Een nieuwe strategie voor het screenen van actieve componenten in Cistanche Tubulosa op basis van spectrum-effectrelatieanalyse en netwerkfarmacologie Ⅱ

3. Resultaten en discussie

3.1. HPLC-vingerafdrukken

3.1.1. Methode validatie

De validatie voor de HPLC-methode toonde aan dat de relatieve standaarddeviatie (RSD) voor methodeprecisie, reproduceerbaarheid en stabiliteit minder dan 2,85 procent was voor het relatieve piekgebied (n = 11) en 0.77 procent voor de relatieve retentietijd (n = 11). De precisie van dezelfde voorbeeldoplossing verscheen binnen het bereik van 0.05–{{10}}.77 procent voor relatieve tijd en 0.28– 2,70 procent voor het relatieve oppervlak van de gemeenschappelijke pieken. De reproduceerbaarheid van het experiment lag binnen het bereik van 0.03–0.20 procent voor de relatieve tijd en 0,23–2,59 procent voor het relatieve oppervlak van de gemeenschappelijke pieken. De monsterstabiliteit was 0,09-0,24 procent voor de relatieve retentietijd en 0,75-2,85 procent voor het relatieve oppervlak van de gemeenschappelijke pieken. Deze resultaten gaven aan dat aan de vastgestelde vingerafdruk werd voldaan. De lineaire relaties voor geniposidinezuur,echinacoside, acteoside, tubuloside A, Enisoacteosideworden weergegeven in tabel S4. De waarde van R kwadraat was 1.0000, wat wijst op een goede lineariteit. De resultaten van monsterterugwinning toonden aan dat de gemiddelde terugwinning van geniposidinezuur, echinacoside,acteoside, tubuloside A, Enisoacteosidewaren 100,37 procent, 103,59 procent, 98,46 procent, 100,81 procent en 101,19 procent, en de RSD voor monsterterugwinning was minder dan 2,68 procent.

Klik hier voor meer informatie over Cistanche Active Components

3.1.2. Piekgebied (PA) en relatieve retentietijd (RRT)

De referentievingerafdrukken en vingerafdrukken van HM's, WE's en HR's van 11 batches van C. tubulosa worden weergegeven in Figuur 2. Elf pieken, die een goede scheiding en resolutie vertoonden, werden geïdentificeerd als gemeenschappelijke pieken onder HM's, WE's en HR's. De vijf standaardverbindingen werden geïdentificeerd als geniposidinezuur (A2),echinacoside(A8),acteoside (A9), tubulosideA (A10), enisoacteoside(A11). De standaard samenstelling,echinacoside, die aanwezig was in alle chromatogrammen (gemiddelde retentietijd 12.86 min) met een geschikt piekoppervlak en goede stabiliteit, werd geselecteerd als de referentiepiek en gebruikt om de relatieve retentietijden (RRT's) van de andere tien te berekenen gemeenschappelijke pieken. De RRT's van deze verschillende vormen liggen tussen 0.16–1,51. De PA en variantiecoëfficiënt (CV-percentage) van deze gemeenschappelijke pieken staan ​​vermeld in de tabellen S5-S7. Uit de gegevens zijn de CV-percentagewaarden voor PA in verschillende vormen 25,78 procent -142,02 procent, 23,36 procent -150,38 procent en 28,91 procent -112,78 procent voor respectievelijk HM's, WE's en HR's. Deze resultaten onthullen significante verschillen in de concentratie van elkCistanche tubulosaverbinding tussen de verschillende vormen. De vingerafdrukken van HM's, WE's en HR's worden weergegeven in figuur 3.

Figuur 2 HPLC-vingerafdrukken van standaardmonsters

3.1.3. Inhoud van HM's, WE's en HR's

Vijf standaardbestanddelen vanC. tubulosawaren gemeten. De inhoud van de belangrijkste componenten wordt weergegeven in tabel 1. De vergelijking tussen HM's, WE's en HR's wordt weergegeven in tabel 2 en figuur 4. PhG's in C. tubulosa zijn biologisch actief maar warmtegevoelig. Warmtegevoelige componenten die in water oplossen, kunnen met een redelijke methode efficiënt worden geëxtraheerd. Over het algemeen wordt Cistanche herba geëxtraheerd met water en vervolgens ingedampt tot een geconcentreerde oplossing voor de volgende chemische analyse [26, 27, 30]. Na extractie en concentratie werd sproeidroogtechnologie gebruikt en werd de procedure gewijzigd ten opzichte van het vorige artikel. Water werd snel uit de vloeibare stoom verwijderd en vervolgens werden droge extracten van grondstoffen uit planten verkregen. In deze stap wordt het toevoegen van maltodextrine beschouwd als een gebruikelijke drager om de dispersie te verbeteren en de bewaartijd te verlengen. Door middel van een reeks productieprocessen werden kruidenplanten vervolgens geperst tot formulekorrels met additieven. Deze stap van het toevoegen van hulpstoffen was niet opgenomen in het experiment. Over het algemeen omvat ons productieproces extractie, concentratie en sproeidrogen, zoals beschreven in paragraaf 2.2, parallel aan een productieproces voor formulekorrels. Om deze halffabrikaten te produceren, moeten de bovenstaande drie stappen worden gevolgd. De procedure voor het vormen van WE's omvat concentratie en sproeidrogen, die gemakkelijk het verlies van warmtegevoelige componenten veroorzaken, maar HR's worden verkregen na extractie en drogen van HM's. We vragen ons af of het mogelijk is dat actieve componenten in HR's blijven. Volgens onze resultaten daalde het gehalte aan verbascoside aanzienlijk van HM's naar WE's en HR's (respectievelijk en ). De thermische stabiliteit van verbascoside wordt onderzocht door tijdens het verhittingsproces de veranderingen in het piekgebied via HPLC te volgen. Na 4 uur verhitten blijft 41,6 procent verbascoside over. Het geeft aan dat verbascoside warmtegevoelig is [31]. Isoacteoside, tubuloside A en echinacoside in WE's bleven stabiel na complexe verwerkingsprocedures. Tijdens het langdurige droogproces vertoonde de accumulatie van PhG's een significante afname, wat kan worden toegeschreven aan de thermische degradatie van deze warmtegevoelige componenten [32]. Wat de andere doelcomponenten betreft, verschilden HR's en WE's niet significant, behalve voor verbascoside. Ons begrip van dit verschil stelt ons in staat om in de toekomst betere kwaliteitsnormen voor kruidenresten te ontwikkelen en deze in producten te verwerken.

Tabel 1 Inhoud van 11 partijen C. tubulosa

Tabel 2 Vergelijking van de inhoud van de hoofdcomponenten (n = 11).

,

Figuur 4 Inhoudsbepaling van vijf componenten uit verschillende vormen (n = 11). , ns: niet significant.

3.1.4. Vingerafdrukovereenkomstanalyse

De overeenkomsten tussen de drie C. tubulosa-groepen werden geëvalueerd. De gelijkeniswaarden van kruidenmateriaal-waterextract, kruidenmateriaal-kruidenresidu en waterextract-kruidenresidu-overeenkomsten lagen in het bereik 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 en 0.938–1.000, respectievelijk (Tabel 3).

Tabel 3 Overeenkomsten van HM-WE, HM-HR en WE-HR voor 11 partijen C. tubulosa.

3.2. Testresultaten antioxidantactiviteit

De antioxidantactiviteiten van de verschillende vormen van C. tubulosa werden bepaald met behulp van de DPPH-, scavenging- en scavenging-capaciteitstesten, en de relevante resultaten worden weergegeven in figuur 5. In tabel S8 waren de bereiken voor de DPPH- en scavenging-capaciteitsassayresultaten { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 en 0,32–27,65 mg/ml voor de drie verschillende vormen van de 11 batches van C. tubulosa. In drie antioxiderende activiteitstests vertoonden HM's en WE's een sterke remmingsactiviteit, terwijl HR's de zwakste remming vertoonden.

De gesproeidroogde WE's bleken zelfs bij lage concentraties significante activiteiten te vertonen. Een eerder rapport gaf aan dat een gesproeidroogde Vernonia amygdalina WE een remming van 50 procent opruiming bereikte bij 0,17 mg/ml [33]. De toepassing van lange extractietijden en hoge temperaturen is een tweesnijdend zwaard. Enerzijds verbetert het verhogen van de extractietijd en de sproeidrooginlaattemperatuur het rendement en de efficiëntie. Bovendien bereiken de extracten een sterke antioxiderende werking en hogere concentraties biologische componenten dan die planten [34]. Aan de andere kant degradeert extreem hete inlaatlucht de bioactieve stoffen. Dergelijke verhoogde luchtinlaattemperaturen leidden tot verlies van antioxidant Bidens pilosa-extractactiviteit en werden toegeschreven aan afname van fenolische verbindingen [35]. De huidige resultaten komen overeen met het bovengenoemde rapport. De WE in S6 vertoonde bijvoorbeeld zwakkere radicale remmende vermogens dan zowel HM als HR. Bovendien vertoonde HR in S5 sterkere DPPH- en superoxide-anionopruimingscapaciteiten dan HM en WE. De structuur van PhG's bestaat uit glycosidische bindingen en acetylgroepen die gemakkelijk worden gehydrolyseerd onder enzymatische werking of worden afgebroken bij hoge temperaturen. Deze reacties kunnen verantwoordelijk zijn voor afnames in sommige hoofdcomponenten tijdens grootschalige productie. De hydrolyse of isomerisatie van bepaalde componenten kan echter de synthese van andere componenten versnellen. Dergelijke transformaties komen vaak voor bij het verwerken van Cistanches-kruiden [36-38]. Omdat PhG's in water oplosbaar zijn, betekent dit dat de meeste biologische componenten kunnen worden gebruikt via waterextractie. De bewering dat het merendeel van de actieve componenten in WE's achterblijft, bestaat al tientallen jaren, dus het lijkt redelijk om aan te nemen dat de natte reststoffen na extractie kunnen worden weggegooid. Het is echter onjuist HR's van C. tubulosa als afval te beschouwen. Onderzoekers wijzen erop dat PhG's onstabiel zijn en vatbaar zijn voor enzymatische of hydrolytische afbraak [39]. Hydrolyse- of isomerisatiereacties die bijdragen aan afname van biologische ingrediënten in fytomedicijnen tijdens de verwerking, kunnen tegelijkertijd nieuwe kansen bieden voor het benutten van HR's. Door traditionele extractiemethoden om te zetten, kunnen medicijnresten beter worden ontwikkeld en benut. Enzymatische hydrolyse werd uitgevoerd om het Panax-ginsengresidu om te zetten in monosuikers. Opbrengsten van polysacchariden en ginsenosiden namen toe, zoals suiker, barnsteenzuur, ginseng-polysacchariden en ginsenosiden [40]. Sophora flavescens-residuen worden opnieuw geëxtraheerd door ultrasone golven met ethylacetaat [41]. De bijgewerkte technologieën voor het gebruik van kruidenresiduen zijn samengevat door Huang et al. [42].

Op basis van de PLSR- en BCA-resultaten werden de top vijf pieken van verschillende vormen gescreend met behulp van de DPPH-, superoxide-anion- en hydroxylradicaal-afvangtesten om de belangrijkste pieken te identificeren. De resultaten worden geïllustreerd in de Venn-grafiek (Figuur 7). A2, A6, A8 en A10 zijn de gemeenschappelijke pieken die worden gedeeld door HM, WE en HR (figuren 7(a) en 7(c)) in de superoxide-anion- en hydroxylradicaal-wegvangende assays, terwijl HM, WE en HR deelt geen pieken in de DPPH-assay. Ondertussen laten de BCA-modellen zien dat A1, A2, A3 en A6 de gemeenschappelijke pieken zijn die worden gedeeld door HM, WE en HR (figuren 7(d)–7(f)). Met name de overlappingen in het Venn-diagram geven aan dat het BCA-model geschikter lijkt dan het PLSR-model, waarbij het eerste meer herhaling vertoont. De BCA-modelcoëfficiënten en IC50-waarden voor het antioxidantvermogen werden geanalyseerd via RDA. Zoals de RDA weergegeven in figuur 8, zijn A1, A3 en A6 van HM en HR positief gerelateerd aan de antioxidantindexen, behalve dat A3 negatief gerelateerd is aan het vermogen om hydroxylradicaal op te vangen. A1 en A6 van WE hebben sterke correlaties met DPPH en het superoxide-anion. De A6-pieken die uit de verschillende vormen worden opgemerkt, vertonen de sterkste verbinding met de DPPH-, superoxide-anion- en hydroxylradicalen. A1 en A3 vertonen ook een soortgelijke verbinding.

Figuur 7

Venn-diagrammen van PLSR- en BCA-model: (a) DPPH-assay. (b) spoeltest. (c) scavenging assay werd geanalyseerd door het PLSR-model. (d) DPPH-test. (e) spoeltest. (f) scavenging assay werd geanalyseerd door het BCA-model. Het overlappende gedeelte was de gemeenschappelijke piekscherf door HM, WE en HR.

3.4. Op netwerkfarmacologie gebaseerde analyse

3.4.1. Constructie van CT-netwerk

Uit de GeneCards-database en de OMIM-database werden in totaal 4359 targets met betrekking tot de antioxidantactiviteit verkregen. Tegelijkertijd werden actieve componenten gescreend uit de TCMSP-database en de SwissTargetPrediction-database. Vervolgens werden 198 doelen verzameld en gestandaardiseerd via de UniPort-database. Er waren 159 doelwitgenen die werden gedeeld door actieve componenten en aan antioxidanten gerelateerde ziekten (zie figuur S1). Het CT-netwerk werd geconstrueerd om de correlatie tussen de verbindingen en de belangrijkste gendoelen te illustreren (Figuur 9).

Figuur 9 CT-netwerk. Het netwerk toonde de correlatie tussen actieve componenten en de belangrijkste gendoelen.

3.4.2. Opbouw van het PPI-netwerk en screening van de belangrijkste doelen

PPI werd gevisualiseerd met behulp van de STRING-database (Figuur 10). Het netwerk omvatte 159 knooppunten en 2528 randen. In het gehele interactienetwerk kunnen de verbindende componenten of de knooppunten met meer doelwitten de belangrijkste component of het doelwitgen zijn dat een antioxiderende rol speelt in C. tubulosa. De resultaten werden gedownload en geïntroduceerd in Cytoscape voor visualisatie. Hoe hoger de DC-waarde, hoe donkerder de kleur en hoe groter de gecombineerde scorewaarde, hoe dikker de rand. We ontdekten dat RAC-alfa-serine/threonine-proteïnekinase (AKT1), interlukin -6 (IL6), tumornecrosefactor (TNF) en vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) centraal waren gelokaliseerd (Figuur 11). wat aangeeft dat ze belangrijke doelwitten waren wanneer actieve componenten een antioxiderende werking uitoefenden. Er is gemeld dat echinacoside de mitochondriale disfunctie vermindert via regulatie van mitogeen-geactiveerde proteïnekinasen (MAPK) en AKT en hun gefosforyleerde vormen [43]. Onderzoekers speculeerden dat het antidiabetische effect van glycosiden van C. tubulosa mogelijk te wijten is aan de antioxiderende activiteit van PhG's door pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6 en TNF- omlaag te reguleren [44]. Bovendien zou echinacoside de groei van eierstokkankercellen kunnen belemmeren door de expressie van VEGFA naar beneden te reguleren om angiogenese te remmen [45], wat nauw verband houdt met het ROS-systeem omdat ROS de expressie van VEGF-signalering induceert [46].

Figuur 10 PPI-netwerk.

