UMOD-mutaties bij chronische nierziekten in Taiwan

Abstract:UMODis het eerste geïdentificeerde en meest gemuteerde gen dat autosomaal dominant veroorzaakttubulo-interstitiële nierziekte(ADTKD). Recente onderzoeken hebben aangetoond dat ADTKD-UMODis een relatief veel voorkomende oorzaakchronische nierziekte(CKD). De status van ADTKD-UMODin Taiwan blijft onbekend. In deze studie hebben we drie heterozygoot geïdentificeerdUMODmissense varianten, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) en c.817G > T (p.Val273Phe), in een totaal van 221 geselecteerde CKD-families (1,36%). Twee van deze missense varianten, p.Cys41Arg en p.Gly60Asp, zijn niet eerder gerapporteerd. In vitro hebben onderzoeken aangetoond dat beide uromodulinevarianten defecten vertonen in het celmembraantransport en de uitscheiding naar het kweekmedium. Het structuurmodel voorspelde veranderde vorming van disulfidebindingen in beide varianten, maar er werd voorspeld dat alleen p.Gly60Asp eiwitdestabilisatie zou veroorzaken. Onze bevindingen breiden het mutatiespectrum uit en geven aan dat de ADTKD-UMODbijgedragen aan een kleine maar significante oorzaak van chronische nierziekte bij de Taiwanese bevolking.

Trefwoorden: uromoduline;chronische nierziekte(CNZ); autosomaal dominante tubulo-interstitiëlenierziekte(ADTKD); nierfalen (KF).

KLIK HIER OM CISTANCHE-KRUIDENSUPLEMENTEN VOOR NIERZIEKTEN TE VERKRIJGEN

1. Inleiding

ADTKD is een zeldzame, dominante erfelijke ziekte die wordt veroorzaakt door heterozygote mutaties in UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] en SEC61A1 [5]. UMOD is de eerste geïdentificeerde en meest voorkomende oorzaak van ADTKD, en is onderworpen aan uitgebreid onderzoek [1,6]. Hoewel zeldzaam, is ADTKD de derde meest voorkomende monogene ziektenierziektena ADPKD en collageen type IV-nefropathie, maar de prevalentie van ADTKD-UMOD blijft onduidelijk, en recente onderzoeken tonen aan dat het tot 2% van de patiënten met KF vertegenwoordigt of 0,3% van alle individuen met CKD [7, 8]. UMOD codeert voor uromoduline en is het meest voorkomende eiwit in menselijke urine [9]. Uromoduline is een nierspecifiek eiwit dat wordt geproduceerd door de epitheelcellen van het dikke stijgende deel van de lus van Henle en het eerste deel van de distale ingewikkelde tubulus [10], en wordt via zijn zona gevormd als een polymeer met een hoog molecuulgewicht. pellucida-domein [11]. Bovendien is uromoduline een sterk geglycosyleerd eiwit, met zeven N-glycosyleringsplaatsen en splitsing aan het uiteinde van de C-terminal door serineprotease hepsine, voordat het wordt uitgescheiden in het tubulaire lumen [9,12,13]. De functie van uromoduline omvat bescherming tegen calciumoxalaatkristallisatie [14], verdediging tegen infecties in de urinewegen door uropathogene bacteriën [15–18] en regulering van het Ca2+-K+-ionkanaal [19]. Het effect van UMOD-mutaties is vertraagde rijping, retentie in het endoplasmatisch reticulum (ER), verminderde expressie op het plasmamembraan en verminderde uitscheiding via de urine, wat leidt tot ER-stress en de ongevouwen eiwitrespons [20-22].

Klinische fenotypen van ADTKD-UMOD zijn niet-specifiek en omvatten chronische nierziekte, jicht, hyperurikemie, normale tot milde proteïnurie, aanwezigheid of gebrek aan familiegeschiedenis, en de meest getroffen personen die KF binnenkomen tussen de leeftijden van 30 en 50 jaar [23]. Nierhistologie toont tubulaire dilatatie of atrofie, annulering of verdikking van het tubulaire basale membraan, interstitiële fibrose en accumulatie van gemuteerd uromoduline als polymorfe ongestructureerde materialen onthuld door PAS-kleuring [24,25].

Taiwan heeft de hoogste incidentie en prevalentie van CKD en KF, gebaseerd op internationale vergelijkingen van het USRDS-rapport [26]. Geen enkel onderzoek heeft zich echter gericht op de status van ADTKD-UMOD in de CKD-populatie in Taiwan. In deze studie onderzochten we de prevalentie van ADTKD-UMOD-mutaties in een geselecteerd CKD-cohort in een enkel tertiair centrum in Taiwan.

