Abstract:GebruikCistanche woesticolaParasiterende twee gastheerplanten (haloxylon ampodendron en atriplex canescens) als testmaterialen, deze studie bepaalde het polysaccharidegehalte in C. woesticola uit verschillende gastheren met behulp van de fenol-sulfurinezuurmethode. Transcriptoomsequencing en analyse van haloxylon-cistanche enAtriplex-cistanche-verenigingenwerden uitgevoerd met behulp van het Illumina Novaseq 6000 -sequencingplatform. Het onderzoek was gericht op het onderzoeken van transcriptoomverschillen in C. woesticola van verschillende gastheren, screening belangrijke enzymatische genen die betrokken zijn bij het metabolisme van polysacchariden en het valideren van de geselecteerde genen door QRT-PCR-verificatie. Deze studie is bedoeld om een ​​theoretische basis te bieden voor het verkennen van nieuwe gastplanten en genetische verbetering van C. deserticola. Het resultaat toonde aan dat het polysacharidegehalte in Atriplex Quadriptera-C.Deserticola superieur was aan dat aanwezig in haloxylon ampodendron-C. Deserticola. Door vergelijkende analyse van transcriptoom werden 14089 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) gescreend uit de vlezige stengels van Atriplex quadriptera-C. Deserticola en Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Uit de resultaten van KEGG -verrijkingsanalyse bleek dat deze DEG's het meest prominent werden verrijkt in routes gerelateerd aan koolhydraatmetabolisme, galactosemetabolisme, aminozuurmetabolisme en vetzuurmetabolisme. Verder werden in totaal 26 graden verkregen uit vier routes gerelateerd aan polysaccharidemetabolisme, waaronder de expressieniveaus van fructosidase -gen en -galactosidase -gen in haloxylon ampodendron -C. Deserticola was aanzienlijk hoger dan die in Atriplex quadriptera-C. Deserticola. De expressieniveaus van UDP-glucose dehydrogenase-gen en mannose -1- fosfaat guanylaattransferase-gen in Atriplex quadriptera-c. Deserticola was aanzienlijk hoger dan die in haloxylon ampodendron-C. Deserticola, die de belangrijkste enzymgenen kunnen zijn voor het reguleren van het verschil in polysaccharide -metabolisme in C. woesticola.

Trefwoorden Cistanche woesticola; transcriptoomsequencing; gastheren; Verschil van polysacharide -metabolisme

Cistanche woesticola

 

Cistanche woesticola yc ma, voornamelijk verdeeld inGansu, Xinjiang, Ningxia en Inner Mongolië, is een traditioneel Chinees medicinaal kruid dat onlangs is opgenomen in de"Medicinaal en voedsel homoloog"catalogus. Het heeft verschillende gezondheidsvoordelen, zoalsTonifying nier yang, voedende essentie en bloed, en het bevorderen van stoelgang, waardoor het op grote schaal wordt toegepast inGeneeskunde, gezondheidszorg en de voedingsindustrie[1]. Vanwege zijnheterotrofe aard, Cistanche woesticolaparasiteert verschillende hostplanten, metHaloxylon Ammodendronen de nieuw geïntroduceerdesemi-ergreen struikAtriplex canescens(Pursh) Nutt.zijn primaire gastheren.

Polysachariden zijn de belangrijkste actieve stoffen bij het evaluerenCistanche woesticolakwaliteit. Onder verschillende hostomstandigheden, deAccumulatie en metabole samenstellingvanCistanchePolysachariden variëren aanzienlijk [2]. Medisch onderzoek heeft dat aangetoondCistanchePolysacchariden bezittenAntioxidant, neuroprotectief, immuunregulerend en geheugenverbeteringFarmacologische effecten, effectief verlichtDe ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en door lever depressie geïnduceerde miltgebrek[3]. Met vorderingen in het moderneExtractietechnieken en multi-spectrum analysetechnologieën, deInhoud, compositie en structurele kenmerkenvanCistanchePolysachariden worden geleidelijk opgehelderd, waardoor hun toepassingen worden uitgebreid.

In termen vanMolecular Biology ResearchopCistancheSoorten, transcriptoomsequencingstudies zijn voornamelijk gericht opCistanche tubulosaEnHaloxylon-CistancheComplexe systemen.Bijvoorbeeld,Hou et al.[4] uitgevoerdTranscriptoomsequencing op volledige lengte en genexpressieprofileringvanCistanche tubulosagebruikPacbio en Bgiseq -500 RNA-Seq Technologies, identificeren237.772 unieke transcriptiesen screening belangrijke enzymgenen die betrokken zijn bijfenylethanoïde glycoside biosynthese. Evenzo,Feng et al.[5] uitgevoerdtranscriptomische en metabolomische analysesvan de Haustoria en aangrenzende weefsels vanHaloxylonwortels enCistanchevlezige stengels, het onthullen van de rol van de gastheer bij de accumulatie vanCistanchemetabolieten. Hun studie benadrukte dat degastheerfabriek heeft niet alleen invloed op de opbrengst vanCistancheMaar ook de kwaliteit. Onderzoek naar echterCistancheHet parasiteren van verschillende gastplanten blijft beperkt.

Atriplex canescens, a diepgewortelde en zeer stressbestendige plant, verschilt van het traditioneleHaloxylongastheeren is afkomstig van desemi-aride plateaus van de centrale Verenigde Staten. In de afgelopen jaren is het geïntroduceerd en gepromoot als eennieuwe gastheer voorCistanche woesticolateeltinNoordwest -China. An Qing et al.[6] analyseerde en vergeleken dePolysaccharide -accumulatie vanCistancheParasiteren van haloxylon en atriplex canescensin hetzelfde productiegebied, vindenSignificante verschillen in polysacharide -inhoudtussen de twee hostomstandigheden.

Dus deze studie heeft tot doelvolgorde de vlezige stengels vanCistanche woesticolaParasiteren van haloxylon en atriplex canescens, analyseren van deDifferentiële expressie van belangrijke enzymgenen die betrokken zijn bij polysacharide biosynthese. De bevindingen bieden eenTheoretische basis voor verder onderzoek naarCistanchePolysaccharide biosynthesemechanismen, verrijk transcriptomische studies over atriplex-Cistanchesystemen, en bevorderen innovatie in hoge kwaliteitCistancheGermplasm -bronnen.

 

Materialen en methoden

1.1 Experimentele materialen

Cistanche woesticolamonsters parasitiserenHaloxylon AmmodendronEnAtriplex canescenswerden verzameld van deCistancheteeltbasis inXiquan Town, Jingtai County, de provincie Gansu(breedte36 graden 5 'n, lengtegraad103 graden 42 'E). BeideHaloxylonEnAtriplex canescenswerden gecultiveerd in dezelfde omgeving. De monsters werden gecategoriseerd alsHaloxylon-Cistanche(Voorbeeld a)EnAtriplex-Cistanche(Monster h),met drie replicaten voor elke categorie (vijf planten per replicaat). Bemonstering werd uitgevoerd inApril 2024, en de monsters werden geïdentificeerd alsCistanche woesticolavlezige bollen doorProfessor Guo Yehongvan deCollege of Agriculture, Gansu Agricultural University.

Na deProefrichtlijnen van Shanghai OE Biotech Co., Ltd., deCistancheVleesachtige stengels werden gespoeld met ultrazuinig water en overtollig vocht werd verwijderd met behulp van filterpapier. Dunne plakjes werden genomen van deboven, midden en onderkantvan elke stengel, grondig gemengd en in cryogene flesjes geplaatst. De monsters warenSnel ingevroren in vloeibare stikstofvoor2 uurVoordat u wordt overgebracht naar een-80 Degree vriezervoor opslag [7].

1.2 Experimentele methoden

1.2.1 Stand van standaardcurve en bepaling van het polysacharide -gehalte

A 10 mgin een voorbeeld zijn vanD-glucosestandaardwerd nauwkeurig gewogen en opgelost in een100 ml volumetrische kolfmet gedestilleerd water om een100 ug · ml⁻¹ Stockoplossing. Kalibratieoplossingen van{{{0}}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 en 0,9 mlvan de voorraadoplossing werden overgebracht naar10 ml gestopte testbuizen, verdund met water tot1. 0 ml, en vervolgens gemengd met1. 0 ml van 6% fenoloplossingEn5 ml geconcentreerd zwavelzuur. Na het werven werden de oplossingen verwarmd in een kokend waterbad voor20 minuten, vervolgens gekoeld in een ijswaterbad voor10 minuten. A blanco controlewerd voorbereid met behulp van1. 0 ml gedestilleerd waterin plaats van de glucoseoplossing. De absorptie werd gemeten bij482 nmeenUV-vis spectrofotometer, en eenstandaardcurvewerd gegenereerd metConcentratie (x) als de horizontale asEnabsorptie (y) als de verticale as.

Na een aangepaste aanpak vanLi Jie et al. [8], 0. 2 g gedroogdCistanchepoederwerd nauwkeurig gewogen en geplaatst in een20 ml gestopte testbuis. 10 ml 80% ethanolwerd toegevoegd en het mengsel werd onderworpenUltrasone extractie bij 80 graden (100 W, 40 kHz) gedurende 30 minuten. Het extract werd gefilterd terwijl het heet is en de procedure werd eenmaal herhaald. Na het drogen van het residu,10 ml gedestilleerd waterwerd toegevoegd en ultrasone extractie werd tweemaal herhaald. De filtraten werden gecombineerd en verdund20 mlmet gedestilleerd water.1. 0 ml van deze oplossingwerd verder verdund tot10 mlmet gedestilleerd water.

A 1. 0 ml aliquotvan de voorbereideCistancheMonsteroplossing werd geanalyseerd met behulp van dezelfde procedure als de glucosestandaard. De absorptie bij482 nmwerd gemeten en het polysacharide -gehalte vanCistanchevan verschillende gastplanten werd berekend.

1.2.2 RNA -extractie, constructie van cDNA -bibliotheek en sequencing

Totaal RNA werd geëxtraheerdCistanche woesticolamonsters parasitiserenHaloxylon AmmodendronEnAtriplex canescensgebruik van deTiangen DP441 RNA Kit (China), volgend op deTRIZOL -reagensprotocol. RNA -zuiverheid werd beoordeeld met eenNanodrop 2000 Spectrofotometer (Thermo Scientific, VS), terwijl RNA -concentratie en integriteit werden geëvalueerd met behulp van eenAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, VS).

Transcriptoombibliotheken werden geconstrueerd met behulp van deVAHTS Universal V6 RNA-Seq Library Prep Kit. Na kwaliteitscontrole met deAgilent 2100 Bioanalyzer, de bibliotheken werden gesequenced op deIllumina Novaseq 6000 platform, genereren150 bp gepaarde uiteinde leest.

1.3 Gegevensanalyse

1.3.1 Transcriptoomassemblage en functionele annotatie

Raw leest inFastq -formaatwerden verwerkt met behulp vanTrimmomatischom te verwijderenPLY-N leest en leest van lage kwaliteit, resulterend inReinig leest. Adaptersequenties en regio's van lage kwaliteit werden verwijderd en de schone lezingen werden geassembleerd incontigs(uitgedrukt sequentietags) gebruikenTrinity Software. Het langste transcript van elk cluster werd geselecteerd als eenunigevoor verdere analyse.

Functionele annotatie van unigenen werd uitgevoerd door ze te vergelijken met deNCBI Non-Redundant (NR) eiwitdatabase, Zwitserse-prot en de evolutionaire genealogie van genen: niet-supervised orthologe groepen (Eierenhoge) databasegebruikDiamant software (e-waarde <1e -5)). Eukaryotische orthologe groepen (KOG) annotatiewerd uitgevoerd om homologe genen te identificeren. Bovendien werden unigenen in kaart gebrachtKyoto -encyclopedie van genen en genomen (KEGG) routesvoor annotatie van metabole route.Gene Ontology (Go) classificatie en functionele annotatiewerden uitgevoerd met behulp van toewijzingen uit de Swiss-Prot-database.

1.3.2 Genexpressieanalyse en identificatie van differentieel tot expressie gebrachte unigenen (DEGS)

Genexpressieniveaus werden gekwantificeerd met behulp vanBowtie2Clean uitlijnen leest aan Unigenes. Expressiewaarden werden berekend alsFragmenten per kilobase transcript per miljoen toegewezen lezingen (FPKM)gebruikExpress -software. Differentiële expressie -analyse werd uitgevoerd met behulp vanDESEQ2 -software, metNegatieve binomiale distributie (NB) -testsgebruikt voor significantietesten. Differentiaal tot expressie gebrachte genen (DEG's) werden gedefinieerd als die metq-waarde <0. 05Envouwverandering (fc)> 2.

1.3.3 QRT-PCR-validatie van differentieel tot expressie gebrachte genen

Belangrijke enzymgenen die betrokken zijn bijpolysacharide biosynthesemetsignificante differentiële expressiewerden geselecteerd voorkwantitatieve realtime PCR (qRT-PCR) validatie. RNA-monsters waren kwaliteitscontrole en OD-waarden werden gemeten vóór reverse transcriptie. cDNA -synthese werd uitgevoerd met behulp van deTranscript All-In-One first-streng cDNA-synthese Supermix voor QPCR-kit. Het gesynthetiseerde cDNA werd verdund10- vouwen qRT-PCR werd uitgevoerd met behulp van eenfluorescerend qPCR -systeemonder verschillende fietsvoorwaarden.ACTB (beta-actine) werd gebruikt als een intern referentiegenen relatieve genexpressieniveaus werden berekend met behulp van de2⁻ACT -methode.

 

Tabel 1 Primersequenties

Gene ID	Genaam	Vooruit primer (5 '-3')	Reverse primer (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	Gatagtggctacaacatccactt	Cctcctcgtcgtaggattc
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Ugdh	AaAgatcttccagttcgtaaGC	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	GTCTCCTTGTTTATTCGTGAGGAT	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	Saca	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	Cactggcatcgacgaggaaag
-	ACTB	Caatgatgatgatatatcgcccgcgt	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Gegevensanalyse

Hiërarchische clusteringanalyse vanDifferentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's)werd uitgevoerd met behulp vanR (v3.2.0)om genexpressiepatronen te visualiseren over groepen en monsters. GO (Gene Ontology) Verrijkingsanalyse enKEGG (Kyoto Encyclopedia of genen en genomen) Pathway Verrijkingsanalysewerden uitgevoerd met behulp vanR, gebaseerd op dehypergeometrische verdeling. De aanzienlijk verrijkte functionele termen werden weergegeven met behulp vanStaafdiagrammen, bubbelplots en verrijkingscirkel plots.

2 resultaten en analyse

2.1 Polysaccharide -inhoudsbepalingsresultaten

De lineaire regressievergelijking verkregen uit de absorptiemetingen was:

y {{{0}}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154X - 0. (R^2=0. 9963) y =0. 0154X - 0.1636 (r 2=0. 9963)

met een lineair bereik van20–90 ug · ml⁻¹. De precisie, herhaalbaarheid, stabiliteit en monsterherstelsnelheid waren{{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%en 99,67%, respectievelijk.

De gemetenPolysacharide -inhoudinCistanche woesticolaMonsters van verschillende gastplanten waren:

Haloxylon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Transcriptoomsequencing en gegevensassemblage

Transcriptoomsequencing vanZes monstersgegenereerd in totaal41.77 g schone gegevens. De geldige gegevens per monster varieerden van6,89 g tot 7,04 g, metQ30 Basispercentages tussen 95,38% en 95,91%, en eenGemiddeld GC -gehalte van 45,13%.

Een totaal van61,423 Unigeneswerden geassembleerd, met een totale lengte van65.962.858 BPen eenGemiddelde lengte van 1.073,91 BP.

2.3 Gene functionele annotatie

Een totaal van61,423 Unigeneswerden verkregen uit de sequencing vanCistanche woesticolaMonsters die twee verschillende hostplanten parasiteren. De annotatieresultaten zijn als volgt:

30.689 Unigenes (49,96%)werden geannoteerd in deNR (niet-redundante) eiwitdatabase.

18.698 Unigenes (30,44%)werden geannoteerd in deSwiss-Prot-database.

3.998 Unigenes (6,51%)werden geannoteerd in deKEGG -database.

17.188 Unigenes (27,98%)werden geannoteerd in deKOG (eukaryotische orthologe groepen) database.

25,280 Unigenes (41,16%)werden geannoteerd in deEierennog (evolutionaire genealogie van genen: niet-supervisie orthologe groepen) database.

16.210 Unigenes (26,39%)werden geannoteerd in deGO (Gene Ontology) Database.

16.153 Unigenes (26,30%)werden geannoteerd in dePFAM (eiwitfamilies) database.

Onder deze,21.650 Unigeneswaren langer dan1 kb.

Homologie -analyse op basis van deNR -databaseonthulde dat de top drie meest nauw verwante soorten waren:

Paulownia Fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium quinoa (7,1%)

 

 

Tabel 2 annotatie -informatie vanCistanche woesticolaGenfunctie

Database	Annotatie -gennummer	Aandeel (%)
NR	30,689	49.96
Zwitserse prot	18,698	30.44
Vorst	3,998	6.51
Kogel	17,188	27.98
eierpitje	25,280	41.16
GAAN	16,210	26.39

 

 

2.4 GA EN KEGG FUNCTIONELE annotatie en classificatie

DeGO (Gene Ontology) Databasewerd gebruikt om de unigenen te annoteren die zijn geïdentificeerd in deNR -database, wat resulteert in een totaal van16.210 Unigenes. Deze unigenen werden gecategoriseerd inDrie belangrijkste functionele groepen:

Biologisch proces (BP)

Moleculaire functie (MF)

Cellulaire component (CC)

In deBiologisch proces (BP) categorie, de meest voorkomende unigene clusters waren:

"Cellulair proces" (11.023 Unigenes)

"Metabolisch proces" (9.117 Unigenes)

Voor decategorie Cellular Component (CC), 17 subcategorieënwerden geïdentificeerd, waarbij elke subcategorie ten minste bevat30 Unigenes. De grootste clusters waren:

"Cel" (13.947 Unigenes)

"Celgedeelte" (13.918 Unigenes)

In deMoleculaire functie (MF) categorie, de meest verrijkte functionele groepen waren:

"Verbindend" (10.039 Unigenes)

"Katalytische activiteit" (8.490 Unigenes)

Fig.2 Go functionele annotatie en classificatie van unigenen

 

KEGG functionele annotatie en classificatie

Tijdenstranscriptoomsequencing, een totaal van3.998 Unigeneswerden geannoteerd in deKegg (Kyoto Encyclopedia of Genen and Genomes) Database. Deze unigenen werden geclassificeerd inZes primaire categorieën, met hun respectieve unigene tellingen en verhoudingen als volgt:

Cellulaire processen: 326 Unigenes (8.15%)

Omgevingsinformatieverwerking: 299 Unigenes (7.47%)

Genetische informatieverwerking: 1.771 Unigenes (44.30%)

Menselijke ziekten: 14 Unigenes (0.35%)

Metabolisme: 1.465 Unigenes (36.64%)

Organisme -systemen: 123 Unigenes (3.07%)

Deze zes primaire categorieën werden verder verdeeld in20 secundaire classificatieniveaus. Onder hen,Genetische informatieverwerkinghad het hoogste deel, gevolgd doorMetabolisme. Binnen deMetabolismeCategorie, de meest voorkomende paden waren:

Koolhydraatmetabolisme

Vetzuurmetabolisme

Flavonoïde metabolisme

Fig.3 Kegg metabolische route annotatie van unigenen

 

2.5 Differentiële genexpressie en verrijkingsanalyse vanCistanche woesticolavan verschillende hosts

Transcriptoom sequencing -gegevens werden gefilterd met behulp van deStandaard differentiële selectiecriteria voor expressieresulterend in de identificatie van14.089 Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGS):

6.576 genen werden opgereguleerd

7.513 genen werden neergeslagen

A vulkaanplotwerd gegenereerd om de algehele verdeling van DEG's te visualiseren.

In deTop 30 Go verrijking functionele classificatiesvan degs werd waargenomen dat:

Vergeleken metBiologisch proces (BP)EnCellulaire component (CC)Categorieën,Moleculaire functie (MF)vertoonde een grotere degverrijking.

De meest met name verrijkte DEG's werden geassocieerd metNucleïnezuurmetabolisme, eiwitmetabolisme en belangrijke enzymen in galactosemetabolisme.

Bovendien waren DEG's aanzienlijk verrijkt inGO -termen gerelateerd aan polysacharide -metabolisme, inbegrepen:

Zetmeelmetabolisch proces

Glycogeen biosynthetisch proces

Sucrose katabolisch proces

Glucosidase -activiteit

UDP-L-Rhamnose-synthase-activiteit

Polysaccharide hydrolase -activiteit

Fig.4 Vulkanische kaart van differentieel tot expressie gebrachte genen

 

KEGG Pathway Verrijkingsanalyse van DEG's inCistanche woesticolavan verschillende hosts

Om deDifferentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's)inCistanche woesticolavan verschillende gastplanten,KEGG Pathway Verrijkingsanalysewerd uitgevoerd. Uit de analyse bleek dat:

DEG's werden in kaart gebracht op 117 metabole paden.

DeTop 20 padenaangetoondAanzienlijke degverrijking, met de meest verrijkte paden, waaronder:

Vetzuurmetabolisme

-Linoleenzuurmetabolisme

Galactose -metabolisme

Lysine -afbraak

Een verdere verrijkingsanalyse van deTop 20 metabole categorieën met de kleinste Q-waardengaf aan dat DEG's aanzienlijk waren verrijkt in:

Organisme -systemen

Metabolisme

Genetische informatieverwerking

Van deze categorieën,"Metabolisme"Had het hoogste aantal verrijkte DEG's en toonde de belangrijkste verrijking. Bovendien, in de verrijkte metabole paden, deaandeel van opgereguleerde en neerwaartse unigenen was bijna gelijk.

Deze bevindingen suggereren datMetabole paden spelen een cruciale rolin de differentiële genexpressie vanCistanche woesticolavan verschillende gastplanten, vooral inLipide, koolhydraat en aminozuurmetabolisme.