3.4.3. Verrijkingsanalyse en oprichting van CTP-netwerken

De potentiële antioxidanten werkten in op tal van biologische functies, waaronder BP, CC en MF. In figuur 12(a) worden de top 10 trajecten getoond. De voorspelde doelen van het PPI-netwerk reageerden voornamelijk op veel biologische processen, zoals organische cyclische verbindingen, xenobiotische prikkels, anorganische stoffen, zuurstofniveaus en positieve regulatie van de beweging van de cellulaire component. De analyse van de cellulaire componenten toonde aan dat de genen voornamelijk verband hielden met het membraanvlot, de extracellulaire matrix, het lumen van de secretoire granule, het transcriptieregulatorcomplex en het apicale deel van de cel. Deze doelen zijn ook betrokken bij veel moleculaire functies, waaronder DNA-bindende transcriptiefactorbinding, eiwithomodimerisatieactiviteit, eiwitdomeinspecifieke binding en cytokinereceptorbinding.

Figuur 12 Verrijkingsanalyse: (a) GO-verrijkingsanalyse. (b) KEGG-verrijkingsanalyse.

Om de biologische functies van deze belangrijke knooppunten te onderzoeken, werd een padverrijkingsanalyse uitgevoerd. Van KEGG-verrijkingsresultaten werd een bellendiagram getekend om de top 20-paden weer te geven. Hoe groter de plek was, hoe meer genen er in het pad waren opgenomen. Zoals weergegeven in figuur 12 (b), waren de belangrijkste routes van C. tubulosa gerelateerd aan routes bij kanker, lipiden en atherosclerose, AGE-RAGE-signaalroute bij diabetische complicaties, chemische carcinogenese-receptoractivering en MAPK-signaalroute. Effecten van C. tubulosa op apoptose en cellulaire redoxhomeostase werden onderzocht. De gegevens suggereren dat C. tubulosa een veelbelovende kandidaat kan zijn voor therapie tegen darmkanker [47]. C. deserticola-extract wordt gevonden bij bejaarde mensen [48].

Figuur 13 illustreert de correlatie tussen de routes en hun gerelateerde doelen en de relatie tussen de overlappende doelgenen en biologisch actieve componenten van C. tubulosa. Er werd een globaal beeld van het CTP-netwerk gegenereerd, dat bestond uit 12 ingrediënten, 159 doelen en 20 trajecten. De meeste doelwitten werden gedeeld door de kandidaat-actieve stoffen. Deze kandidaat-actieve ingrediënten met hoge mate van onderlinge verbinding waren verantwoordelijk voor de hoge mate van onderlinge verbondenheid van het CTP-netwerk, met name quercetine (graad = 131). De meerderheid van de doelwitten, zoals AKT1, IL6, TNF en VEGFA, werden toegewezen aan KEGG-routes die geassocieerd zijn met routes bij kanker.

Figuur 13 CTP-netwerk.

4. Conclusies

In deze studie hebben we voornamelijk complexe situaties onderzocht bij het beschouwen van de spectrum-effectrelaties tussen HM, WE en HR vanC. tubulosa. De HPLC-vingerafdrukken enantioxidant testenwerden gebruikt om de verschillen tussen H's, WE's en HR's van te identificerenC. tubulosa. Volgens de HPLC-vingerafdrukken waren 11 pieken gebruikelijk bij de 11 batches van H's, WE's en HR's. Geniposidinezuur,echinacoside, verbascoside, tubuloside A, Enisoacteosidewerden geïdentificeerd onder deze pieken. De inhoud van deze vijf componenten werd bepaald. Bovendien zijn de antioxiderende effecten van deC. tubulosaHs, WE's en HR's varieerden als gevolg van de veranderingen in de chemische samenstellingen veroorzaakt door complexe productieomstandigheden. Op basis van gediversifieerde statistische modellen gaf de studie naar de relatie tussen spectrum en effect aan dat piek A6 mogelijk de meest beslissende component is van de drie vormen vanC. tubulosa. De studie was gebaseerd op netwerkfarmacologie om mogelijke mechanismen hiervan te onderzoekenC. tubulosaopantioxidatiedoor screening van verbindingen, voorspelling van belangrijke doelen, constructie van netwerken en uitvoering van verrijkingsanalyse. Onze resultaten bieden een theoretische basis voor het recyclen van de kruidenresten en het potentieel vanC. tubulosabij de behandeling vanaan antioxidanten gerelateerde ziekten.