2. materialen en methoden

2.1. CKD-individuen en DNA-voorbereiding

Voor deze studie werden 221 families met chronische nierziekte (228 individuen) gerekruteerd uit het CKD-zorgprogramma van het Kaohsiung Medical University Hospital. De inclusiecriteria omvatten jichtepisodes of hyperurikemie met een eGFR van minder dan 90 ml/min/1,73 m2 vóór de leeftijd van 40 jaar. Bloedmonsters, stamboominformatie en toegang tot resultaten van laboratoriumwerk werden verkregen van individuen nadat geïnformeerde toestemming was gegeven. Het onderzoek werd uitgevoerd naar aanleiding van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Institutional Review Board van KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024). DNA uit perifere bloedmonsters werd volgens de standaardmethode geëxtraheerd.

2.2. Exome-sequencing en bio-informatica-analyse

Het Nextera Flex for Enrichment and Exome-paneel (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, VS) werd gebruikt voor het maken van exome-bibliotheken. Grootteselectie, sequentievangst, verrijking en elutie werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De grootteverdeling van DNA-bibliotheken werd vervolgens gemeten met behulp van TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, VS), gevolgd door sequencing op een Illumina NovaSeq 6000 met 150 bp paired-end reads. De resulterende fastq-gegevens werden uitgelijnd met de referentiesequentie van het menselijk genoom (GRCh37/hg19) en we voerden het aanroepen van nucleotidevarianten uit met behulp van het DRAGEN Bio-IT-platform (Illumina). Het VCF-bestand werd geanalyseerd in CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, VS). Geïdentificeerde varianten werden gelabeld als pathogeen/waarschijnlijk pathogeen, variant van onzekere significantie (VUS) of goedaardig, volgens de classificatie van het American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), met behulp van de VarSome-software, en we vergeleken varianten die bestonden in de ClinVar , HGMD- en dbSNP-databases. Gedetecteerde pathogene, waarschijnlijk pathogene en VUS-varianten werden bevestigd door Sanger-sequencing. Voor Sanger-sequencing werden de PCR-producten gezuiverd door behandeling met alkalische fosfatase / exonuclease I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, VS) van garnalen en vervolgens onderworpen aan sequencing van beide uiteinden door thermocycler-sequencing met behulp van de BigDye® terminator 3.1-sequencing kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) na analyse op een ABI 3730XL DNA-analysator (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Er werd een segregatieanalyse uitgevoerd als er DNA van familieleden beschikbaar was. Exons 2, 3, 4 en 5 van UMOD werden gescreend door Sanger-sequencing in de proband van 221 CKD-families behalve de DY5-familie, die exome-sequencing ontving. Voor UMOD wordt de NCBI Ref-reeks NM_003361.4 gebruikt. De standaardnomenclatuur aanbevolen door de Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; geraadpleegd op 18 juli 2022.) werd gebruikt om nucleotiden te nummeren en mutaties of varianten te benoemen.

2.3. Celcultuur en voorbijgaande transfectie

HEK293-cellen (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, VS) werden gekweekt in Kaighn's modificatie van Ham's F-12 medium (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, VS) aangevuld met 10% door hitte geïnactiveerd foetaal runderserum (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS), 100 eenheden / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine (10378016, Gibco, Thermo Fisher Scientific ), en 10 eenheden/ml -interferon (IF002, Merck/Millipore Sigma). De cellen werden op 37 ◦C gehouden in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.

Voorbijgaande transfectie van HEK293-cellen werd uitgevoerd met behulp van Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). In het kort werd 2,5 µl Lipofectamine 2000 direct toegevoegd aan 100 µl Optimum medium (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Er werd in totaal 1 µg DNA aan het Lipofectamine 2000-Optimum-mengsel toegevoegd en nog eens 20 minuten geïncubeerd. Het DNA-mengsel werd aan het einde van de incubatie druppelsgewijs toegevoegd aan celkweekplaten met een serumvrij medium. Voor de gezondheidsstatus van de cellen na transiënte transfectie hebben we de LUNA-II™ Automated Cell Counter (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korea) gebruikt om de levensvatbaarheid van trypanblauw-kleurende cellen op een ander tijdstip te detecteren, en de meeste getransfecteerde cellen bleven in leven na verschillende overexpressie van uromoduline (gegevens niet getoond).

2.4. Plaatsgerichte mutagenese

De met HA gemerkte wildtype uromodulinevector werd verkregen van Dr. Rampoldi [27]. De mutatieconstructen van p.Cys41Arg en p.Gly60Asp werden gemaakt met behulp van de QuikChange II Site-Directed Mutagenese Kit (200523, Agilent) volgens de instructies van de fabrikant. De mutaties werden bevestigd door Sanger-sequencing

