Tubuloside B van Cistanche Salsa redt de PC12-neuroncellen van 1-methyl-4-fenylpyridinium-ion-geïnduceerde apoptose en oxidatieve stress

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstract:

de neuroprotectieveeffecten van tubuloside B uit cistanche, een van de fenylethanoïden geïsoleerd uit de Chinezenkruidengeneeskunde Cistanche salsa, op 1-methyl-4-fenylpyridiniumion (MPP plus)-geïnduceerde apoptose en oxidatieve stress in PC12 neuronale cellen werden onderzocht. PC12-cellen behandeld met MPP A ondergingen apoptotische dood zoals bepaald door MTF-assay, flowcytometrie en DNA-agarosegelelektroforese; intracellulaire accumulatie van reactieve zuurstofspecies (ROS) werd gemeten door DCFH-DA-kleuring met laser scanning confocale microscopie (LSCM). Gelijktijdige behandeling met tuhuloside B verminderde duidelijk de door MPP＋ geïnduceerde cytotoxiciteit, DNA-fragmentatie en intracellulaire accumulatie van ROS. Deze resultaten geven sterk aan dat tubuloside B MPP-geïnduceerde apoptose en oxidatieve stress voorkomt. Tubuloside B kan worden toegepast als eenanti-parkinsonziekteagenten.

Invoering

Pathologisch wordt de sporadische ziekte van Parkinson (PD) typisch gekenmerkt door een verlies van catecholaminerge neuronen, met name dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta (SNc), en de aanwezigheid van karakteristieke intraneurona| insluitsels die Lewy-lichaampjes worden genoemd in aangetaste hersengebieden. Ondanks dat verschillende factoren betrokken zijn geweest bij de pathogenese van PD, blijven de mechanismen die betrokken zijn bij het ontstaan ​​en de progressie van PD onzeker. tot neuronale dood of apoptose door de overmatige vorming van vrije radicalen [1], [2], [3]. Het feit dat het nigrale dopaminerge systeem hoge niveaus van vrije radicalen kan produceren en relatief lage niveaus van antioxidatief afweersysteem heeft, ondersteunt deze hypothese verder. Zowel in vivo als in vitro onderzoeken toonden oxidatieve stress-gemedieerde neurotoxiciteit aan van MPP＋, een actieve metaboliet van l-methyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) op dopaminerge neuronen [4 ], [5]. De betrokkenheid van vrije radicalen die overmatig worden geproduceerd door oxidatieve stress als de directe oorzaak van neurodegeneratieve aandoeningen zoals PD, suggereert een cruciale rol voor antioxidanten. Tubuloside B (Fig. l) was een van de fenylethanoïde verbindingen geïsoleerd uit de stengels vanCistanche salsa. Eerdere studies hadden aangetoond dat veel fenylethanoïden, waaronder tubuloside B, een sterke activiteit voor het opruimen van vrije radicalen vertoonden [6], [7].

Gezien deze bevindingen hebben we in de huidige studie het effect van tubu]nside B op MPP plus-geïnduceerde neurotoxiciteit in vitro onderzocht, met behulp van de sympathische zenuw feochromocytoom cellijn PC12 die in de loop der jaren met succes is gebruikt om de neuronale functie te bestuderen [8], [9].

ziekte van Parkinson:cistanche

Materialen en methodes

Materialen

Tubuloside B vanCistanche salsawerd vriendelijk geleverd door Dr. Li Lei (Department of Natural Products, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing, China). De zuiverheid van de verbinding was meer dan 98 procent volgens HPLC-analyse. Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), paardenserum en foetaal kalfsserum werden gekocht bij GIBCO BRL, 1-methyl~-fenylpyridiniumion (MPP plus), poly-L-lysine, 3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT), propidiumjodide (PI), RNase A, proteïnase K en 2;7'-dichloorfluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) werden gekocht bij Sigma.

Cel cultuur

PCI2-cellen werden gehandhaafd in DMEM aangevuld met 10 procent paardenserum, 5 procent foetaal kalfsserum, 100 U/ml penicilline en 100 ug/ml streptomycine. De cellen werden gekweekt in een bevochtigde incubator die belucht was met 95 procent lucht en 5 procent CO2 bij 37 graden. Alle experimenten werden 24-48 uur uitgevoerd nadat de cellen waren gezaaid. De cellen werden routinematig geoogst door trypsinisatie 0,25 procent wanneer de cellen het subconfluente stadium naderden en uitgeplaat in kweekkolven van 25 cm die bij 1:8 waren gesplitst.

