Een 13-weekse subchronische toxiciteitsstudie van 2-(l-menthoxy)ethanol bij F344-ratten

Invoering

2-(1-menthoxy)ethanol (CAS-nr. 38618-23-4) is een heldere en kleurloze vloeistof met een karakteristieke geur en wordt veel gebruikt als smaakstof. Het Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) heeft 2-(L-methoxy)ethanol als smaakstof, gecategoriseerd als stoffen die structureel verwant zijn aan menthol1. Gebaseerd op de structurele klasse van smaakstoffen, 2-(L-methoxy)ethanol werd ingedeeld in klasse I. In de Verenigde Staten en Europa waren de innameniveaus van 2-(L-methoxy)ethanol door mensen werden geschat op respectievelijk 12 ug/persoon/dag en 0,01 ug/persoon/dag, beide onder de Klasse I-drempel van 1.800 ug/persoon/dag. Op basis van deze schattingen wordt aangenomen dat 2-(1-menthoxy)ethanol levert mogelijk geen veiligheidsrisico's op tijdens routinematig gebruik als smaakstof.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg lichaamsgewicht [LW])1. Ondanks het gebruik van 2-(1-menthoxy)ethanol als smaakstof, zijn er beperkte gegevens beschikbaar over de toxiciteit van deze verbinding bij herhaalde dosering. Ons laboratorium heeft de toxiciteit van verschillende voedseladditieven, inclusief representatieve smaakstoffen uit elke categorie, onderzocht in knaagdiermodellen2–7. Om het toxicologische profiel te verduidelijken en een no-observed-adverse-effect level (NOAEL) vast te stellen, hebben we een subchronisch toxiciteitsonderzoek van 13-weken uitgevoerd naar 2-(1-menthoxy)ethanol, dat oraal toegediend aan F344-ratten via maagsonde.

Materialen en methodes

Teststof

2-(1-menthoxy)ethanol (partij nr. 5I0002, zuiverheid 99,9%) geproduceerd door Takasago Int. Corp. (Tokio, Japan) werd geleverd door de Division of Standards and Evaluation, Department of Food Safety, Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan, met de steun van de Japan Flavour & Fragrance Materials Association (Tokio, Japan). Hoewel de teststof werd geleverd als een mengsel van optische isomeren (CAS-nr. 38618-23-4), werd door de fabrikant bevestigd dat het de l-enantiomeer (CAS-nr. 75443-64-0) ​​is. Orale sondevoeding met maïsolie (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) als drager werd gekozen als toedieningsroute vanwege de waterige onoplosbaarheid en vluchtigheid van 2-(1-menthoxy)ethanol. Oplossingen van 2-(1-menthoxy)ethanol werden dagelijks bereid, onmiddellijk vóór toediening. Na opslag gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werden de restverhoudingen van 2-(1-menthoxy)ethanol in 4, 40 en 400 mg/ml oplossing bevestigd als 96,8%, 99,8% en 96,5%. respectievelijk door gaschromatografie (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokyo, Japan).

Experimentele dieren

In totaal werden 40 mannelijke en 40 vrouwelijke specifieke pathogeenvrije ratten (F344/DuCrlCrlj, 5 weken) gekocht bij Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) en na acclimatisering gedurende één week gebruikt. Tijdens het onderzoek werden de dieren gehuisvest in kooien van polycarbonaat met zacht chip beddengoed, gehouden in een kamer met een barrièresysteem om de licht/donkercyclus (12 uur), ventilatie (luchtuitwisselingssnelheid van 18 keer/uur), temperatuur (12 uur) te controleren. 24 ± 1 graad) en relatieve vochtigheid (55 ± 5%). De kooien en het chipstrooisel werden twee keer per week vervangen. Elk dier had gratis toegang tot kraanwater en een basaal dieet (CRF-1; Oriental Yeast, Tokyo, Japan). Aan het begin van het experiment werden de dieren willekeurig toegewezen aan vier groepen van elk 10 mannelijke en vrouwelijke ratten, op basis van hun lichaamsgewicht gemeten onmiddellijk vóór aanvang van de behandeling met de teststof.

Studie ontwerp

In een voorlopig onderzoek van {0}} dagen waarin 2-(1-menthoxy)ethanol werd beoordeeld, toegediend in doses van 0, 200, 400 en 800 mg/kg lichaamsgewicht/ Per dag waren de absolute en relatieve levergewichten significant verhoogd in alle behandelde groepen van beide geslachten (gegevens niet getoond). Op basis van deze resultaten hebben we 2-(1-menthoxy)ethanoldoses van 0, 15, 60 en 250 mg/kg lichaamsgewicht/dag geselecteerd voor toediening aan zowel mannelijke als vrouwelijke ratten in de huidige {{ Toxiciteitsonderzoek van 13}} weken.

De algemene omstandigheden en de sterfte werden dagelijks beoordeeld. Gedurende de experimentele periode werden het lichaamsgewicht, evenals de geleverde en resterende hoeveelheid voer, eenmaal per week gemeten. Alle ratten werden een nacht gevast na voltooiing van de behandeling, en bloedmonsters voor hematologie en serumbiochemie werden verzameld uit de abdominale aorta onder diepe inhalatie-anesthesie met behulp van isofluraan. Het onderzoeksontwerp was gebaseerd op de Guidelines for Designation for Food Additives and Revision of Standards for Use of Food Additives of Japan (1996) en goedgekeurd door de Animal Care and Utilization Committee van het National Institute of Health Sciences, Japan.

Hematologie en serumbiochemie

De volgende hematologische parameters werden geanalyseerd met behulp van ProCyte Dx automatische hematologieanalysatoren (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, VS): aantal witte bloedcellen (WBC), aantal rode bloedcellen (RBC), hemoglobineconcentratie (HGB), hematocriet (HCT), gemiddeld corpusculair volume (MCV), gemiddeld corpusculair hemoglobine (MCH), gemiddelde corpusculaire hemoglobineconcentratie (MCHC), aantal bloedplaatjes (PLT) en differentiële leukocytcellen, waaronder neutrofielen (Neut), lymfocyten (Lymph), monocyten (Mono), eosinofielen (Eosino) en basofielen (Baso). Biochemische serumanalyse werd uitgevoerd door Oriental Yeast voor de volgende parameters: totaal eiwit (TP), albumine (Alb), albumine/globuline verhouding (A/G), totaal bilirubine (Bil), glucose, totaal cholesterol (T-Chol), triglyceride (TG), ureumstikstof (BUN), creatinine (Cre), calcium (Ca), anorganisch fosfor (IP), natrium (Na), kalium (K), chloor (Cl), aspartaataminotransferase (AST), alanineaminotransferase (ALT), alkalische fosfatase (ALP) en -glutamyltranspeptidase (-GTP).

Orgaangewichten en histopathologische beoordeling

Bij alle dieren werd een volledige necropsie uitgevoerd en de hersenen, de thymus, de longen, het hart, de milt, de lever, de bijnieren, de nieren, de testikels en de eierstokken werden gewogen. Deze organen, evenals weefsels van het ruggenmerg, de nervus trigeminus, de hypofyse, de neusholte, de speekselklieren, de tong, de slokdarm, de luchtpijp, de aorta, de schildklier, de bijschildklier, de pancreas, de maag, de dunne en dikke darm, het submandibulaire en het mesenteriale weefsel lymfeklieren, vagina, baarmoeder, urineblaas, prostaatklier, zaadblaasjes, epididymis, dijbeen en borstbeen met beenmerg, wervels, skeletspieren, heupzenuw, huid en borstklier, werden gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline; vervolgens werden in paraffine ingebedde secties bereid en gekleurd met hematoxyline en eosine voor histopathologisch onderzoek. De teelballen en ogen met Harderiaanse klieren werden respectievelijk gefixeerd in Bouin's fixeermiddel en Davidson's oplossing. Botweefsel, waaronder de neusholte, wervels, borstbeen en dijbeen, werden gedurende maximaal 2 weken ontkalkt met een mengsel van 10% mierenzuur en 10% gebufferde formaline. Histopathologische beoordeling werd uitgevoerd voor alle weefsels verkregen van dieren in de controlegroep en de groep waaraan de hoogste dosis werd toegediend, tenzij er behandelingsgerelateerde laesies werden waargenomen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE IMMUNITEIT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Immunohistochemie voor 2u-globuline

Bij mannelijke ratten werd de accumulatie van 2u-globuline in de nier onderzocht door immunohistochemische analyse van in paraffine ingebedde coupes. Voor het ophalen van antigeen werden de secties verkregen van 5 ratten in elke groep gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur geïncubeerd met proteïnase K (DAKO, Glostrup, Denemarken). Alle secties werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ondergedompeld in een 3% H2O2/methanoloplossing om de endogene peroxidaseactiviteit te inactiveren. Na het blokkeren van niet-specifieke reacties met 10% normaal konijnenserum, werden de secties 's nachts bij 4 graden 8 geïncubeerd met een primair antilichaam voor 2uglobuline (verdund 1:400; anti-rat 2u-globuline antilichaam; R&D Systems, Minneapolis, MN, VS). Visualisatie van antilichaambinding werd uitgevoerd met behulp van een VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, VS) en 3,3'-diaminobenzidine. Alle secties werden tegengekleurd met hematoxyline.

statistische analyse

Variaties in gegevenswaarden voor lichaamsgewicht tijdens de experimentele periode, evenals voor hematologie, serumbiochemie en orgaangewichten, werden beoordeeld op homogeniteit met behulp van de Bartlett-test. Eenrichtingsvariantieanalyse en de Kruskal-Wallis-test werden respectievelijk gebruikt voor homogene en heterogene gegevens. Bij het vaststellen van statistisch significante verschillen werd de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett gebruikt om controle- en behandelingsgroepen te vergelijken. Vergelijkingen van histopathologische incidenties en cijfers werden geanalyseerd door respectievelijk Fisher's exacte waarschijnlijkheidstest en Mann-Whitney's U-test te gebruiken. P-waarden van<0.05 were considered statistically significant.

Resultaten

In-life parameters, hematologie en serumbiochemie

Gedurende de gehele experimentele periode werden geen significante klinische symptomen waargenomen en alle dieren overleefden tot de geplande necropsie. Bovendien werden er geen significante verschillen in lichaamsgewicht en dagelijkse voedselinname waargenomen bij mannelijke en vrouwelijke ratten (Fig. 1A en B).

Hematologische en serumbiochemische gegevens worden respectievelijk weergegeven in Tabellen 1 en 2. Hematologische analyses brachten significant verlaagde HGB, HCT, MCV en MCH en verhoogde PLT aan het licht bij mannelijke ratten die 250 mg/kg lichaamsgewicht/dag 2-(1-menthoxy)ethanol kregen (Tabel 1). In de biochemie van serum werden significante stijgingen van TP, T-Chol en Ca en dalingen van Bil en ALP waargenomen bij mannen van de 250 mg/kg-groep (Tabel 2). Een significante toename van Cre en een afname van A/G werden waargenomen bij mannen van de groepen van 60 en 250 mg/kg. Bij vrouwen werd een significante toename van Ca en een afname van ALP geregistreerd in de groepen van 60 en 250 mg/kg, terwijl verhoogde T-Chol en verlaagde A/G, Bil, TG, AST en ALT werden gedetecteerd in de 250 mg-groepen. /kg groep. Hoewel een significante stijging van de TG en een daling van de Cl werden waargenomen bij mannen die 60 mg/kg kregen toegediend, suggereerde het ontbreken van een dosisrelatie dat deze verschillen niet verband hielden met blootstelling aan de teststof.

Orgel gewichten

Gegevens voor orgaangewichten zijn samengevat in Tabel 3. Het absolute en relatieve levergewicht was significant verhoogd bij beide geslachten van de groep die 250 mg/kg kreeg (Tabel 3). Er werd een significante toename van het relatieve levergewicht waargenomen bij mannen uit de 60 mg/kg-groep. Bij mannen was het absolute en relatieve niergewicht significant verhoogd in de groepen met 60 en 250 mg/kg. In de mannelijke 250 mg/kg-groep werden significante toenames in het absolute en relatieve gewicht van de bijnieren en het relatieve gewicht van de milt en testikels opgemerkt.

Histopathologie en immunohistochemie

Gegevens voor histopathologische en immunohistochemische bevindingen zijn samengevat in respectievelijk Tabellen 4 en 5. Histopathologische bevindingen onthulden dat de frequentie van accumulatie van eosinofiele korrels (Fig. 2A-D), basofiele tubuli en hyaliene cast, evenals focale interstitiële ontsteking in de nier, significant verhoogd was in volledig mannelijke behandelingsgroepen in vergelijking met de controlegroep. groep (Tabel 4). Op basis van immunohistochemische analyses vertoonden mannelijke ratten behandeld met de teststof een toename in de immunoreactiviteit van 2u-globuline in epitheelcellen van proximale tubuli, wat een duidelijke dosisafhankelijkheid aantoont (Fig. 2E-H) (Tabel 5).

Bij necropsie vertoonde één mannelijke rat in de groep van 250 mg/kg een ernstige vergroting van de rechter nier als gevolg van een histologisch karakteristiek nefroblastoom. Hoewel nefroblastoom bij de meeste rattenstammen ongebruikelijk is9, werd dit geval als incidenteel beschouwd, aangezien geen enkel ander dier vergelijkbare laesies vertoonde. Bovendien zou in orale carcinogeniciteitsonderzoeken de incidentie van spontaan nefroblastoom bij mannelijke F344/DuCrlCrlj-ratten naar verluidt variëren van 0–2,0%10. Hoewel verschillende laesies sporadisch in andere organen werden gedetecteerd, waren er geen significante behandelingsafhankelijke veranderingen in de incidentie van deze laesies zichtbaar.

Discussie

Tot nu toe zijn 24 smaakstoffen, waaronder 2-(1-menthoxy)ethanol, door JECFA beoordeeld als stoffen die structureel verwant zijn aan menthol, en ze worden allemaal vermeld als "geen veiligheidsrisico" op de huidige geschatte niveaus. van inname1, 11. 2-(1-Menthoxy)ethanol wordt geclassificeerd in een subgroep van alicyclische alcoholen of ethers en wordt beschouwd als primair geconjugeerd met glucuronzuur, gevolgd door uitscheiding via de urine1. Hoewel de orale LD50-waarden van deze stoffen bij knaagdieren relatief hoog zijn, blijven de gegevens uit toxiciteitsonderzoeken bij herhaalde dosering beperkt. Uit een toxiciteitsonderzoek met herhaalde doses van 13-weken is gebleken dat menthylpyrrolidoncarboxylaat (CAS-nr. 68127-22-0), een verbinding die structureel verwant is aan menthol, in verband kan worden gebracht met een verhoogd relatief lever- en niergewicht bij mannen en vrouwen. Wistar-ratten. Accumulatie van 2u-globuline in de proximale tubuli van mannelijke ratten werd ook waargenomen bij een dosis van 1.111 mg/kg lichaamsgewicht/dag, en de NOAEL werd bepaald op 109 mg/kg lichaamsgewicht/dag1.

In het huidige 13-weekse onderzoek naar de subchronische toxiciteit van 2-(1-menthoxy)ethanol werden geen toxicologische veranderingen in de algemene toestand, het lichaamsgewicht en de voedselinname waargenomen. Na hematologische beoordeling observeerden we een afname in HGB (96,6% ten opzichte van de gemiddelde controlewaarden), HCT (96,3%), MCV (98,4%) en MCH (98,2%) en een toename in PLT (111%) bij mannen. 250 mg/kg-groep, die werden beschouwd als toxicologische invloeden van de behandeling met 2-(1-menthoxy)ethanol. Zowel het absolute (115% bij beide geslachten) als het relatieve (119% bij mannen en 111% bij vrouwen) levergewicht was bij beide geslachten significant verhoogd in de 250 mg/kg-groepen. Hoewel er geen histopathologische veranderingen in de lever waren, waren er wel verhoogde waarden van serum T-Chol (110% bij mannen en 121% bij vrouwen) en TP (105% bij mannen) en een verlaging van TG (60,1% bij vrouwen) in de 250 gevallen. mg/kg-groepen duiden op toxische veranderingen die verband houden met het lipidenmetabolisme en de eiwitsynthese in de lever. Verlaagde HGB en MCH en verhoogde PLT, T-Chol en TP bij mannen en verlaagde TG en toegenomen absolute en relatieve levergewichten bij beide geslachten werden ook gedetecteerd, met statistische significantie in het 28-daagse voorbereidende onderzoek (gegevens niet getoond ), wat bevestigt dat deze gewijzigde hematologische en serumbiochemische parameters, evenals het levergewicht, geen incidentele effecten waren, maar verband hielden met de teststof. Daarentegen ging de significante toename van het relatieve levergewicht gedetecteerd bij de mannelijke 60 mg/kg-groep in het huidige onderzoek niet gepaard met een toename van het absolute gewicht of veranderingen in gerelateerde biochemische parameters, wat erop wijst dat deze toename een adaptieve verandering was.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Er werd aangenomen dat een significant verhoogd absoluut (120%) en relatief (118%) gewicht van de bijnieren in de mannelijke groep van 250 mg/kg verband hield met de teststof. Bovendien vertoonde het toegenomen absolute en relatieve gewicht van de bijnieren bij beide geslachten een duidelijke dosisafhankelijkheid in het 28-daagse voorlopige onderzoek (gegevens niet getoond), wat wijst op een verband met de behandeling met de teststof. Hoewel bijnierhypertrofie het gevolg zou kunnen zijn van stress, waren er zowel in de huidige als in de voorlopige onderzoeken geen bevindingen die op stress wezen, zoals een verminderde toename van het lichaamsgewicht of atrofie van de thymus en andere lymfoïde organen. Aangezien er mogelijk geen histopathologische veranderingen in de bijnier optreden, zelfs niet bij verminderde productie van glucocorticoïden in gevallen van remming van steroïdogenese-gerelateerde enzymen12, kan de mogelijkheid dat het toegenomen gewicht van de bijnier een toxische bevinding is, niet worden uitgesloten. Daarentegen werden de toegenomen relatieve gewichten van de milt en testikels bij de mannelijke groep van 250 mg/kg, die niet werden waargenomen in het vooronderzoek, als toxicologisch insignificant beschouwd vanwege de afwezigheid van histopathologische laesies of significant verhoogde absolute gewichten. Op vergelijkbare wijze onthulde de serumbiochemie een afname van A/G en een toename van Ca bij beide geslachten, waarvan werd aangenomen dat deze geen toxicologische betekenis had, aangezien er geen afwijkingen werden gedetecteerd in gerelateerde parameters. Bovendien waren verlaagde Bil- en ALP-niveaus bij beide geslachten en verlaagde AST en ALT bij vrouwen in contrast met de verwachte toxische effecten en werden deze als niet betekenisvol beschouwd.

Chronische nefropathie gekenmerkt door basofiele tubuli, hyaliene cast en focale interstitiële ontsteking werd met statistische significantie waargenomen bij mannen van alle behandelde groepen. Bovendien werden een verhoogde serum Cre en een absoluut en relatief niergewicht waargenomen in de mannelijke groepen van 60 en 250 mg/kg; deze veranderingen werden niet waargenomen in vrouwelijke behandelingsgroepen. In deze gevallen was de mate van accumulatie van eosinofiele korrels in proximale tubulaire epitheelcellen op een schijnbaar dosisafhankelijke manier verhoogd. Deze korrels werden door immunohistochemie bevestigd als 2u-globuline, wat wijst op het optreden van 2u-globuline-nefropathie. 2u-Globulinen gebonden aan bepaalde chemicaliën, zoals d-limoneen, hopen zich op in lysosomen en worden in de proximale tubuli waargenomen als eosinofiele of hyaliene korrels9. Deze ophoping kan epitheelcellen beschadigen, wat leidt tot chronische progressieve nefropathie en daaruit voortvloeiende tumorvorming9. Dus hoewel de NOAEL voor 2-(1-menthoxy)ethanol geassocieerd met 2u-globuline-nefropathie in de nieren van mannelijke ratten niet werd geïdentificeerd, is dit type nefropathie naar verluidt specifiek voor mannelijke ratten en dus niet relevant voor menselijke ratten. risicobeoordeling13. Een verhoogd risico op nierfalen, gemedieerd via mechanismen die verband houden met de accumulatie van 2u-globuline, is zeer onwaarschijnlijk, aangezien dit eiwit bij mensen afwezig is14. Daarom werd het redelijk geacht om de veranderingen die verband houden met chronische nefropathie die bij mannen zijn waargenomen, uit te sluiten van de bepaling van de NOAEL.

Concluderend heeft het huidige subchronische toxiciteitsonderzoek van 13-weken aangetoond dat behandeling met 250 mg/kg lichaamsgewicht/dag 2-(1-menthoxy)ethanol toxische veranderingen veroorzaakte in de hematologie, de serumbiochemie en het gewicht van de organen. bij mannelijke en vrouwelijke F344-ratten. Gebaseerd op de waargenomen resultaten, de NOAEL van 2-(1-menthoxy)ethanolwerd voor beide geslachten geëvalueerd als 60 mg/kg lichaamsgewicht/dag.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%