Cistanche voor de behandeling van ontstekingen en nieraandoeningen: wat is de oorzaak van de pathogene rol van ontsteking bij nierbetrokkenheid bij cystinopathie?
Mar 13, 2022
Contact:joanna.jia@wecistanche.com
Interactie tussen galectine-3 en cystinosine onthult een pathogene rol van ontsteking bij nierbetrokkenheid bij cystinose
Tatiana Lobry1,2 et al
Ontstekingis betrokken bij de pathogenese van veel aandoeningen. De onderliggende mechanismen zijn echter vaak onbekend. Hier testen we of:cystinose, het eiwit dat betrokken is bijcystinose, is een kritische regulator van galectine-3, een lid van de b-galactosidase-bindende eiwitfamilie, tijdensontsteking. cystinoseis een lysosomale stapelingsziekte en, ondanks de alomtegenwoordige expressie van cystinose,nieris het primaire orgaan dat door de ziekte wordt aangetast.cystinosebleek de lysosomale lokalisatie en afbraak van galectine te verbeteren-3. In Ctns–/–muizen, een muismodel vancystinose, galectine-3 wordt tot overexpressie gebracht in denier. De afwezigheid van galectine-3 bij cystinotische muizen verbetert de pathologische nierfunctie en -structuur en vermindert de infiltratie van macrofagen/monocyten in de nier van de Ctns–/–Gal3–/–muizen vergeleken met Ctns–/– muizen. Deze gegevens suggereren sterk dat galectine-3 bemiddeltontstekingbetrokken bijnierziekteprogressie bij cystinose. Verder bleek galectine-3 een interactie aan te gaan met het ontstekingsbevorderende cytokine MonocyteChemoattractant Protein-1, dat de rekrutering van monocyten/macrofagen stimuleert, en het bleek significant verhoogd te zijn in het serum van Ctns–/– muizen en ook patiënten metcystinose. Onze bevindingen benadrukken dus een nieuwe rol voor cystinose en galectine-3-interactie bij ontstekingen en bieden een aanvullende mechanistische verklaring voor denierziekte van cystinose. Dit kan leiden tot de identificatie van nieuwe doelwitten voor medicijnen om uit te stellencystinoseprogressie.
SLEUTELWOORDEN:chronische nierziekte; cystinose; galectine-3;ontsteking; monocyt chemoattractant eiwit-1
cistanche kan chronische nierziekte en cystinose behandelen
De hoofdoorzaak van ontsteking is dat stikstofmonoxide kan leiden tot de productie van ontstekingscellen.Cistancheis een waardevol Chinees kruidengeneesmiddel. De actieve ingrediënten kunnen de afscheiding van stikstofmonoxide remmen en spelen een rol bij het voorkomen en behandelen van ontstekingen en nieraandoeningen.
Translationele verklaring
Ondanks de behandeling ontwikkelen patiënten nog steeds nierfalen in het eindstadium. In deze studie toonden we aan dat de afwezigheid vancystinoseresulteert in verminderde galectine-3 (Gal-3) lysosomale afbraak, wat leidt totontstekingen de voortgang vanchronische nierziekteincystinose. Deze bevindingen openen nieuwe perspectieven op potentiële therapeutische doelen die nierdegeneratie kunnen beperken of vertragen bij patiënten metcystinose. Als zodanig kunnen ontstekingsremmende geneesmiddelen en remmers van Gal-3, zoals niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen of indomethacine, de renale pathogenese bij cystinose verbeteren.
Ontstekingis een normale acute reactie van een organisme op verwonding of infectie,1maar chronischontstekingwordt geassocieerd met weefselbeschadiging. Bij chronische ziekten, zoals diabetes, activeren beschadigde weefsels het immuunsysteem, wat leidt tot een continue ontstekingsreactie en uiteindelijk weefseldegeneratie.2 Cytokinen zijn belangrijke modulatoren vanontstekingen zijn in staat om deontstekingproces.3 Bij patiënten metchronische nierziekte(CKD), verhoogde plasmaconcentratie van cytokines (interleukine [IL]-6 en tumornecrosefactor-a) enontstekingmarkers (C-reactief proteïne, IL-6, hyaluronan en neopterine) worden geassocieerd met progressie tot nierziekte in het eindstadium.4 Inzicht in de specifieke mediatoren die ontstekingsreacties veroorzaken, vergemakkelijkt de ontdekking van geschikte geneesmiddeldoelen om degeneratieve schade te voorkomen .
cystinoseis een autosomaal recessieve stofwisselingsziekte die behoort tot de familie van de lysosomale stapelingsziekte en wordt gekenmerkt door de ophoping van cystine in alle organen.5 Het gen defect incystinose, CTNS, codeert voor de lysosomale cystine/proton-cotransporter, cystinose.6,7 Hoewel CTNS alom tot uiting komt, is denieris het eerste aangetaste orgaan bij personen metcystinose. Patiënten presenteren zich doorgaans in hun eerste levensjaar met het Fanconi-syndroom, dat wordt gekenmerkt door ernstige vocht- en elektrolytenstoornissen, slechte groei en rachitis.8CKD ontwikkelt zich vervolgens, die zich ontwikkelt tot nierziekte in het eindstadium en vereist:niertransplantatie. Ophoping van cystine in alle weefsels leidt uiteindelijk tot multi-orgaandisfunctie; patiënten ervaren fotofobie en blindheid, hypothyreoïdie, hypogonadisme, diabetes, myopathie en verslechtering van het centrale zenuwstelsel.9 Op de C57BL/6-achtergrond is een knock-out muismodel (Ctns–/–) 10 repliceert het nierfenotype van cystinotische patiënten,11 evenals afzetting van cystinekristallen in het hoornvlies12en schildklierdisfunctie.13
In de huidige studie onthullen we een nieuwe rol voorcystinoseinontstekingdoor zijn interactie met Gal-3. Gal-3 is een lid van de familie van lectine en b-galactoside-bindende eiwitten 21 en is betrokken bij meerdere biologische functies, waaronder:ontsteking.22In de context vannierziekten, bleek Gal-3-remming de expressie van pro-inflammatoire markers en nierfibrose te verminderen en de afname van de glomerulaire filtratiesnelheid in hyperaldosteronisme-, hypertensie- of obesitasmodellen te voorkomen.23–26Hier leveren we bewijs dat, incystinose, de afwezigheid vancystinoseleidt tot Gal-3 overexpressie innieren, waardoor de infiltratie van macrofagen en de progressie van CKD worden verbeterd. Daarnaast identificeren we monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) als een potentiële mediator, waardoor nieuwe gendoelen voor medicamenteuze therapie worden onthuld. RESULTATEN Gal-3 interageert met cystinose via zijn koolhydraatherkenningsdomein Om specifieke interactie te identificeren partners die kwantitatieve massaspectrometrie gebruiken, Madin-Darby caninenier(MDCK) -cellen werden getransduceerd met een lentiviraal construct om het cystinose-groene FL-fluorescerende eiwit (GFP) fusie-eiwit stabiel tot expressie te brengen. Naast de 9 subeenheden van vacuolair type Hþ-adenosinetrifosfatase die eerder zijn gepubliceerd,19Gal-3 werd geïdentificeerd als een van de eiwitten die interageren metcystinose(Figuur 1a). Deze interactie werd verder bevestigd door co-immunoprecipitatie gevolgd door Western-blotting (Figuur 1b en c). Daarnaast toonden we aan dat interactie tussen Gal-3 encystinosewerd gemedieerd door het Gal-3-koolhydraatherkenningsdomein (CRD) gelokaliseerd in de C-terminale staart van het eiwit. De interactie werd geremd door thiodigalactoside, een krachtige remmer van galectine-koolhydraatinteracties (Figuur 1d). Zoals alle galectines heeft Gal-3 een affiniteit voor geglycosyleerde eiwitten,21 dus het is waarschijnlijk dat de interactie met Gal-3 plaatsvindt via de cystinose-geglycosyleerde groep die zich in de intralysosomale N-terminale staart van het eiwit bevindt.27
Cystinosine verbetert Gal-3 lysosomale lokalisatie en afbraak
Om de mogelijke lysosomale lokalisatie van Gal te verifiëren-3 bij interactie metcystinose, hebben we aangetoond dat Gal-3, net als cathepsine D (een intralysosomaal protease), werd beschermd tegen vertering door proteïnase K, terwijl beide eiwitten werden verteerd toen lysosomen werden gepermeabiliseerd met Triton X- 100 (Figuur 2a en aanvullend Figuur S1). Vergelijkbare gegevens werden verkregen in lysosomen geïsoleerd uit muizenlever, wat de lysosomale lokalisatie van Gal -3 in vivo bevestigt (Figuur 2b en c). Vanwege de afwezigheid van een betrouwbaar antilichaam om te detecterencystinose, werd immunokleuring uitgevoerd opcystinose-GFP tot expressie brengende MDCK-cellijnen met een anti-Gal-3-antilichaam. Het bevestigde de aanwezigheid van Gal -3 in het lumen van de lysosomen, terwijl cystinose-GFP en Lamp -2 (een lysosomaal transmembraan-eiwit) alleen op het membraan van de blaasjes werden gevonden (Figuur 2d).
Om te onderzoeken ofcystinosinebetrokken was bij het verkeer van Gal-3, hebben we de dynamiek van beide geanalyseerdcystinoseen Gal-3-positieve blaasjes met behulp van tweekleurige live-cel totale interne reflectie FL-fluorescentiemicroscopie in embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen van wildtype (WT) en Ctns–/–muizen die zowel CTNS-DsRed als Gal-3-GFP tot expressie brengen. Onze analyse bevestigde dat:cystinoseen Gal-3 ondergaan echte colokalisatie in Ctns-/- MEF's zoals gevalideerd door de vergelijkbare spatiotemporele verdeling van deze moleculen in de totale interne reflectie FL-fluorescentiemicroscopiezone (Figuur 2e). Gegevens in WT MEF's waren vergelijkbaar (gegevens niet getoond). Bovendien, wanneer MEF's die alleen met Gal- 3-GFP waren getransfecteerd, werden geanalyseerd, werd Gal-3-GFP in het cytoplasma gevonden en werd er geen duidelijke vesiculaire structuur waargenomen, in tegenstelling tot de co-transfectie met CTNS-DsRed ( data niet weergegeven).
Deze gegevens werden bevestigd in 293T-cellen, waarin een sterk GFP-signaal in het cytoplasma werd waargenomen in cellen die alleen Gal-3-GFP tot expressie brachten, terwijl in cellen die zowel Gal-3-GFP alscystinosine-DsRed, Gal -3-GFP was voornamelijk gelokaliseerd in lysosomen die cystinose-DsRed tot expressie brengen (Figuur 3a). Bovendien kwantificering van Gal-3-eiwitexpressie in cellen die zijn getransfecteerd met alleen Gal-3-GFP of Gal- 3-GFP en CTNS-DsRed en Gal-3-GFP en DsRed als controle, vertoonden significant minder Gal -3-GFP-eiwitten in cellen die waren gecotransfecteerd met CTNS-DsRed vergeleken met cellen die waren getransfecteerd met alleen Gal -3-GFP of gecotransfecteerd met DsRed (Figuur 3b). Al met al suggereren deze resultaten datcystinosineverbetert de lysosomale lokalisatie en degradatie van Gal-3. Er werd aangetoond dat cystinosine betrokken is bij CMA.28 Heatshock-eiwit van 70 kDa (Hsc70) neemt deel aan CMA door de ontvouwing en translocatie van substraateiwitten over het membraan naar het lysosomale lumen op een LAMP2A-afhankelijke manier te bevorderen.29,30 Omdat Gal{ {8}} werd voorgesteld te worden afgebroken door CMA,31 we onderzochten de lokalisatie van Gal-3 ten opzichte van Hsc70 in cystinotische MEF's. Confocale microscopie-analyse bevestigde de colokalisatie van Gal-3-GFP op Hsc70- positieve structuren in zowel WT (gegevens niet getoond) als Ctns–/–cellen (Figuur 3c), die het co-transport van Gal-3 met Hsc70 ondersteunen en suggereren dat lysosomale internalisatie maar niet Gal-3-herkenning door de chaperonne defect is incystinose.
Gal-3 is betrokken bij nierontsteking bij Ctns–/–muizen
Om de rol van Gal-3 te bestuderen incystinosein vivo hebben we een dubbel knock-out muismodel gegenereerd dat in beide deficiënt iscystinosineen Gal-3 (Ctns–/–Gal-3–/–muizen). WT, Ctns–/–, en Gal-3–/–muizen werden gebruikt als controlepersonen. In de C57BL/6 Ctns–/–muizen, nierafwijkingen verschijnen rond de leeftijd van 10 maanden.11 Daarom werden onderzoeken uitgevoerd op 8 tot 9 maanden, wanneernierafwijkingen beginnen te worden gedetecteerd, en na 12 tot 15 maanden wanneer nierafwijkingen zijn gevorderd. Omdat het cystinegehalte verschillend bleek te zijn bij mannelijke en vrouwelijke Ctns–/– nieren, werden ze afzonderlijk geanalyseerd. Als het cystinegehalte in beide genotypen toeneemt met de leeftijd, werd er geen significant verschil waargenomen in mannelijke en vrouwelijke nieren tussen de Ctns–/– Gal-3–/– muizen en Ctns–/– muizen van 8 tot 9 maanden en 12 tot 15 maanden oud (Figuur 4a).
De nierfunctie werd beoordeeld in serum en urine en er werd geen significant verschil waargenomen tussen WT en Ctns–/–muizen na 8 tot 9 maanden (gegevens niet getoond), maar na 12 tot 15 maanden, Ctns–/–muizen vertoonden significant hogere serumcreatinine- en ureumspiegels in vergelijking met WT-muizen. Interessant, Ctns–/–Gal-3–/–muizen vertoonden verbeterde nierfunctie vergeleken met Ctns–/–muizen na 12 tot 15 maanden, met een lager serumcreatinine (P <0.05) en ureum (P <0.05; Tabel 1).
Histologische studies van 8- tot 9-maanden oude en 12- tot 15-maanden oude muisniersecties onthulden de aanwezigheid van ernstige anomalieën in Ctns–/– nierenwaaronder tubulaire atrofie, teruggetrokken glomeruli en mononucleaire infiltraten. Blinde analyse van niercoupes varieerde de mate van corticale schade van 1 (geconserveerde weefselstructuur) tot 6. De gemiddelde score voor Ctns–/–muizen was 2.64 - 0.36 op een leeftijd van 9 maanden (n=7) en 4.12 0.37 op een leeftijd van 12 tot 15 maanden (n=16). In de nieren van Ctns–/–Gal-3–/–muizen van dezelfde leeftijd waren deze afwijkingen significant minder uitgebreid: 1.62 - 0.11 na 9 maanden (n=21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" en="" 3.04="" -="" 0.22="" na="" 12="" tot="" 15="" maanden="" (n="33;" p=""><0,05, mann-whitney="" t-test)="" (figuur="" 4b="" en="" aanvullende="" figuur="" s2).="" bovendien="" werd="" aan="" elk="" weefsel="" een="" percentage="" tubulaire="" atrofie="" toegekend="" en="" het="" gemiddelde="" voor="">–/–muizen en Ctns–/–Gal-3–/–muizen waren respectievelijk 66 procent en 42 procent na 12 tot 15 maanden (P ¼ 0.01). Verder is een opvallend verschil tussen Ctns–/–en Ctns–/– Gal-3–/– niersecties was de aanwezigheid van enkele mononucleaire infiltraten in de Ctns–/–Gal-3–/–secties, terwijl zware infiltraten consistent werden waargenomen in de Ctns–/– nier(Figuur 4b).
We karakteriseerden de mononucleaire infiltraten die werden waargenomen door histologisch onderzoek in 8- tot 9-maanden oude Ctns–/– nierenals macrofagen/monocyten door co-immunokleuring met CD68 en CD45 en met CD68 en belangrijke histocompatibiliteitsklasse II (aanvullende figuur S3), maar niet met CD68 en CD163, wat suggereert dat deze macrofagen een M1--achtig pro-inflammatoir profiel hebben.32 ,33 Kwantificering van CD68--positieve cellen onthulde significant minder macrofagen/monocyten in WT, Gal-3–/–, en Ctns–/–Gal-3–/– nierenvergeleken met Ctns–/– nieren(Figuur 4c), ter bevestiging van de histologische gegevens (Figuur 4b).
Al met al suggereren deze bevindingen dat Gal-3 betrokken is bij de rekrutering van macrofagen/monocyten in cystinotischenierenen dat de afwezigheid ervan de nierziekte in Ctns verbetert–/–muizen. Daarom suggereert het datontstekingis, althans gedeeltelijk, verantwoordelijk voor nierverslechtering in Ctns–/– muizen.
Ctns-deficiënte nieren vertonen Gal-3-overexpressie
Met behulp van Western-blot-analyse ontdekten we dat Gal-3-expressie significant was verhoogd innierenvan 12-maanden oude Ctns–/–muizen vergeleken met WT-muizen (Figuur 5a en b). Om te onderzoeken of deze verhoogde expressie van Gal-3 specifiek is voor Ctns–/– nieren, kwantificeerden we Gal-3-expressie op transcript- en eiwitniveaus innierenvan muizen met CKD geïnduceerd door een standaard subtotaal 2-stapnefrectomie-operatie en van de dieren die een schijnoperatie ondergingen. WT en Ctns–/–muizen werden gebruikt als controlepersonen. Gal-3-transcripten waren significant verhoogd in Ctns–/– en schijnnieren, maar sterk verhoogd bij CKDnierenvergeleken met WT-muizen (Figuur 5c). Daarentegen werd Gal-3 op eiwitniveau alleen gedetecteerd in Ctns–/–nieren, wat sterk suggereert dat alleen Ctns–/–nieren waren niet in staat om Gal-3-eiwit af te breken (Figuur 5d). Immunofluorescentiekleuring van Gal-3 in de muisnierna 8 tot 9 maanden toonde ook overexpressie van Gal-3 in de Ctns–/– nierenvergeleken met WTnieren(Figuur 5e). Bovendien werd Gal-3 tot expressie gebracht door CD68þ-macrofagen, evenals door niercellen in Ctns–/– nierenna 8 tot 9 maanden (aanvullende figuur S4). Al met al zijn deze gegevens consistent met verminderde Gal-3-degradatie in afwezigheid vancystinosezoals in vitro aangetoond (Figuur 3a en b), wat leidt tot accumulatie van Gal-3-eiwit in Ctns–/– nieren.
De afwezigheid van cystinosine leidt tot verhoogde serum MCP-1 via Gal-3-upregulatie
Gal-3 reguleertontstekingdoor verschillende mechanismen.34 Om dus meer inzicht te krijgen in het mechanisme incystinose, onderzochten we de expressie van verschillende pro-inflammatoire of anti-inflammatoire cytokines in het serum van 12- tot 15-maanden oude WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, en Ctns–/–Gal- 3–/–muizen. Zes cytokineniveaus werden gemeten door muiscytometrische korrelarray, MCP-1, interferon-g, tumornecrosefactor en IL-10, IL-6 en IL-12p70. Alleen MCP-1-expressie was significant verhoogd in Ctns–/– muizenserum in vergelijking met WT- en Gal-3–/– muizen en ook in Ctns–/–Gal-3–/–muizen, waarvan de MCP -1-serumspiegels vergelijkbaar waren met WT-muizen (Figuur 6a). MCP-1 wordt geproduceerd door verschillende celtypen, waarbij de belangrijkste bron van MCP-1 macrofagen en monocyten zijn,35 en werkt als een chemoattractant voor monocyten en macrofagen die hun migratie en infiltratie reguleren. Daarentegen bleek op dezelfde leeftijd de Gal-3-expressie vergelijkbaar te zijn in het serum van Ctns–/– muizen (44,33 9,81 ng/ml; n=5) en WT-muizen (40.{{12} }.41 ng/ml; n 7).
De relatie tussen Gal-3 en MCP-1 werd verder onderzocht door co-immunoprecipitatie met behulp van Gal-3–GFP en MCP-1–DsRed– of Gal-3– GFP en CTNS-DsRed- (als een positieve controle) die 293T-cellen tot expressie brengen. Interactie tussen Gal-3 en MCP-1 werd waargenomen (Figuur 6b), wat een directe inductie van MCP-1 door Gal-3 suggereert. Incubatie met N-Acetyl-D-lactosamine (LacNAc), een remmer van Gal-3 CRD, toonde aan dat, in tegenstelling totcystinosineinteractie, is de CRD niet betrokken bij de interactie tussen Gal-3 en MCP-1 (Figuur 6c).
Om te beoordelen of deze bevinding relevant is bij mensen, hebben we Gal-3- en MCP-1-spiegels gemeten bij patiënten met:cystinosedie geen immunosuppressieve therapie ondergingen of ontstekingsremmende medicijnen gebruikten. Hoewel het Gal-3-niveau in het serum van patiënten met cystinose enigszins verhoogd bleek te zijn in vergelijking met gezonde donoren, was het verschil niet significant (Figuur 6e), wat onze resultaten bevestigt die zijn verkregen in Ctns–/–muizen. Slechts 2 patiënten hadden een hoge Gal-3-spiegel (25,34 en 39,54 ng/ml); ze werden als uitbijters beschouwd en werden daarom niet opgenomen in figuur 6e. Daarentegen bleek met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest gericht tegen humaan MCP-1 (Figuur 6d), serum MCP-1-spiegels significant verhoogd te zijn bij patiënten metcystinose(252.1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; leeftijdsbereik 1-23 jaar) ondanks behandeling met cysteamine vergeleken met gezonde controlepersonen (166.9 -13.5 pg/ml; n 1 0; leeftijdscategorie 8-63 jaar) (P < 0,001).="" er="" is="" geen="" correlatie="" gevonden="" tussen="" leeftijd="" en="" mcp-="" 1="" niveau="" bij="" beide="" patiënten="">cystinoseen gezonde donoren (gegevens niet getoond).
Cistancheheeftontstekingsremmendeigendommen
DISCUSSIE
Ondanks het feit dat cystine zich ophoopt in alle weefsels bij patiënten metcystinose, zijn nieren de organen die het meest kwetsbaar zijn voor schade. We zijn dus van mening dat de accumulatie van cystine niet alleen verantwoordelijk is voor nierdegeneratie. Hierin beschrijven we een nieuwe rol voor:cystinosinein de regulering vanontstekingbetrokken bij de progressie van chronische nierziekte incystinose. Deze studie kan verklaren waarom patiënten evolueren naar nierfalen in het eindstadium ondanks het ondergaan van cysteaminetherapie.
De studie van moleculaire partners van cystinose onthulde een directe interactie met Gal-3, die kan worden geremd door remmers van Gal-3 CRD. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat Gal-3 een interactie kan aangaan met glycanen die zich in het lysosomale lumen bevinden na lysosomale schade zoals kristalopbouw.36 In ons onderzoek werd de interactie tussen Gal-3 encystinosinewerd bestudeerd in gezonde cellen die tot expressie brengencystinosineen daarom geen cysteïne- of cystinekristallen ophopen. Bovendien veranderde overexpressie van zowel Gal-3 als cystinosine in gezonde cellen de subcellulaire lokalisatie van Gal-3, die vervolgens werd gelokaliseerd in de lysosomen, vergeleken met overexpressie van alleen Gal-3, wat bevond zich in het cytoplasma. Deze resultaten suggereren sterk dat interactie tussen Gal-3 en cystinosine onafhankelijk van lysosomale schade optreedt en dat cystinosine actief verantwoordelijk is voor Gal-3 lysosomale lokalisatie. Eerder is aangetoond dat Gal-3 wordt afgebroken door lysosomaal-afhankelijke proteolyse in afwezigheid van Abl en Arg, 2 tyrosinekinasen.31
Daarnaast hebben we laten zien datcystinoseen Gal-3 co-lokaliseren op dynamische vesiculaire structuren en worden samen gemobiliseerd op een tijdruimtelijke manier.Cystinosineis eerder in verband gebracht met de mensenhandelmechanismen van de lysosomale LAMP2A, de enige bekende CMA-receptor, die verkeerd is gelokaliseerd incystinose.28Eerder is aangetoond dat Gal-3-degradatie wordt gemedieerd door CMA.31Confocale microscopie-analyse bevestigde de colokalisatie van Gal-3 op Hsc70-positieve structuren in beide Ctn's–/– en WT-cellen, die het co-transport van Gal-3 met Hsc70 ondersteunen voor presentatie op het lysosoom en afbraak door CMA, aangezien Hsc70 de translocatie van substraateiwitten door het membraan naar het lysosomale lumen bevordert.29,30Een mogelijke interpretatie van onze resultaten is dat:cystinosineregelt de handel in en levering van Gal-3 aan de CMA-actieve lysosomen voor afbraak.
Dit nieuwe pad vancystinosine-afhankelijke Gal-3-lysosomale lokalisatie en afbraak wordt in vivo ondersteund, aangezien Ctns-deficiënte muizen overexpressie van Gal-3 vertonen binnen denier. Bovendien, terwijl verhoogd Gal-3-mRNA beperkt was in Ctns–/–nieren vergeleken met een ander model van CKD, werd een grote hoeveelheid Gal-3-eiwit alleen gedetecteerd in Ctns–/– nieren. Deze gegevens ondersteunen sterk de conclusie dat:cystinosineis betrokken bij de afbraak van Gal-3-eiwit, dat de overexpressie van Gal-3-mRNA kan beheersen bij stressomstandigheden zoals CKD.
Gal-3 heeft verschillende biologische rollen, waaronder rollen bij acute en chronischeontstekingdoor monocyten en macrofagen aan te trekken.37,38In Ctns–/– muizen, hebben we zware mononucleaire infiltraten waargenomen, voornamelijk in denierzoals eerder beschreven,11,39die werden gekarakteriseerd als monocyten/macrofagen. Daarentegen nieren van de dubbele knock-out Ctns–/–Gal-3–/–muizen vertoonden zeer weinig monocyten/macrofaag-infiltraten, wat sterk suggereert dat Gal-3 betrokken is bijontstekingin de nieren van Ctns–/–muizen. In de context van herhaaldelijk weefselletsel kan Gal-3 de overgang naar chronisch veroorzakenontstekingen fibrose.34In overeenstemming met deze bevindingen tonen onze gegevens de betrokkenheid van Gal-3 bij de progressie van CKD incystinose. Inderdaad, de dubbele knock-out Ctns–/– Gal-3–/–muizen vertoonden beternierfunctie en structuur vergeleken met Ctns–/–muizen. Evenzo vertonen Gal-3-deficiënte muizen minder nierfibrose in deniervergeleken met WT-muizen na eenzijdige ureterobstructie,40 en Gal-3-knock-outmuizen die werden blootgesteld aan ischemie-reperfusieschade hadden een betere nierfunctie vergeleken met WT-muizen die werden blootgesteld aan ischemie-reperfusieschade.41
Hoewel er een correlatie werd gevonden tussen de niveaus van Gal-3 in plasma en de ontwikkeling van CKD,42 werd er geen verschil in Gal-3-expressie waargenomen in het serum van muizen en mensen die waren aangetast doorcystinoseen gezonde controlepersonen. Door verschillende cytokineniveaus in het serum te meten, vonden we een significante toename van MCP-1 in Ctns–/–muizen, terwijl Ctns–/–Gal-3–/–muizen hadden niveaus vergelijkbaar met die van WT-muizen. MCP-1 is een cytokine dat in het serum kan worden afgegeven en een gradiënt vormt om monocyten en macrofagen naar de plaats van verwonding te trekken.35 De toename van MCP-1 in de sera van Ctns–/–muizen vergeleken met Ctns–/–Gal-3–/–muizen waren onafhankelijk van cystine-accumulatie omdat:nierhet cystinegehalte was vergelijkbaar in beide genotypen. Bovendien, ondanks behandeling met cysteamine waardoor cystine uit de lysosomen kon ontsnappen, bleek MCP-1 significant verhoogd te zijn in de sera van patiënten metcystinosevergeleken met gezonde donoren. Deze gegevens suggereren sterk dat de afwezigheid vancystinosine, in plaats van cystine-accumulatie, is verantwoordelijk voor de MCP-1-verhoging in serum. Bovendien toonden we een directe interactie tussen Gal-3 en MCP-1, die onlangs werd gesuggereerd door Gordon-Alonso et al.43 maar niet verder werd onderzocht. Het mechanisme van Gal-3-gemedieerde MCP-1-activering is hier niet bestudeerd. Een hypothese is de aanwezigheid van een signaalpeptide in het menselijke MCP-1, dat kan worden gesplitst om de secretie ervan te verbeteren.44 Bovendien kan plasmine de C-terminus van MCP-1 splitsen, waardoor de chemoattractant ervan toeneemt. potentie.45 Bovendien, in overeenstemming met onze gegevens, verhinderde remming van MCP-1 in een muismodel van diabetische nefropathie infiltratie van macrofagen in de nieren en verbeterde nierfunctie.46,47 Incystinose, suggereren onze gegevens sterk dat de afwezigheid vancystinosineleidt tot een toename van Gal-3, dat de MCP-1-bloedmobilisatie activeert, waardoor de nierontstekingen de voortgang vanchronische nierziekte.
Deze bevindingen openen nieuwe perspectieven op potentiële therapeutische doelen die nierdegeneratie kunnen beperken of vertragen bij patiënten metcystinose. Het is inderdaad gevonden dat niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen zoals aspirine en indomethacine de expressie van Gal-3 remmen door de transcriptie ervan te remmen.48 Indomethacine wordt feitelijk gebruikt om polyurie en polydipsie te reguleren bijcystinose,49 en een recente studie van 307 Europese patiënten met cystinose toonde een verbeterde nieruitkomst aan bij patiënten die werden behandeld met indomethacine.50 In het licht van onze studie, het gebruik van indomethacine of niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelencystinosepatiënten kunnen worden heroverwogen.
METHODEN
Dierproeven
De C57BL/6 Ctns–/–muizen werden geleverd door Dr. Antignac (Inserm U1163, Parijs, Frankrijk). C57BL/6 galectine-3 null (Gal-3–/–) muizen werden geleverd door Dr. Fu-Tong Liu (Universiteit van Californië, Davis) en Dr. Jerrold M. Olefsky (Universiteit van Californië, San Diego). De fokstrategie om WT, Ctns . te genereren–/–, Gal-3–/–, Ctns–/– en Gal- 3–/–muizen wordt beschreven in aanvullende methoden.
Cel lijnen
de puinhoop werd gegenereerd uit pasgeboren huidbiopten van WT en Ctns–/–muizen. MEF-, 293T- en MDCK-type II-cellijnen (ATCC, Manassas, VA) werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium dat 10 procent foetaal kalfsserum of foetaal runderserum, 100 eenheden/ml penicilline, 0,1 mg/ml streptomycine bevatte. en 2 mM L-glutamine.
Co-immunoprecipitatie en massaspectrometrie-analyse
Om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen, werden MDCK-cellen getransduceerd met behulp van de lentivirale pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE-vectorruggengraat om stabiel tot expressie te brengencystinosine-GFP.51Co-immunoprecipitatie werd uitgevoerd zoals beschreven in aanvullende methoden. Co-immunoprecipiteerde eiwitten werden gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en geanalyseerd met massaspectrometrie, LTQ Orbitrap zoals reeds beschreven.19
293T-cellen die Gal -3-GFP en MCP-1-DsRed of Gal-3-GFP en CTNS-DsRed tot expressie brengen, werden gebruikt voor co-immunoprecipitatie zoals beschreven in aanvullende methoden. Co-immunoprecipiteerde eiwitten werden opgelost door SDS-PAGE en Gal-3-bindende MCP-1 werd gedetecteerd met behulp van een anti-DsRed-antilichaam (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Subcellulaire fractionering
Acht levers werden verkregen van C57BL/6-muizen en bereid zoals eerder beschreven.52 De omstandigheden van de gradiënt waren in wezen hetzelfde als beschreven in de oorspronkelijke publicatie,52 behalve dat Nycodenz werd gebruikt in plaats van metrizamide.
Gal-3–remmer en proteïnase K-behandelingen
Lysaten vancystinosine-GFP MDCK-cellen en 293T die Gal-3–GFP en CTNS-DsRed of Gal-3–GFP en MCP-1–DsRed tot expressie brengen, werden geïncubeerd met of zonder 5 mM thiodigalactoside of 5 mM N -Acetyl-D-Lactosamine, respectievelijk 2 remmers van Gal-3 CRD. Na 30 minuten incubatie bij 4 - C onder constant schudden, werden lysaten geïncubeerd met 50 ml anti-GFP-microkralen en werd immunoprecipitatie uitgevoerd zoals eerder vermeld. Neergeslagen eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE op 10% gel.
Lysaten vancystinosine-GFP MDCK-cellen en met lysosoom verrijkte muizenleverfracties werden 10 minuten bij 4 - C geïncubeerd met of zonder 2 procent Triton X-100 en vervolgens 30 minuten geïncubeerd met of zonder 2,5 mg/ml en 25 mg /ml proteïnase K, respectievelijk. Na enzyminactivering met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride gedurende 5 minuten bij 4 - C, werden eiwitten gescheiden door SDS-PAGE op 10% gel.
Immunofluorescentie-analyse
Vaste MDCK-cellen werden 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) en anti-Gal-3-antilichaam (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canada), gevolgd door Alexa Fluor 555 secundair antilichaam (Invitrogen, Carlsbad, CA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Confocale beelden werden genomen met behulp van een Zeiss LSM 700-microscoop (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Duitsland).
293T-cellen die tijdelijk Gal-3–GFP alleen, Gal-3–GFP en DsRed of Gal-3–GFP encystinosine-DsRed werden gekweekt op een dekglaasje voordat ze op een glaasje werden gemonteerd. Cellen werden afgebeeld met behulp van een Keyence BZ-X700-instrument (Keyence Corp., Osaka, Japan).