Analyse van de levensvatbaarheid van cellen

De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van een gemodificeerde MTT-assay zoals eerder beschreven [10]. Kort gezegd, PC12-cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met een dichtheid van 1 × 104 ceils per putje. De kweken werden 48 uur gekweekt en vervolgens werd het medium veranderd in dat met verschillende concentraties tubulnside B of MPP＋. Na incubatie gedurende maximaal 48 uur en 72 uur werd MTr-oplossing (5 mg/ml in DMEM) toegevoegd aan de 96-putjesplaten en men liet de cellen 4 uur incuberen bij 37°C. Nadat het medium was verwijderd, werden de cel- en kleurstofkristallen opgelost door 200 μL DMSO toe te voegen en werd de absorptie gemeten bij 570 nm (540 nm als referentie) met een microplaatlezer model 550 (Bio-Rad). De levensvatbaarheid van de cellen werd ook geanalyseerd met behulp van de trypaanblauw-uitsluitingsmethode. De cellen werden verzameld, voorzichtig gepelleteerd en gekleurd met een 0,6 procent oplossing van trypaanblauw gedurende 3 dagen. Het percentage niet-gekleurde cellen werd vervolgens beoordeeld in tien willekeurig geselecteerde microscoopvelden. Als positief medicijn werd 100 ng／ml epidermale groeifactor (EGF) gebruikt.

Detectie van apoptose door flowcytometrie

Apoptotische cellen werden gedetecteerd door flowcytometrie met propidiumjodide (PI) [11]. In het kort werden ongeveer 1 x 106 cellen geïncubeerd met teststoffen geoogst door centrifugeren en eenmaal gewassen met PBS. Cellen werden gefixeerd met 70 procent ethanol gedurende 24 uur bij - 20 graden en eenmaal gewassen met PBS. Cellen werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 300 L PBS met 0,5 mg/ml RNase en 0,5 mg/ml PI. Na verdere incubatie gedurende 30 minuten in het donker werd flowcytometrie uitgevoerd met een FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Duitsland).

We pasten Moore's protocol [12] toe dat alleen gefragmenteerd DNA isoleerde en experimenten werden genormaliseerd door een gelijk aantal kweken uit elke testgroep te gebruiken. In het kort, 3 x 106 neuronen van elk van de behandelde monsters werden gewassen in Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (1000g gedurende 10 min), en de pellets gevormd op de bodem van de buis werden gehomogeniseerd met 1 ml lysisbuffer (10 mM Tris bij pH 7,4,5 mM EDTA, 1 procent Triton X-100) gedurende 20 minuten op ijs. Na centrifugatie bij 11, 000 g gedurende 20 regen bij 4 graden, werden supernatanten die gefragmenteerd DNA bevatten verwijderd en gedigereerd met 20 mg/ml RNase A bij 37 graden gedurende 1 uur, en 0,1 mg/ml proteïnase K bij 56 graden voor nog eens 1 uur. Het gefragmenteerde DNA werd geëxtraheerd met fenol en chloroform en gecentrifugeerd bij 10, 000 g gedurende 1 regen bij 4 C. De waterige fase werd overgebracht naar een nieuwe Eppendorf-buis, gemengd met 2 volumes ijskoude ethanol en vervolgens ten minste 1 uur op -20 graad geplaatst om DNA te laten neerslaan. Na centrifugeren bij 15, 000 g gedurende 20 minuten bij 4 graden, werden supernatanten verwijderd en werden DNA-pellets eenmaal gewassen met 80 procent ethanol (15.000 g gedurende 15 minuten bij 4 graden), aan de lucht gedroogd en opgelost in 20 μL TE buffer bij pH 7,6. Het gehele monster werd vervolgens gedurende 1 uur bij 85 V op een 1,5 procent agarosegel aan elektroforese onderworpen. De gel werd onderzocht en gefotografeerd door een Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, VS).

Meting voor intracellulaire ROS-vorming

Vorming van intracellulaire peroxiden werd gedetecteerd met een confocale scanning lasermicroscoop met behulp van een niet-fluorescerende verbinding, 2"7"-dichloorfluoresceïne diacetaat (DCFH-DA) [13], die in cellen wordt veresterd door endogene esterasen tot het geïoniseerde vrije zuur, 2 ;7"-dichloorfluoresceïne. 2",7-Dichloorfluorescine kan worden geoxideerd tot fluorescerend 2"7"-dichloorfluoresceïne (DCF) door hydroantioxidanten. Cellen werden gedurende 30 minuten bij 37 graden geïncubeerd met 10 μM DCFH-DA. Culturen werden tweemaal gewassen met Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing en afgebeeld in hetzelfde medium. Beeldvorming werd gedaan met behulp van een confocale scanning lasermicroscoop, DCF werd geëxciteerd bij 488 nm en het emissiefilter was een 510 nm barrièrefilter. Om een ​​geldige vergelijking te bieden, werden dezelfde acquisitieparameters gebruikt voor alle waarnemingen. De optimale verticale positie in het midden van de cellen werd ingesteld en vervolgens werd het veld snel gescand. Omdat belichting bij de excitatiegolflengte van 488 nm verhoogde fluorescentie veroorzaakte door oxidatie van deze kleurstof, werd elk veld exact dezelfde tijd aan licht blootgesteld. Baseline-waarden van niet-gestimuleerde cellen werden gebruikt als controlewaarden om te vergelijken met MPP-behandelde cellen in aanwezigheid of afwezigheid van tubuloside B. Na het scannen werd de gemiddelde relatieve fluorescentie-intensiteit in 15-20 neuronale cellichamen per microscoopveld gekwantificeerd in vier aparte culturen per behandelconditie.

cistanche

statistische analyse

Alle verkregen waarden werden uitgedrukt als gemiddelden ±SD. Statistische significantie van verschillen tussen groepen werd bepaald door Student's t-test; Berekende p-waarden van minder dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Zoals getoond in Fig. 2 produceerde MPP plus een dosisafhankelijke afname in de levensvatbaarheid van de PCI2-cellen. Daarentegen produceerde EGF, een bekende neurotrofe factor, een significante bescherming van de levensvatbaarheid van de cellen bij 100 ng/ml MPP＋-geïnduceerde cytotoxische effecten werden ook verzwakt in de aanwezigheid van tubuloside B (5, 10, 50 of 100 µg-ml-1 ), hoewel met minder potentie dan het referentiegeneesmiddel (Fig．3)． Tubuloside B vertoonde bij deze concentraties cytoprotectieve effecten op een dosisafhankelijke manier en de verbinding alleen veroorzaakte geen duidelijke cytotoxiciteit (gegevens niet getoond)． Gelelektroforese van het DNA-extract van PCI 2-cellen behandeld met 200 M MPP plus gedurende 48 uur toonde DNA-laddering． een klassiek kenmerk van apoptose, tubuloside B, in doses van 10 en 100 g·ml-1opgeleide vorming van de DNA-ladder (Fig．4)．Fig．5 toont typische histogrammen van de flowcytometrische analyse van apoptotische celdood geïnduceerd door MPP＋ in PC12-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van tubuloside B - Kwantificering van het celcyclusprofiel met PI onthulde het aantal cellen met subdiploïde kenmerken (M1-regio) die wijzen op apoptotische DNA-fragmentatie. In onbehandelde cellen was de apoptotische subdiploïde fractie minimaal tot 5．94％ van de totale 10000 cellen (Fig．5 A)． Na 48 uur blootstelling aan MPP＋ nam het percentage apoptose toe tot 43．02;j;(Fig．5 B)． Wanneer toegevoegd aan de celcultuur, remde tubuloside B de door MPP geïnduceerde apoptose op een dosisafhankelijke manier. Bij een concentratie van 10 ug·ml-1de bescherming door tubuloside B was niet statistisch significant, maar bij 50 en 1 00ug·ml-1 nam respectievelijk 45％ en 63％ af, werd waargenomen, resulterend in een toename van het percentage overlevingscellen (Fig 5D, E)

Accumulatie van intracellulaire ROS kan worden gedetecteerd door het gebruik van DCFH-DA．PC12-cellen behandeld met 200 uM MPP＋ gedurende 48 uur vertoonden intense fluorescentie in de cel na kleuring met DCFH-DA-kleurstof (Fig.6). Gelijktijdige behandeling met tubuloside B (in doses van 10 en 100 ug·ml) remde MPP＋一-geïnduceerde ROS-productie (gereduceerd percentage was respectievelijk 24．52％ en 55．63％)．

Discussie

De pathogenese van PD omvat sterke oxidatieve stress, verminderde antioxidantniveaus en mitochondriale defecten． allemaal bekend om het induceren van apoptose in verschillende cellulaire systemen． In het bijzonder is aangetoond dat vrije radicalen actieve celdood in neuronen veroorzaken [14]． MPTP produceert een onomkeerbaar en ernstig parkinsonachtig syndroom dat selectieve degeneratie van de nigrostriatale dopaminerge neuronen bij mensen veroorzaakt． Dit neurotoxine is gebruikt om diermodellen te maken van PD [15] - MPTP wordt door monoamineoxidase B omgezet in MPP - dat zich ophoopt in mitochondriën. waar het mitochondriaal complex I en die mitochondriale dagen remt． functie veroorzaakt apoptose [16]. Daarom is MPP plus "geïnduceerde neurotoxiciteit in dopaminerge neuronen uitgebreid gebruikt als een etiologisch model van PD voor het screenen van neuroprotectieve middelen"