2.5. ELISA en fractionering

Lege vector, wildtype uromoduline, p.Cys41Arg-uromoduline en p.Gly60Asp-uromoduline-expressieconstructen werden tijdelijk getransfecteerd naar HEK293-cellen. Na transiënte transfectie werd het kweekmedium na 8, 24 en 32 uur verzameld en vervolgens vóór de meting bij -80 ◦C bewaard. Voor immunoblotting werd het kweekmedium gecondenseerd door Centri con (YM3, icon, Merck/Millipore Sigma) vóór SDS-PAGE-elektroforese. ELISA werd gebruikt om metingen van het uromoduline in het kweekmedium uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). In het kort werden het kweekmedium en de standaarden verdund in een assayverdunningsmiddel dat in de kit werd geleverd en in duplo aan de putjes toegevoegd. Na 2,5 uur incubatie bij kamertemperatuur werden de putjes gewassen met PBS en werd het gebiotinyleerde uromoduline-antilichaam toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur werden de putjes opnieuw gewassen en werd een secundair antilichaam streptavidine-mierikswortelperoxidase toegevoegd. Na 45 minuten incubatie bij kamertemperatuur werden de putjes opnieuw gewassen en werd de kleur ontwikkeld door toevoeging van TMB-substraatoplossing en incubatie in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De reactie werd gestopt door het toevoegen van de stopoplossing die in de kit werd geleverd, gevolgd door onmiddellijk aflezen bij OD450 en OD550. De uromodulineconcentratie van het kweekmedium werd bepaald door interpolatie op de standaardcurve.

Nadat het kweekmedium was verzameld, gingen de cellen die aan de kweekschaal waren bevestigd over tot fractionering met behulp van een subcellulaire eiwitfractioneringskit (78840, Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, we verzamelden gelijke hoeveelheden van drie verschillende soorten uromoduline cellysaat en verwijderden al het supernatant totdat het zo droog mogelijk was. We voegden ijskoude cytoplasmatische extractiebuffer met proteaseremmers toe aan de celpellet, 10 minuten geïncubeerd bij 4 ◦C onder voorzichtig mengen en vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd bij 500 x g. We verwijderden onmiddellijk het supernatant (cytoplasmatisch extract) in een schone, voorgekoelde buis op ijs en voegden een ijskoude membraanextractiebuffer met proteaseremmers toe aan de pellet. Het membraangedeelte werd gedurende 5 seconden op de hoogste stand gewerveld en gedurende 10 minuten bij 4 °C geïncubeerd onder voorzichtig mengen. We brachten het supernatant (membraanextract) over naar een schone, voorgekoelde buis op ijs na 5 minuten centrifugeren bij 3000 x g. Het subcellulaire membraan en het cytoplasmatische eiwit werden geanalyseerd door Western-blotting.

2.6. Immunoblotting-analyse

De eiwitmonsters werden uit de cellen verzameld met een RIPA-buffer (R0278, Merck/Millipore Sigma) of de fractioneringsstap. Vervolgens werd de eiwitconcentratie bepaald met behulp van een eiwittestkleurstof (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, VS) en toegang tot een gelijke hoeveelheid eiwit, vervolgens gescheiden door elektroforese op SDS-PAGE. Nadat de eiwitten waren overgebracht op polyvinylideendifluoride (PVDF)-membranen (1620177, BIO-RAD), werd het PVDF-membraan ondergedompeld in 5% magere melk bij 1X TBST, gedurende 1 uur geblokkeerd bij kamertemperatuur, en driemaal gewassen met 1X TBST gedurende 5 minuten. Vervolgens incubeerden we het PVDF-membraan met het primaire antilichaam gedurende de nacht bij 4 °C, wasten het driemaal met 1X TBST gedurende 5 minuten en incubeerden het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met het secundaire antilichaam. Het werd driemaal gewassen met 1X TBST gedurende 5 minuten na incubatie van secundaire antilichamen, daarna voegden we de verbeterde chemiluminescentie (ECL) substraatkit (GERPN2134, Merck / Millipore Sigma) toe en detecteerden het eiwitsignaal met behulp van een röntgenprocessor (MXP). 19}}, KODAK, Rochester, NY, VS) op röntgenfilm (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primaire en secundaire antilichamen werden verdund met 5% magere melk in 1X TBST, en de gedetailleerde informatie is als volgt: 1:2000 voor uromoduline (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, VS) en 1:20.000 voor konijn HRP 2e antilichaam (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, VS).

2.7. Voorspelling van de eiwitstructuur

Dynamiet werd toegepast voor de 3D-structuurvoorspelling van het wildtype en mutante uromoduline (//biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; geraadpleegd op 15 juni 2022.) met behulp van de volledige structuur van het inheemse menselijke uromoduline (Proteïne Gegevensbank: 7PFP) [28]. DiANNA werd gebruikt voor de voorspelling van disulfifidebindingen (//clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; geraadpleegd op 16 juni 2022.) van het wildtype en mutante uromoduline [29-31].

2.8. Statistische analyse

ImageJ-analysesoftware analyseerde en kwantificeerde de Western Blot-banden. De statistische analyses en grafieken werden uitgevoerd en voorbereid met behulp van GraphPad Prism8-software (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, VS), en het gemiddelde ± SEM werd gepresenteerd. Voor een vergelijking tussen twee groepen werd een ongepaarde t-test toegepast. De statistische resultaten werden als volgt gemarkeerd: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p<0,001. Elk experiment werd minstens drie keer herhaald.

Ondersteunende dienst:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop