Whole Genome Sequencing voor de diagnose van neurologische herhalingsexpansiestoornissen in het VK: een retrospectieve diagnostische nauwkeurigheid en prospectieve klinische validatiestudie

Voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

Overzicht

Achtergrond

Herhaalde expansiestoornissen treffen ongeveer 1 op de 3000 personen en zijn klinisch heterogene ziekten die worden veroorzaakt door uitbreidingen van korte tandem-DNA-herhalingen. Genetische tests zijn vaak locusspecifiek, wat resulteert in onderdiagnose van mensen met atypische klinische presentaties, vooral bij pediatrische patiënten zonder een eerdere positieve familiegeschiedenis. Whole-genome sequencing wordt steeds vaker gebruikt als eerstelijnstest voor andere zeldzame genetische aandoeningen, en we wilden de prestaties ervan beoordelen bij de diagnose van patiënten metneurologischherhaalde expansiestoornissen.

Methoden:

We hebben retrospectief de diagnostische nauwkeurigheid van sequencing van het hele genoom beoordeeld om de meest voorkomende herhalingsexpansieloci geassocieerd metneurologischuitkomsten (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT en TBP) met behulp van monsters die binnen de National Health Service in Engeland zijn verkregen van patiënten van wieneurologischaandoeningen; eerdere PCR-testresultaten werden gebruikt als referentiestandaard. De klinische nauwkeurigheid van sequencing van het hele genoom om herhaalde uitbreidingen te detecteren, werd prospectief onderzocht bij eerder genetisch geteste en niet-gediagnosticeerde patiënten die in 2013–17 werden gerekruteerd voor het 100 000 Genomes Project in het VK, en waarvan werd vermoed dat ze een genetischeneurologischaandoening (familiale of vroege vormen van ataxie, neuropathie, spastische paraplegie, dementie, motorneuronziekte,parkinsonbewegingstoornissen, verstandelijke beperking of neuromusculaire aandoeningen). Als een herhaalde uitbreidingsaanroep werd gedaan met behulp van sequencing van het hele genoom, werd PCR gebruikt om het resultaat te bevestigen.

bevindingen

De diagnostische nauwkeurigheid van sequencing van het hele genoom om herhaalde uitbreidingen te detecteren, werd geëvalueerd tegen 793 PCR-tests die eerder werden uitgevoerd binnen de NHS bij 404 patiënten. Sequentie van het hele genoom classificeerde 215 van de 221 uitgebreide allelen en 1316 van de 1321 niet-geëxpandeerde allelen correct, met een gevoeligheid van 97,3 procent (95 procent BI 94,2-99,0) en een specificiteit van 99,6 procent (99,1-99). ·9) over de 13 met de ziekte geassocieerde loci in vergelijking met de resultaten van de PCR-test. In monsters van 11 631 patiënten in het 100 000 Genomes Project, identificeerde sequencing van het hele genoom 81 herhaalde uitbreidingen, die ook werden getest door PCR: 68 werden bevestigd als herhaalde uitbreidingen in het volledige pathogene bereik, 11 waren niet -pathogene tussenliggende expansies of permutaties, en twee waren niet-geëxpandeerde herhalingen (16 procent valse ontdekkingsgraad).

Interpretatie

In onze studie toonde sequencing van het hele genoom voor de detectie van herhaalde uitbreidingen een hoge gevoeligheid en specificiteit, en het leidde tot de identificatie vanneurologischherhaalde expansiestoornissen bij niet eerder gediagnosticeerde patiënten. Deze bevindingen ondersteunen de implementatie van sequencing van het hele genoom in klinische laboratoria voor de diagnose van patiënten met eenneurologischpresentatie consistent met een herhalingsexpansiestoornis.

Financiering

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research en Illumina.

Invoering

Ondanks recente vorderingen in ons begrip van de genetische basis van zeldzameneurologischaandoeningen, blijft tot 70 procent van de patiënten met dergelijke aandoeningen genetisch niet gediagnosticeerd.1–3 Dit is gedeeltelijk te wijten aan de technische uitdagingen van het testen op complexe en repetitieve genetische varianten, waaronder herhaalde uitbreidingen; dergelijke uitbreidingen treffen naar schatting ongeveer 1 op de 3000 mensen (bijlage p 1) en zijn de belangrijkste oorzaak van meer dan 40 neurogenetische aandoeningen4, waaronder de ziekte van Huntington en het fragiele X-syndroom. Herhalingsexpansiestoornissen zijn klinisch en genetisch heterogeen en herhalingsexpansie kan in verband worden gebracht met verschillende ziekten. Uitbreidingen in C9orf72 kunnen zich bijvoorbeeld voordoen als amyotrofische laterale sclerose of frontotemporale dementie.5 Herhaalde uitbreidingen op verschillende loci kunnen ook vergelijkbare fenotypische kenmerken opleveren, waardoor ze klinisch moeilijk te onderscheiden zijn: herhaalde uitbreidingen in ten minste tien spinocerebellaire ataxie-genen die vaak aanwezig zijn als volwassen -begin ataxie,6 en die in C9orf72 en AR kunnen beide motorneuronziekte veroorzaken.7,8

Herhalingsexpansiestoornissen worden veroorzaakt door een toename van het aantal repetitieve korte tandem-DNA-sequenties en de pathogeniteitsdrempels voor elke aandoening zijn locusspecifiek. De grootte van de uitbreiding varieert van minder dan 30 herhalingen (bijvoorbeeld in CACNA1A) tot enkele duizenden herhalingseenheden (bijvoorbeeld in FMR1, DMPK, C9orf72 en FXN, die tot 5 kb groot kunnen zijn). Herhaalexpansies vertonen moleculaire instabiliteit, wat kan leiden tot veranderingen in de herhalingsgrootte (over het algemeen toenemend in lengte) over generaties en weefsels.4 In deze omstandigheden leidt een toename van het aantal herhalingen vaak tot een eerder begin en ernstiger ziekte in opeenvolgende generaties.4 Pediatrische aanvang van herhaalde expansiestoornissen kunnen zich voordoen als multisysteemsyndromen zonder specifieke fenotypische kenmerken,9 en kinderen met deze stoornissen hebben daarom meer kans om ondergediagnosticeerd te worden wanneer een familiegeschiedenis van herhalingsexpansiestoornis afwezig is dan wanneer deze aanwezig is.10– 12

Laboratoriumbeoordeling van herhaalde expansies is doorgaans beperkt tot de gerichte moleculaire beoordeling van een individuele locus op basis van de vermoedelijke klinische diagnose met behulp van PCR-gebaseerde of Southern-blot-methoden13, wat kostbaar en tijdrovend kan zijn. Bovendien kunnen, vanwege de gevarieerde en overlappende fenotypische kenmerken van deze aandoeningen, ziekte-geassocieerde herhalingsexpansieloci ongetest blijven.14

Het sequencen van het hele genoom is in opkomst als een eerstelijns diagnostisch hulpmiddel bij patiënten met een zeldzame ziekte15, maar tot voor kort werd gedacht dat het een beperkt vermogen had om loci met herhaalde expansies te beoordelen.16 Vooruitgang in de bio-informatica heeft de detectie van ziekten echter mogelijk gemaakt -het veroorzaken van herhaalde uitbreidingen van sequentiegegevens van de volgende generatie.17–22 Hier rapporteren we over de diagnostische beoordeling van een benadering voor het sequeneren van het hele genoom om herhaalde uitbreidingen te detecteren met behulp van retrospectieve PCR-gegevens, en de klinische validatie ervan bij patiënten in het 100000 Genomes Project die een vermoedelijke neurologische aandoening had, niet gediagnosticeerd met eerdere genetische tests.

Methoden:

Studieopzet en deelnemers

Deze evaluatie van sequentiebepaling van het hele genoom voor de detectie van herhaalde uitbreidingen omvatte zowel diagnostische nauwkeurigheid als klinische nauwkeurigheidsbeoordelingen. De diagnostische nauwkeurigheid werd geëvalueerd met behulp van gegevens van patiënten die eerder met PCR waren getest op herhaalde uitbreidingen waarvan bekend is dat ze neurologische aandoeningen veroorzaken.4 Patiënten werden geïdentificeerd op basis van twee bronnen: het 100 000 Genomes Project en het Genomic Laboratory van Cambridge University Hospitals ( Cambridge, VK). Voor beide groepen patiënten waren PCR-tests uitgevoerd op patiëntmonsters door laboratoria van de National Health Service (NHS) als onderdeel van routinematige klinische beoordeling: voor monsters in het 100000 Genomes Project werden PCR-tests uitgevoerd voordat ze voor het project werden gerekruteerd door de University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (Londen, VK); monsters met PCR-bevestigde herhalingsuitbreidingen werden verkregen van patiënten die werden getest door het Genomic Laboratory in Cambridge. Patiënten met PCR-positieve en PCR-negatieve testresultaten voor herhaalde expansiestoornissen werden geïdentificeerd voor opname in onze studie via laboratoriumregistratiesystemen; alle patiënten hadden schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven voor het gebruik van hun monster voor kwaliteitsborging en onderzoeks- en trainingsdoeleinden, als onderdeel van de optimalisatie en validatie van klinische diensten.

De sequentiebepaling van het hele genoom van elk monster werd uitgevoerd in een van de twee laboratoria: Genomics England (Hinxton, VK) voor de 100000 Genomes Project-monsters (n=254) en het Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) voor monsters verkregen door het Genomic Laboratory in Cambridge (n=150). Over het geheel genomen werd deze dataset gebruikt voor het diagnostische nauwkeurigheidsgedeelte van het onderzoek, en bestond uit PCR- en volledige genoomsequentiegegevens van 404 patiënten, die 13 loci beslaan die de meest voorkomende neurologische herhalingsexpansiestoornissen vertegenwoordigen: 11 loci geassocieerd met ataxie en late- beginnende neurodegeneratieve aandoeningen (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 en FXN), één locus geassocieerd met intellectuele achterstand (FMR1) en één locus geassocieerd met myotone dystrofie (DMPK). Voor elke locus waren PCR-testgegevens beschikbaar voor ten minste één uitgebreid allel (bijlage p 24).

Klinische nauwkeurigheid werd beoordeeld door de overeenstemming te onderzoeken van herhaalde expansies, zoals gedetecteerd met sequencing van het hele genoom, met vermoedelijke klinische diagnose na PCR-bevestiging bij patiënten met vermoedelijke genetische neurologische aandoeningen (familiale of vroege vormen van ataxie, neuropathie, spastische paraplegie, dementie , motorneuronziekte,parkinsonbewegingsstoornissen, verstandelijke beperking of neuromusculaire aandoeningen) die in 2013–17 werden aangeworven voor het 100000 Genomes Project. Het 100000 Genomes Project is een Brits programma om de waarde van sequencing van het hele genoom te beoordelen bij patiënten met onvervulde diagnostische behoeften bij zeldzame ziekten en kanker. Na ethische goedkeuring voor het 100000 Genomes Project door de East of England Cambridge South Research Ethics Committee (referentie 14/EE/1112), inclusief voor data-analyse en teruggave van diagnostische bevindingen aan de patiënten, werden deze patiënten gerekruteerd door beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg en onderzoekers van 13 Genomic Medicine Centres in Engeland en namen deel aan het project als zij of hun voogd schriftelijke toestemming hadden gegeven voor het gebruik van hun monsters en gegevens in onderzoek, inclusief dit onderzoek. Probands en, indien mogelijk, andere familieleden werden geïncludeerd volgens de geschiktheidscriteria die waren vastgesteld voor specifieke zeldzame ziekten (bijlage pp 5-11). Patiënten werden gerekruteerd voor het 100000 Genomes Project na standaard genetische tests in de NHS, zoals aangegeven in de geschiktheidscriteria. Gestandaardiseerde klinische baselinegegevens werden geregistreerd met behulp van Human Phenotyping Ontology (HPO)23 tegen ziektespecifieke datamodellen.24 De ziektestatus van familieleden, in verhouding tot de klinische indicatie van de proband voor testen, werd ook verzameld.

Om oorzakelijke herhalingsexpansies te identificeren bij patiënten met een genetisch niet-gediagnosticeerde ziekte, hebben we patiënten getest met vermoedelijke genetische aandoeningen die consistent zijn met een herhalingsexpansieziekte. Patiënten werden geselecteerd op basis van overeenstemming van hun ziekte en HPO-termen met stoornissen die verband houden met herhaalde expansie. De sequentiegegevens van het hele genoom van de patiënten werden opgevraagd om te zoeken naar uitbreidingen in bepaalde reeksen herhalingen met behulp van vier verschillende herhalingsuitbreidingspanelen op basis van hun klinische kenmerken (bijlage p 5). De herhalingsuitbreidingen die zijn geselecteerd voor opname in deze panelen zijn de meest voorkomende neurologische ziekteveroorzakende herhalingsexpansieloci. Patiënten met klinische kenmerken die mogelijk compatibel zijn met meer dan één herhalingsexpansiestoornis, werden getest op meerdere panels. Als een herhaalde uitbreidingsoproep werd gedaan met behulp van sequencing van het hele genoom, werden bevestigende testen door PCR uitgevoerd.

Voor elke patiënt met een bevestigde herhalingsexpansie werd de lokale arts geïnformeerd over het mogelijke diagnostische resultaat en werd de bijdrage van de herhalingsexpansie aan de klinische kenmerken van de patiënt beoordeeld. Voor herhaalde expansies die de klinische kenmerken van de patiënt geheel of gedeeltelijk verklaarden, werd een diagnostisch rapport opgesteld volgens de lokale standaardprocedures.

Procedures

Voor de historische NHS-monsters die werden gebruikt in het diagnostische nauwkeurigheidsgedeelte van onze studie, waren eerder herhaalde uitbreidingen getest met behulp van PCR-amplificatie en fragmentanalyse. Southern-blotting werd uitgevoerd voor grote C9orf72-expansies. In het klinische nauwkeurigheidsgedeelte van onze studie werden herhaalde uitbreidingen die werden gedetecteerd door sequencing van het hele genoom bij patiënten van het 100 000 Genomes Project, getest door PCR in monsters die waren opgeslagen in genetische laboratoria van NHS. Aanvullende details, inclusief primersequenties, zijn te vinden in de appendix (pp 2-3, 25-26).

DNA werd voorbereid voor sequencing van het hele genoom met behulp van TruSeq DNA PCR-vrije bibliotheekvoorbereiding, en 150 bp of 125 bp gepaarde sequencing werd uitgevoerd op HiSeq 2000- of HiSeq X-platforms in de high-throughput genomes-faciliteit voor Genomics England en bij de ICSL . Genomen werden gesequenced tot een gemiddelde diepte van 35× (31× tot 37×; appendix p 27). Short-tandem-repeat genotypering werd uitgevoerd met behulp van het ExpansionHunter-softwarepakket versie 3.1.2.25,26 In het kort, ExpansionHunter lijnt sequencing-uitlezingen opnieuw uit over een vooraf gedefinieerde set korte tandem-herhalingen om de grootte van beide allelen van een individu te schatten (bijlage p 3).

De uitvoer van ExpansionHunter bevat een schatting van het aantal herhalingselementen, de totale grootte en de betrouwbaarheidslimiet voor elke beoordeelde locus. Richtlijnen van de Association for Medical Pathology en het College of American Pathologists bevelen visuele inspectie aan van variantoproepen tijdens de routinematige beoordeling van high-throughput sequencing-varianten.27

Varianten met een korte tandemherhaling kunnen echter niet adequaat worden gevisualiseerd door algemene visualisatietools zoals Integrative Genomics Viewer.28 Om de sequentiegegevens van het hele genoom te onderzoeken die ten grondslag liggen aan elke genotype-aanroep, werd een grafiekvisualisatietool gebruikt, die directe visualisatie van haplotypes en de bijbehorende gelezen stapelup mogelijk maakt. van ExpansionHunter-genotypen (bijlage pp 3, 15). Visuele inspectie van de pileup-grafiek werd uitgevoerd op alle korte tandem-herhalingsoproepen van het hele genoom om te bevestigen dat de ExpansionHunter-voorspelling voor allelen volledig aanwezig was in elke uitlezing (dwz de herhalingssequentie was kleiner dan de leeslengte van de sequencing); om de aanwezigheid van een monoallele of biallele expansie te bevestigen; om vermeende vals-positieve oproepen te detecteren; en om vals-negatieve allelen te detecteren in biallele herhalingsexpansies, zoals FXN (bijlage pp 4, 16).

ExpansionHunter schat de herhalingsgrootte op basis van sequentiegegevens van het hele genoom door sequentielezingen te analyseren die geheel of gedeeltelijk een korte tandemherhaling bevatten. Als een short tandem repeat allel korter is dan de leeslengte, voorspelt ExpansionHunter de exacte grootte; als een short tandem repeat allel langer is dan de leeslengte, schat ExpansionHunter de herhalingsgrootte binnen een CI, afhankelijk van de locussequentiesamenstelling, de diepte van de sequentiebepaling en de kwaliteit van de sequentiebepaling.

statistische analyse

We classificeerden herhalingen als uitgebreid door sequencing van het hele genoom als de grootte voorspeld door ExpansionHunter boven de premutatie-cutoff was, of niet-uitgebreid als de voorspelde grootte onder de cutoff was (bijlage p 28).

Gevoeligheid en CI's voor detectie van herhalingsexpansie van het hele genoom werden berekend als het aandeel allelen met uitgebreide herhalingen onder eerder PCR-bevestigde allelen met uitgebreide herhalingen. De specificiteit werd geschat als het aandeel niet-geëxpandeerde allelen onder eerder geteste niet-geëxpandeerde herhalingen door middel van PCR. Een volledige beschrijving van de statistische formules vindt u in de bijlage (p 1).

Om herhalingsgroottes door PCR te vergelijken met herhalingsgrootteschattingen door middel van sequentiëring van het hele genoom, werden PCR-gekwantificeerde allelen vergeleken met herhalingsgroottes voorspeld door ExpansionHunter voor allelen die korter zijn dan de leeslengte over alle 13 korte tandem herhalingsloci. Concordantie werd berekend door het percentage herhalingsgroottes voorspeld door ExpansionHunter die in overeenstemming waren met de PCR-gekwantificeerde grootte, rekening houdend met de PCR-fout van plus of min één herhaling. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van R statistische softwareversie 3.6.3.

Rol van de financieringsbron

De onderzoeksopzet, patiënteninschrijving, gegevensverzameling en sequencing werden geleid door medewerkers van Genomics England en academische onderzoekers. Medewerkers van Illumina voerden de sequencing uit van 150 patiëntmonsters als een gepland onderdeel van het diagnostische nauwkeurigheidsonderzoek naar de volledige genoomsequencing en ontwikkelden ExpansionHunter. Medewerkers van Genomics England, academische onderzoekers en co-auteurs RTH, ED en MAE voerden de analyse en interpretatie uit van herhaalde uitbreidingen bij patiënten die waren gerekruteerd voor het 100 000 Genomes Project. De financieringsbronnen speelden geen rol bij de interpretatie van de gegevens of het schrijven van het rapport.

Resultaten

De diagnostische nauwkeurigheid van sequencing van het hele genoom om herhalingsexpansie te detecteren, werd geëvalueerd tegen 793 PCR-tests die eerder binnen de NHS waren uitgevoerd bij 404 patiënten (64 patiënten werden getest op meer dan één herhaling; figuur 1). Van deze tests werden 183 geclassificeerd als hebbende een uitgebreide herhaling en 610 als geen herhalingsexpansie door PCR, wat een totaal van 221 geëxpandeerde en 1321 niet-geëxpandeerde individuele allelen opleverde over 13 loci van de ziekte (bijlage pp 24, 28). Sequentie van het hele genoom classificeerde 215 van de 221 geëxpandeerde allelen en 1316 van de 1321 niet-geëxpandeerde allelen correct in vergelijking met de resultaten van de PCR-test (bijlage pp 27, 29), wat een initiële gevoeligheid van 97,3 procent (95 procent BI 94,2-99) aantoont ·0) en specificiteit van 99,6 procent (99,1–99,9; tabel 1). Na de visuele correctie van alle oproepen op basis van de kwaliteit van de uitlezingen, nam de gevoeligheid toe tot 99,1 procent (96,8-99,9) en de specificiteit tot 100 procent (99,7-100; figuur 2A, tabel 1). Visualisatie van de uitgebreide allelen maakte detectie van vals-positieve resultaten en herclassificatie van alle vals-negatieve allelen in FXN mogelijk, waarvan slechts één allel correct werd geclassificeerd als geëxpandeerd in monsters met biallele uitbreidingen (bijlage pp 17, 18).

De lengte van de herhaling werd gekwantificeerd door PCR in 509 PCR-tests waarbij 945 allelen werden ondervraagd over 13 herhaalde expansie-loci. Correlaties tussen ExpansionHunter en PCR voor herhalingsgroottes die korter en groter zijn dan de sequencing-leeslengte (dwz 150 bp) worden weergegeven in de appendix (bijlage p 19). Er werd een hoge overeenstemming waargenomen voor herhalingen die korter waren dan de leeslengte, met een overeenkomst van 92,7 procent (836 van 902) tussen PCR en ExpansionHunter. Locusvariabiliteit werd waargenomen, met een hoge overeenstemming tussen ExpansionHunter en PCR voor ATXN2, ATXN7, CACNA1A en HTT, en een lage overeenstemming voor DMPK of TBP (bijlage p 30). De lengtes van allelen groter dan de leeslengte werden onderschat door ExpansionHunter, wat de nauwkeurigheid van het aanroepen van DMPK, FMR1 en FXN beïnvloedde (figuur 2B, appendix pp 19, 31).

Hoewel ExpansionHunter in staat was om grote geëxpandeerde allelen in FMR1, DMPK, C9orf72 en FXN correct te identificeren (appendix p 29), waren de voorspelde schattingen van de grootte meestal lager dan die verkregen door PCR, aangezien de herhalingsgrootte toenam binnen het pathogene bereik, wat de vermogen om onderscheid te maken tussen grote en kleine uitbreidingen in DMPK, C9orf72 en FXN, of tussen volledige uitbreidingen en permutaties in FMR1 (bijlage p 31). Loci met een door PCR beoordeelde herhalingslengte groter dan 200 herhalingen in FMR1 en geclassificeerd als een volledige mutatie hadden bijvoorbeeld een gemiddelde herhalingsgrootte geschat door ExpansionHunter van 92,6 (SD 17,8; appendix p 31).

Om het vermogen van herhaalde expansiedetectie door middel van volledige genoomsequencing te testen om de diagnose van eerder geteste en genetisch niet-gediagnosticeerde patiënten op te lossen, testten we 11 631 patiënten met een vermoedelijke genetische neurologische aandoening die waren gerekruteerd voor het 100000 Genomes Project (figuur 1). De sequentiegegevens van het hele genoom werden geëvalueerd met behulp van vier verschillende repeat-expansiepanels op basis van de klinische kenmerken van de patiënt. Het aantal patiënten dat met elk van de vier panels is getest, wordt weergegeven in tabel 2.

Over het algemeen hebben we herhaalde expansies gedetecteerd en visueel bevestigd in monsters van 105 patiënten (tabel 2, appendix pp 20, 33). Hiervan waren 81 monsters beschikbaar voor bevestigende testen door middel van PCR, en van 68 werd bevestigd dat ze een herhaalde expansie hadden (0·6 procent opbrengst): 45 (1,2 procent) van 3692 in paneel A, acht ({ {18}}·3 procent ) van 2743 in paneel B, vijf (0,6 procent) van 860 in paneel C en tien (0,1 procent) van 6731 in paneel D. Dertien van 81 uitbreidingsoproepen werden niet bevestigd als pathogene herhalingsexpansies (16 procent valse ontdekkingssnelheid). Hiervan waren er twee niet-geëxpandeerde allelen in ATXN1 en ATXN2, vier waren FMR1-oproepen van gemiddelde grootte (bijlage p 21), en zeven waren FMR1-permutaties.

Klinische details van de 68 patiënten met herhaalde expansie bevestigd door PCR, inclusief hun klinische presentaties, de geïdentificeerde herhaalde expansie en de bijdrage van de herhaalde expansie aan de klinische kenmerken van de patiënt, worden gegeven in tabel 3; de HPO-termen, de door ExpansionHunter geschatte herhalingsgrootte en of er een diagnostisch rapport is afgegeven, staan ​​vermeld in de bijlage (p 33).

Uitbreidingen werden waargenomen bij patiënten met een grote verscheidenheid aan overlappende klinische presentaties, getest met panel A (tabel 3, appendix p 22), waaronder een herhaalde ATXN2-expansie bij een patiënt met op levodopa reagerende vroege ziekte van Parkinson en een voorgeschiedenis van progressieve cerebellaire ataxie , en AR-expansies bij vier patiënten die klinisch gediagnosticeerd waren met de ziekte van Charcot-Marie-Tooth, waaronder één met een genetisch bevestigde demyeliniserende neuropathie (dwz ziekte van Charcot-Marie-Tooth type 1, patiënt 42; bijlage p 33). Een breed scala aan eerdere klinische diagnoses werd waargenomen bij patiënten met pathogene herhalingsexpansies.

Bij zeven patiënten met amyotrofische laterale sclerose of een andere motorneuronziekte werden bijvoorbeeld expansies vastgesteld in AR (n=4) en C9orf72 (n=3). Bij patiënten met verdenking op erfelijke ataxie, identificeerden we uitbreidingen in loci die niet waren beoordeeld als onderdeel van routinematig diagnostisch onderzoek binnen de NHS op het moment van rekrutering, waaronder ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP en HTT ( tafel 3). We hebben ook herhalingsexpansies gedetecteerd bij patiënten met klinische kenmerken die overeenkomen met alternatieve herhalingsexpansiestoornissen, waaronder een C9orf72-expansie bij vroege en familiale ziekte van Parkinson (patiënt 24, tabel 3) en herhaalde expansies in het verminderde penetrantiebereik in HTT (38 herhalingen) bij twee zussen met een bewegingsstoornis, dementie, depressie en spraakproblemen (patiënten 44 en 45), wat de diagnostische uitdaging van deze herhaalde expansiestoornissen onderstreept.

Acht kinderen die met panel B werden getest, bleken grote CAG-herhalingsexpansies te hebben (figuur 3), waarvan er zeven de klinische kenmerken van de patiënt volledig verklaarden. Zes patiënten hadden geen informatieve familiegeschiedenis en kregen op het moment van rekrutering geen herhaalde uitbreidingstest aangeboden als onderdeel van hun klinische beoordeling (patiënten 48-53; tabel 3, bijlage p 33). Twee van deze kinderen droegen grote HTT-uitbreidingen (90-100 CAG-herhalingen). Merk op dat één kind de herhaling had geërfd van een niet-aangetaste ouder zonder familiegeschiedenis van de ziekte van Huntington. Familietests zijn aan de gang, maar een verminderd penetrantie-allel is geïdentificeerd in de uitgebreide familie, wat aangeeft dat de herhaling in één generatie met meer dan 60 herhalingseenheden was uitgebreid (patiënt 52). Op het moment van schrijven vertoonde niemand in de familie tekenen van de ZvH, en genetische counseling en testen zijn aan de gang voor de ouders. Twee kinderen jonger dan 5 jaar hadden grote herhalingsexpansies in ATXN7 en vertoonden complexe multisysteemziekte. Voor een van deze kinderen (patiënt 50) vertoonde hun ouder loopproblemen 2 jaar na inschrijving in het 100000 Genomes Project. Evenzo bleek een meisje van 10 jaar met een verstandelijke beperking een 99-herhaalde expansie in ATXN2 te hebben, ondanks het feit dat beide ouders als onaangetast waren aangemerkt, en een meisje van 18 jaar met dementie bleek drager te zijn van een { {19}}herhaal uitbreiding in ATN1 (bijlage p 33).

Vijf expansies in DMPK (panel C) werden gedetecteerd, waaronder bij een kind en een moeder met een klinische diagnose van spierdystrofie, bij twee broers en zussen met verdenking op distale myopathie, en bij een adolescent met congenitale myopathie (patiënten 54-58). FMR1-expansies (paneel D) werden gedetecteerd bij negen jongens en één meisje, en een diagnose van het fragiele X-syndroom verklaarde de klinische kenmerken volledig of gedeeltelijk (patiënten 59-68).

Discussie

De diagnose van herhaalde expansiestoornissen is een uitdaging in de gezondheidszorg vanwege heterogene en overlappende klinische kenmerken en niet-specifieke klinische bevindingen, die in ernst kunnen toenemen met de leeftijd en in elke volgende generatie. Herhaalde expansiestoornissen behoren tot de meest voorkomende oorzaken van erfelijke neurologische aandoeningen.4 Niettemin kunnen patiënten ondergediagnosticeerd worden, hetzij omdat er onvoldoende genetische tests zijn uitgevoerd, hetzij omdat de oorzakelijke genetische varianten nog moeten worden ontdekt. De testbenaderingen zijn momenteel gefragmenteerd en patiënten kunnen de onjuiste herhaalexpansielocus laten testen29 of een moleculaire test krijgen voor een andere klasse van varianten vanwege overlap van klinische kenmerken met andere neurologische genetische aandoeningen.30

Sequentie van het gehele genoom is in meerdere settings gebruikt als een eerstelijns diagnostische test voor zeldzame neurologische aandoeningen, maar er werd eerder gedacht dat het een laag vermogen had om herhaalde uitbreidingen te detecteren.16 Er zijn verschillende hulpmiddelen ontwikkeld om herhaalde uitbreidingen van het gehele genoom te identificeren sequencing in de onderzoeksomgeving,31 maar geen van deze benaderingen is toegepast op sequencinggegevens van het hele genoom die zijn verzameld van een groot aantal patiënten in een enkele gezondheidszorg. We presenteren bewijs dat een algoritme dat is ontworpen om herhalingsuitbreidingen van sequencing van het hele genoom te detecteren, op betrouwbare wijze de meest voorkomende ziekteveroorzakende herhalingsuitbreidingen kan beoordelen en eerder genetisch niet-gediagnosticeerde gevallen in een groot cohort van patiënten met neurologische aandoeningen kan oplossen. Onze resultaten geven aan dat sequencing van het hele genoom onderscheid kan maken tussen niet-geëxpandeerde en geëxpandeerde allelen met een hoge gevoeligheid en specificiteit over 13 herhaalde expansieloci (die verder kunnen worden verbeterd door visuele inspectie), nauwkeurig de grootte van allelen kan berekenen die kleiner zijn dan de leeslengte , en kan de omvang van grote uitbreidingen in FMR1, DMPK, FXN en C9orf72 onderschatten.

Toen de detectie van herhaalde uitbreidingen door middel van sequentiëring van het hele genoom werd beoordeeld aan de hand van positieve en negatieve resultaten die eerder waren verkregen in klinisch diagnostische genomische laboratoria met behulp van gouden standaardmethoden, vonden we een gevoeligheid van minimaal 97,3 procent en specificiteit van 99,6 procent. Verder toonden we aan dat zowel de specificiteit als de gevoeligheid kunnen worden verbeterd door handmatige curatie van de read-pileup, waardoor fout-positieve resultaten en herclassificatie van fout-negatieve allelen in monsters met biallele uitbreidingen kunnen worden gedetecteerd. Van de 6731 patiënten die werden getest op FMR1 (paneel D), werd voorspeld dat 124 oproepen zouden worden uitgebreid. We konden 97 door visuele inspectie uitsluiten als waarschijnlijke valse positieven. Dit geeft aan dat 1 op de 54 sequencing-tests van het hele genoom een ​​FMR1-oproep zou hebben die visueel zou moeten worden geïnspecteerd om een ​​mogelijke vals-positieve oproep te negeren. Er wordt gewerkt aan het verbeteren van de ExpansionHunter-genotyperingsmethode om het aantal fout-positieve oproepen voor FMR1 te verminderen.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 herhalingen) veroorzaken een ernstigere ziekte, en spinocerebellaire ataxie type 36 (NOP56), waarvoor uitbreidingen van meer dan 650 herhalingen als pathogeen worden beschouwd en herhalingsgrootten van 15-650 als intermediair en varianten van onzekere betekenis.

Er zijn meer dan 40 herhalingsexpansieloci geïdentificeerd; veel van deze loci zijn pas recent geïdentificeerd en zijn nu geassocieerd met voorheen onverklaarbare aandoeningen, waaronder cerebellaire ataxie met neuropathie en vestibulair areflexiesyndroom (RFC1) 32 en myoclonische epilepsie (SAMD12).33 De meest voorkomende neurologische ziekte-veroorzakende herhaalde expansie-loci waren geselecteerd voor onze studie op basis van de beschikbaarheid van positieve en negatieve controlemonsters.

De hier gepresenteerde bevindingen suggereren dat ExpansionHunter in staat zou moeten zijn om niet-geëxpandeerde en geëxpandeerde allelen nauwkeurig te classificeren op elke herhaalde expansielocus als de niet-geëxpandeerde allelen kleiner zijn dan de leeslengte (dwz 150 bp). Hoewel de meeste herhalingsexpansieloci allelen hebben die kleiner zijn dan 150 bp wanneer ze niet zijn geëxpandeerd, kunnen sommige loci waarvoor de grootte van het niet-geëxpandeerde allel dichtbij 150 bp ligt (bijv. NOTCH2NLC)34 moeilijker te genotyperen met deze benadering. Voor loci waar de uitgebreide herhaling significant groter is dan de leeslengte, kan sequencing van het hele genoom pathogene expansies detecteren (bijv. NOP56,35 RFC120,32). Opkomende long-read sequencing-technologieën kunnen complementaire benaderingen bieden bij het genotyperen van grote uitbreidingen

Beoordeling van herhaalde uitbreidingen met behulp van sequencing van het hele genoom bij 11 631 niet-gediagnosticeerde patiënten die zijn gerekruteerd voor het 100 000 Genomes Project, leverde 68 patiënten op met verklarende bevindingen. Patiënten werden gerekruteerd voor het 100 000 Genomes Project na standaard genetische tests; daarom vertegenwoordigt het aandeel herhaalde expansies dat in dit cohort is geïdentificeerd een verhoging van de diagnostische opbrengst van standaard NHS-tests, waaronder locusspecifieke testen voor herhaalde expansiestoornissen zoals FXN of DMPK. Merk op dat sommige diagnoses niet werden vermoed op basis van de klinische kenmerken van de patiënt, waaronder zes pediatrische patiënten die geen bekende familiegeschiedenis hadden van een herhaalde expansiestoornis. De gemiddelde omvang van de herhalingsexpansie die wordt voorspeld door sequentiëring van het hele genoom bij pediatrische patiënten die in dit onderzoek worden beschreven, is aanzienlijk groter dan het gemiddelde bij volwassenen, in overeenstemming met de verwachting dat grotere expansies geassocieerd zijn met een eerder en ernstiger begin, zelfs bij kinderen. Er is meer werk nodig, maar deze bevinding suggereert dat een leeftijdsafhankelijke en herhaalde grootteafhankelijke beoordeling van pathogeniteit een pediatrische diagnose zou kunnen ondersteunen door het potentiële gevaar van het identificeren van risico-allelen bij volwassenen te verminderen, wat leidt tot ongevraagde voorspellende tests bij kinderen.

Onze bevindingen maken het mogelijk een klinische diagnostische workflow op te zetten voor sequencing van het hele genoom (bijlage p 23). We stellen voor om visuele inspectie uit te voeren voor alle oproepen die zijn geclassificeerd als geëxpandeerd om valse positieven te detecteren, en voor biallele uitbreidingen waarvoor slechts één uitgebreid allel is gedetecteerd (bijv. FXN). We raden laboratoria aan ExpansionHunter te gebruiken om de aanwezigheid van een uitzetting te beoordelen zonder zich te houden aan de grootteschatting en om bevestigende PCR-tests uit te voeren als een standaardonderdeel van de testworkflow.

Zeldzame erfelijke ziekten omvatten een breed scala aan klinische kenmerken, waardoor locusspecifieke genomische tests inefficiënt, moeilijk en duur zijn. We presenteren bewijs dat sequencing van het hele genoom van klinische kwaliteit met het potentieel om een ​​​​reeks zeldzame neurologische ziekten te diagnosticeren die zich doorgaans presenteren met een enkele basis-, indel- of kopienummervarianten nu kunnen worden uitgebreid tot herhaalde uitbreidingen. Omdat sequencing van het hele genoom een ​​enkele test biedt die de meest voorkomende herhalingsuitbreidingen kan identificeren, en het tegelijkertijd mogelijk maakt om puntmutaties en kopienummervarianten in genen die met deze aandoeningen zijn geassocieerd te testen, biedt het de mogelijkheid om de meeste patiënten met deze heterogene aandoeningen te identificeren die niet zijn gediagnosticeerd met behulp van locusspecifieke tests. In het tijdperk van opkomende therapieën voor deze aandoeningen kan vroege detectie cruciaal worden.37 Deze resultaten ondersteunen de implementatie van sequencing van het hele genoom voor de detectie van herhaalde uitbreidingen in klinische diagnostische laboratoria, een benadering die al is opgenomen in de NHS England National Genomic Test Directory,38 voor onderzoek naar niet-gediagnosticeerde zeldzame neurologische ziekte.

Referenties

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Een diagnostisch plafond voor exome-sequencing bij cerebellaire ataxie en gerelateerde neurologische aandoeningen. Hum-mutat 2020; 41: 487-501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Erfelijke spastische paraplegie in Griekenland: karakterisering van een voorheen onontgonnen populatie met behulp van next-generation sequencing. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857-63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Diagnostische opbrengst van een gericht genpanel voor sequentiebepaling van de volgende generatie voor bewegingsstoornissen bij kinderen: een 3- jaar cohortonderzoek. Voor Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Herhaalde uitbreidingsziekten. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105-23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporale dementie en/of amyotrofische laterale sclerose. Seattle, WA: Universiteit van Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellaire ataxie. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klinische neurogenetica: autosomaal dominante spinocerebellaire ataxie. Neurol Clin 2013; 31: 987-1007.

8 La Spada A. Spinale en bulbaire spieratrofie. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: Universiteit van Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Dodelijke vorm van spinocerebellaire ataxie type 7 met vroege aanvang in de kindertijd. Boog Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Ataxine-7-aggregatie en ubiquitinatie in infantiele SCA7 met 180 CAG-herhalingen. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellaire ataxie type 2 presenteert zich met cognitieve regressie in de kindertijd. J Kind Neurol 2008; 23: 999-1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Ontnuchterende AK. Spinocerebellaire ataxie bij kinderen 3: tongdystonie als vroege manifestatie. Tremor Andere Hyperkinetische Mov 2019; online gepubliceerd op 13 september.

13 Vogel TD. Myotone dystrofie type 1. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: Universiteit van Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Frequentie van SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS en C9orf72 herhaalexpansies bij SCA-patiënten die negatief zijn voor de meest voorkomende SCA-subtypes. BMC Neurol 2018; 18: 3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Gehele genoomsequencing van patiënten met zeldzame ziekten in een nationaal gezondheidssysteem. Natuur 2020; 583: 96-102.

16 Ashley EA. Op weg naar precisiegeneeskunde. Nat Rev Genet 2016; 17: 507-22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Diagnostisch en klinisch nut van sequencing van het hele genoom in een cohort van niet-gediagnosticeerde Chinese families met zeldzame ziekten. Wetenschappelijk vertegenwoordiger 2019; 9:19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profilering van het genoombrede landschap van tandemherhalingsuitbreidingen. Nucleïnezuren Onderzoek 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detectie van uitbreidingen van tandemherhalingen in cohorten die zijn gesequenced met kort leesbare sequencinggegevens. Ben J Hum Genet 2018; 103: 858-73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Op bio-informatica gebaseerde identificatie van uitgebreide herhalingen: een niet-referentie intronische pentameerexpansie in RFC1 veroorzaakt CANVAS. Ben J Hum Genet 2019; 105: 151-65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Kopie-nummervarianten in klinische genoomsequencing: inzet en interpretatie voor zeldzame en niet-gediagnosticeerde ziekte. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Genoombrede detectie van tandem-DNA-herhalingen die worden uitgebreid bij autisme. Natuur 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: een hulpmiddel voor het annoteren en analyseren van menselijke erfelijke ziekten. Ben J Hum Genet 2008; 83: 610-15.

24 Genomics Engeland. Zeldzame ziektetoestanden klinische datamodellen. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (toegankelijk op 4 augustus 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Detectie van lange herhalingsuitbreidingen van PCR-vrije sequentiegegevens van het hele genoom. Genoomonderzoek 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: een op sequentiegrafieken gebaseerd hulpmiddel om variatie in korte tandemherhalingsregio's te analyseren. Bio-informatica 2019; 35: 4754-56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Normen en richtlijnen voor het valideren van next-generation sequencing bioinformatica-pijplijnen: een gezamenlijke aanbeveling van de Association for Molecular Pathology en het College of American Pathologists. J Mol Diagnose 2018; 20: 4-27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integratieve genomics-viewer. Nat Biotechnologie 2011; 29: 24-26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Fenotypische homogeniteit van de ziekte van Huntington-achtige presentatie in een SCA17-familie. Neurologie 2006; 67: 1701-03.

30 Schneider SA, Bird T. De ziekte van Huntington, lookalikes van de ziekte van Huntington en goedaardige erfelijke chorea: wat is er nieuw? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342-54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Recente vooruitgang in de detectie van herhaalde uitbreidingen met kort leesbare sequencing van de volgende generatie. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Biallele expansie van een intronische herhaling in RFC1 is een veelvoorkomende oorzaak van laat optredende ataxie. Nat Genet 2019; 51: 649-58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Uitbreidingen van intronische TTTCA- en TTTTA-herhalingen bij goedaardige volwassen familiale myoclonische epilepsie. Nat Genet 2018; 50: 581-90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Niet-coderende CGG-herhalingsexpansies bij neuronale intranucleaire inclusieziekte, oculopharyngodistal myopathie en een overlappende ziekte. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, paus K, et al. Snelle diagnose van spinocerebellaire ataxie 36 in een familie van drie generaties met behulp van kort gelezen sequentiegegevens van het hele genoom. Mov Disord 2020; 35: 1675-1679.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Langgelezen sequencing die in opkomst is in medische genetica. Voor Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Herhaalde expansiestoornissen: mechanismen en therapieën. Neurotherapeutica 2019; 16: 924–27.

38 Nationaal gezondheidssysteem. National Genomic Test Directory: testcriteria voor zeldzame en erfelijke ziekten. oktober 2021.