In de huidige studie hebben we aangetoond dat door MPP plus geïnduceerde celdood via oxidatieve stress in PC12-cellen werd verminderd door tubuloside B. Verder hebben we aangetoond dat tubuloside B ook op een dosisafhankelijke manier beschermde tegen de MPP plus-geïnduceerde DNA-laddering. en apoptose, zoals gemeten met behulp van DNA-gelelektroforese en flowcytometrische analyse. Bovendien remde gelijktijdige behandeling met hogere concentraties tubuloside B de MPP-geïnduceerde ROS-productie. Zo heeft tubuloside B multifunctionele neuroprotectieve effecten getoond. Verschillende mechanismen, afzonderlijk of in combinatie, kunnen betrokken zijn bij de werking van tubuloside B. Het antioxiderende effect is een mogelijk mechanisme voor door tubuloside B gemedieerde neuroprotectie. Xiong Q ontdekte dat tubuloside B een sterke vrije radicalen wegvangende activiteit vertoonde op de 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl radicaal en xanthine]xanthine oxidase gegenereerd superoxide anion radicaal [6].

Van verschillende fenylethanoïden is onlangs gerapporteerd dat ze vrije radicalen opruimende eigenschappen hebben en oxidatieve stress-geïnduceerde toxische verwondingen beschermen. ROS geproduceerd door MPP plus, zoals waterstofperoxide, superoxide-anion en hydroxylradicaal, beschadigen gemakkelijk biologische moleculen, wat uiteindelijk kan leiden tot apoptotische of necrotische celdood. Dus tubuloside B kan directe wegvangende effecten hebben tegen ROS. Hoewel onze gegevens niet de exacte plaats vaststellen waarop tubuloside B werkt om ROS-accumulatie te onderdrukken, suggereren ze wel dat het neuroprotectieve mechanisme de stimulatie van antioxidantroutes omvat. Een studie van de moleculaire structuur van tubuloside B geeft ook aan dat het een krachtig vermogen bezit om vrije radicalen op te vangen (persoonlijke communicatie).

Andere mechanismen kunnen ook relevant zijn. Tubuloside B kan bijvoorbeeld het vermogen hebben om de toxiciteit van MPP＋ tegen te gaan door de opening van de overgangsporie en disfunctie van de mitochondriale permeabiliteit te remmen. Daarnaast moet ook worden overwogen of tubuloside B een direct groeibevorderend effect op neuronale cellen heeft. Het exacte mechanisme van de neuroprotectieve werking van tubuloside B blijft onduidelijk. Aanvullende studies zijn nodig om het volledige beeld van het neuroprotectieve effect op te helderen.

Concluderend, tubuloside B uit Cistanche salsa-extract heeft duidelijke beschermende effecten op MPP plus-geïnduceerde apoptose en oxidatieve stress. De neuroprotectieve effecten ervan tegen MPP ＋-toxiciteit kunnen belangrijk zijn en suggereren dat het therapeutisch potentieel kan hebben bij de preventie en behandeling van PD.

behandeling van PD: cistanche

Referenties

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Remming van stikstofmonoxide door fenylethanoïden in geactiveerde macrofagen. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Oprichting van een noradrenerge klonale lijn van bijnier feochromocytoomcellen die reageren op zenuwgroeifactor. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Vrije radicalen en lipideperoxidatie bemiddelen niet - door amyloïde geïnduceerde neuronale celdood. Hersenonderzoek 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Kinetische karakterisering van de stikstofmonoxidetoxiciteit voor PC12-cellen: effect van halfwaardetijd van NO-afgifte. EurJ Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Een snelle en eenvoudige methode voor het meten van thymocytenapoptose door propidiumjodidekleuring en flowcytometrie. J Immunol-methoden 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Intracellulaire infectie door Leishmania do nova remt apoptose van macrofagen. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. Basische FGF verzwakt door amyloïde peptide geïnduceerde oxidatieve stress, mitochondriale disfunctie en verslechtering van Na ＋-K ＋-ATPase-activiteit in hippocampale neuronen. Hersenonderzoek 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Mitochondriale stoornis als een vroege gebeurtenis in het proces van apoptose veroorzaakt door glutathiondepletie in neuronale cellen: relevantie voor de ziekte van Parkinson. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Chronisch parkinsonisme bij mensen als gevolg van een product van meperidine-analoge synthese. Wetenschap 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Onderzoek naar de toxiciteit van 1-me-ethyl-4-fenylpyridiniumion (MPP ＋) tegen mitochondriën van de muizenhersenen. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110