizen werden ontdaan van vastzittende zachte weefsels, en de trabeculaire botmicroarchitectuur van de rechter distale femorale metafysica hierboven werd bepaald door een micro-CT-scanner (eXplore Locus SP, GE Healthcare, Londen, ON, Canada) met de isotrope resolutie is ingesteld op 8 µm in alle drie de ruimtelijke dimensies. Het interessegebied (ROI) werd geselecteerd door dezelfde coördinaten te gebruiken in de groeischijf van het dijbeen. De botmorfometrische parameters, waaronder BMD, botmineraalgehalte (BMC), weefselmineraalgehalte (TMC), weefselmineraaldichtheid (TMD), botvolumefractie (BVF), trabeculaire scheiding (Tb. Sp), trabeculair getal (Tb. N ) en trabeculaire dikte (Tb. Th), werden geëvalueerd door het analyseren van de ROI met behulp van ABA-botanalysesoftware.

3.6. Analyse van biochemische parameters

De activiteit van serumalkalinefosfatase (ALP) werd gemeten op een automatische analysator (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, VS)); de niveaus van serum DPD, BGP en cathepsine K werden bepaald door overeenkomstige reagenskits, en tartraatresistente zure fosfatase (TRAP) werd geanalyseerd volgens de gerelateerde literatuur [32].

3.7. Western Blot-analyse

Eiwitexpressieniveaus van TRAF6, NF-KB PI3K, Akt, OPG en RANKL in verschillende groepen werden gedetecteerd door Western-blot-analyse. In het kort werd het eiwit geëxtraheerd uit het rechter scheenbeen van muizen met behulp van een lysisbuffer die 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride, protease en fosfataseremmers bevatte. Lysaten werden 10 minuten bij 12,000 x g gecentrifugeerd om de supernatanten te verkrijgen voor verdere analyse. De eiwitconcentratie van de lysaten werd gemeten met behulp van een bicinchoninezuurkwantificeringstest. Eiwitten (50-100 μg) werden gescheiden met behulp van 10% SDS-PAGE, overgebracht naar een polyvinylideendifluoridemembraan en geïncubeerd met monoklonale primaire antilichamen gericht op TRAF6, NF-KB RANKL, PI3K, Akt, OPG en -actine (1:500). Hetzelfde membraan werd gestript en opnieuw onderzocht, waarbij chemiluminescente signalen werden gedetecteerd door de Image Lab-software. -actine of tubuline dienden als interne controle.

3.8. Statistische analyse

Alle gegevens verkregen uit dierproeven werden geanalyseerd met behulp van een eenzijdige variantieanalyse met de Dennett-test van SPSS (versie 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, New York, NY, VS. ) software; een waarde van p < 0.05 werd als statistisch significant beschouwd en alle resultaten werden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD.

4. Conclusies

Samenvattend, Cis A,actieve fenylethanoïdeglycosidengeïsoleerd uit C. deserticola, vertoonde een significante antiosteoporotische activiteit op OVX-muizen, en het moleculaire mechanisme kan verband houden met TRAF6-gemedieerde NF-kappaB-inactivatie en PI3K/Akt-activering, dus waarschijnlijk een veelbelovend middel voor de behandeling van osteoporose ziekte.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOORANTIOSTEOPOROTISCHE ACTIVITEITPHGS75% ECH 30% ACT 12%