Gemaaktniercoupes werden overnacht bij 4 - C geïncubeerd met anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) of anti-Gal-3 antilichaam (BioLegend), gevolgd door Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (Invitrogen), 1 uur op kamertemperatuur. Beelden werden verkregen met behulp van een Keyence BZ-X700-instrument. Kwantificering van CD68-expressie wordt beschreven in aanvullende methoden.
MEF's die Gal-3-GFP tot expressie brengen, werden gekleurd met behulp van een anti-Hsc70-antilichaam (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) en afgebeeld zoals eerder beschreven.53
Totale interne reflectie FL fluorescentiemicroscopie
WT en Ctns–/–MEF die Gal-3-GFP tot expressie brengt, en CTNS-DsRed werden gezaaid op een 4-kamer 35- mm borosilicaatbodemschaal (Cellvis, Mountain View, CA). Na 2 dagen in kweek werden MEF's geanalyseerd met totale interne reflectie FL-fluorescentiemicroscopie zoals eerder beschreven54en in aanvullende methoden. Afbeeldingen werden geanalyseerd met behulp van ImageJ-software.
Gal-3 expressie-analyse
293T-cellen die Gal-3–GFP, Gal-3–GFP en DsRed tot expressie brengen, of Gal-3–GFP en CTNS-DsRed en geëxplanteerdnierenwerden gelyseerd in radio-immunoprecipitatie-assaybuffer die een cocktail van proteïnaseremmer bevat. Eiwitten werden gescheiden op een 4 procent tot 15 procent gel en onthuld met behulp van anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, VK) of anti-glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) antilichaam .
nierenwerden gehomogeniseerd in RLT-buffer die b-mercapto-ethanol bevat met behulp van Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Frankrijk). RNA werd geïsoleerd en Gal -3-specifieke druppel digitale polymerasekettingreactie werd uitgevoerd zoals beschreven in aanvullende methoden. Gal-3-transcriptexpressie werd uitgedrukt als een verhouding vergeleken met de endogene controle 18S. Een enzymgekoppelde immunosorbenttest (Abcam) werd gebruikt om het Gal-3-niveau in muizen en menselijke sera te detecteren, volgens de instructies van de fabrikant.
Nierfunctie
Serum- en urinefosfaat-, serumcreatinine- en ureumspiegels werden geschat met behulp van de QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit en QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Eiwitniveaus in urine werden gemeten met behulp van de Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).
histologie
Toen de muizen werden gedood,nierenwerden verzameld, gefixeerd in formaline en ingebed in paraffine. Secties gekleurd met hematoxyline en eosine werden op een geblindeerde manier beoordeeld door Dr. Marie Claire Gubler zoals beschreven in de aanvullende methoden.
Cystine inhoudsmeting
Weefselcystinemeting werd uitgevoerd door massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS) zoals eerder beschreven.39
Standaard nefrectomie en schijnoperatie
CKD bij muizen werd veroorzaakt door de standaard subtotaal 2-stadium nefrectomie-operatie zoals eerder beschreven.55,56De schijngroep muizen onderging dezelfde procedure, maar zonder iets te snijdennierzakdoek.
Cytokineniveau in serum
Om cytokineniveaus in muizenserum te meten, een muisontstekingkit cytometrische parelarray (BD Biosciences, San Jose, CA) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De MCP-1-concentratie in humaan serum werd bepaald met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenstest gericht tegen MCP-1 (Abcam, Cambridge, VK) volgens de instructies van de fabrikant.
statistische analyse
Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde - SEM. De significantie van het resultaat werd beoordeeld met een ongepaarde 2-tailed t-test of ongepaarde 2-tailed t-test met Welch's correctie. Groepsvergelijkingen van 3 condities of meer werden gemaakt met parametrische variantieanalyses, gevolgd door Tukey meervoudige vergelijkingentest voor paarsgewijze vergelijkingen. Histologische scores werden vergeleken met behulp van de Mann-Whitney-test. Analyses werden uitgevoerd met behulp van Prism 6-software (GraphPad, San Diego, CA). Een P-waarde kleiner dan 0,05 werd als significant beschouwd.
Studie goedkeuring
Muizenexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van het Institutional Animal Use Committee. Het gebruik van menselijk weefsel in deze studie werd goedgekeurd door de University of California, San Diego, HumanResearch Protections Program.
OPENBARING
SC is een wetenschappelijk bestuurslid en lid van de Board of Trustees van decystinoseStichting Onderzoek. SC is mede-oprichter, aandeelhouder en lid van zowel de wetenschappelijke raad als de raad van bestuur van GenStem TherapeuticsInc. De voorwaarden van deze regeling zijn beoordeeld en goedgekeurd door de University of California-San Diego in overeenstemming met haar beleid inzake belangenconflicten. Alle andere auteurs verklaarden geen concurrerende belangen.
het verstrekken van de Gal-3–/–muizen. Wij danken Lou Devanneaux en NicholeFlerchinger voor hun technische hulp en Elizabeth Souter voor het beoordelen van het manuscript. We erkennen Christopher Alfonso van BDBioscience voor het leveren van de muisontstekingcytometrische parelarray en voor zijn hulp bij de interpretatie van de resultaten. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health RO1-DK090058and R01-DK110162, decystinoseResearch Foundation en het California Institute of Regenerative Medicine (CIRM, CLIN-09230). TL wordt ondersteund door een fellowship van de Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB en JZ worden ondersteund door een fellowship van decystinoseStichting Onderzoek. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility werd gefinancierd door de National Institute of neurological disorder and Stroke (NINDS) grant P30-NS047101.
REFERENTIES
1. Medzhitov R. Oorsprong en fysiologische rollen vanontsteking. Natuur. 2008;454:428-435.
2. Doneer MIJN. Gericht opontstekingbij de behandeling van diabetes type 2. Diabetes Obesitas Metab. 2013;15 (suppl 3): 193-196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Cytokines in het systemische inflammatoire responssyndroom: een overzicht. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth. 2010;2:161-175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Associaties tussen circulerende ontstekingsmarkers en resterende nierfunctie bij CRF-patiënten. ben JNierDis. 2003;41:1212-1218.
5.Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.cystinose. N Engl J Med. 2002;347: 111-121.
6. Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Het richten vancystinosinenaar het lysosomale membraan vereist een op tyrosine gebaseerd signaal en een nieuw sorteermotief. J Biol Chem. 2001;276:13314-13321.
7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystinosine, het eiwit defect incystinose, is een H()-aangedreven lysosomale cystinetransporter. EMBO J. 2001;20:5940-5949.
8. Cherqui S, Courtoy PJ. Het renale Fanconi-syndroom incystinose: pathogene inzichten en therapeutische perspectieven. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 115-131.
9. Nesterova G, Gahl W. Nefropathischcystinose: late complicaties van een multisysteemziekte. Pediatr Nephrol. 2008;23:863–878.
10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Intralysosomale cystine-accumulatie bij muizen ontbreektcystinosine, het eiwit defect incystinose. Mol Cell Biol. 2002;22:7622-7632.
11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Nierfenotype van decystinosemuismodel is afhankelijk van genetische achtergrond. Nephrol-wijzerplaattransplantatie. 2010;25:1059-1066.
12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. De oogafwijkingen in acystinosediermodel bootst pathogenese van ziekten na. Pediatrisch onderzoek 2007;62:156-162.
13. Gids Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Een muismodel suggereert twee mechanismen voor schildklierveranderingen bij infantielecystinose: verminderde thyroglobulinesynthese als gevolg van endoplasmatisch reticulumstress/ontvouwen eiwitrespons en verminderde lysosomale verwerking. Endocrinologie. 2015;156:2349-2362.
14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Cysteaminetherapie vertraagt de progressie van nefropathischcystinosebij late adolescenten en volwassenen.NierInt. 2012;81:179–189.
15. Cherqui S. Cysteamine-therapie: een behandeling voorcystinose, geen remedie.NierInt. 2012;81:127-129.
16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nefropathischcystinosebij volwassenen: natuurlijk beloop en effecten van orale behandeling met cysteamine. Ann Stagiair Med. 2007;147:242-250.
17. Cherqui S, Courtoy PJ. Het renale Fanconi-syndroom incystinose: pathogene inzichten en therapeutische perspectieven. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 115-131.
18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Verslechtering van door chaperonne gemedieerde autofagie leidt tot selectieve lysosomale afbraakdefecten bij de lysosomale stapelingsziektecystinose. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystinosineis een component van het vacuolaire H-ATPase-regulator-rag-complex dat zoogdierdoelwit van rapamycinecomplex 1-signalering controleert. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678-1688.
20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Activering van de transcriptiefactor EB redt lysosomale afwijkingen bij cystinotischeniercellen.NierInt. 2016;89:862–873.
21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: een verhaal met een open einde. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616-635.
22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galectine-3: één molecuul voor een alfabet van ziekten, van A tot Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).
23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. De impact van galectine-3-remming op aldosteron-geïnduceerde hart- en nierbeschadigingen. JACC Hartfalen. 2015; 3:59-67.
24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Farmacologische remming van galectine-3 beschermt tegen hypertensieve nefropathie. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F500-F509.
25. Kolatsi-Joannou M, Prijs KL, Winyard PJ, Long DA. Gemodificeerde citruspectine vermindert de expressie van galectine-3 en de ernst van de ziekte bij experimentele acutenierblessure. PloS Een. 2011;6:e18683.
26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Galectine-3-blokkade vermindert nierfibrose in twee normotensieve experimentele modellen van nierschade. PloS Een. 2016;11:e0166272.
27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Impact vancystinoseglycosylering op eiwitstabiliteit door differentiële dynamische stabiele isotooplabeling door aminozuren in celcultuur (SILAC). Mol Cell Proteomics. 2017;16:457-468.
28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Verslechtering van door chaperonne gemedieerde autofagie leidt tot selectieve lysosomale afbraakdefecten bij de lysosomale stapelingsziektecystinose. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
29. Majeski AE, Dice JF. Mechanismen van chaperonne-gemedieerde autofagie. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435-2444.
30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. chaperonne-gemedieerde autofagie voorkomt apoptose door BBC3 / PUMA te degraderen. autofagie. 2015;11:1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. c-Abl- en Arg-tyrosinekinasen reguleren de lysosomale afbraak van het oncoproteïne Galectine-3. Celdood verschilt. 2010;17:1277–1287.
32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Overheersing van M2-gepolariseerde macrofagen bij blaaskanker beïnvloedt angiogenese, tumorgraad en invasiviteit. Oncol Lett. 2016;11:3403-3408.
33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Veel meer dan M1- en M2-macrofagen, zijn er ook CD169() en TCR()-macrofagen. Front Immunol. 2015;6:263.
34. Henderson NC, Sethi T. De regulering vanontstekingdoor galectine-3. Immunologische Rev. 2009;230:160–171.
35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocyt chemoattractant eiwit-1 (MCP-1): een overzicht. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313-326.
36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Getriggerde rekrutering van ESCRT-machines bevordert endolysosomaal herstel. Wetenschap. 2018;360(6384).
37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulering van alternatieve macrofaagactivering door galectine-3. J Immunol. 2008;180: 2650-2658.
38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Humaan galectine-3 is een nieuwe chemoattractant voor monocyten en macrofagen. J Immunol. 2000;165:2156-2164.
