Een pilotstudie van urineproteomics bij COVID-geassocieerd acuut nierletsel

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Een pilotstudie van urineproteomics bij COVID-19-geassocieerd acuut nierletsel

trefwoorden:Urine, Covid-19-19, Acuut nierletsel,COVID

INVOERING

acuutnierblessureis een belangrijke complicatie geassocieerd metCovid-19-19en komt voor bij maximaal 76 procent van de patiënten op de intensive care.1,2 Het sterftecijfer van patiënten metCovid-19-19wie heeft ontwikkeldAcuut nierletsel (COVID-acuutnierblessure) is >10 keer hoger dan degenen die dat niet deden. Hoewel kandidaatAcuut nierletselmarkers bestaan, de etiologie vanCOVID-Acuut nierletselis multifactorieel en vereist agnostische benaderingen voor de identificatie van analyten vroeg in het ziekenhuis om inzicht te krijgen in biomarkers en mechanismen die verband houden metCOVID-Acuut nierletselenCovid-19-19infectie. Onderzoek naarCovid-19-19– geassocieerde effecten op het urinaire proteoom zijn beperkt en nierfunctiestoornissen zijn niet gemeld.3 Ongeveer 70 procent van de eiwitten die in deurineworden geproduceerd in de nieren, waarbij een aanzienlijke hoeveelheid uit het bloed wordt gefilterd. We veronderstellen dat de veranderingen in eiwit-abundanties in deurinezou kunnen leiden tot de ontdekking van eiwitmarkers die geassocieerd zijn metCovid-19-19ofCOVID-acuutnierblessureen mechanistische inzichten verschaffen om het begrip te verbeteren.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

We hebben geanalyseerdurinesamples van 14 deelnemers (6COVID-acuutnierblessure, 3 COVID-neeacuutnierblessure, en 5 neeCOVID-neeacuutnierblessure) (Aanvullende materialen en methoden, aanvullende figuur 1A en aanvullende tabel S1). Om rekening te houden met de grote variatie in eiwitgehalte overurinemonsters, gebruikten we een bicinchoninezuur om de peptideconcentratie te meten na eiwitdigestie (aanvullende materialen en methoden). Alle peptidemonsters worden vervolgens vóór de analyse genormaliseerd naar dezelfde concentratie om relatieve kwantificering van verschillen in het urineproteoom mogelijk te maken (aanvullende materialen en methoden).

Cistanche-COVID-19

Cistanchekan worden gebruikt voor deCovid-19-19-geassocieerdacuutnierblessure.

DeUrineProteoom van COVID-acuutnierblessure

Na bevestiging van de kwaliteit van:urinevoor het ontdekken van analyten (aanvullende materialen en methoden, aanvullende tabel S2 en aanvullende figuur S1), evalueerden we of onderliggende variantie onderscheid kon maken tussenacuutnierblessurepositief (acuutnierblessure) (6 COVID-acuutnierblessure) van andere monsters zonderacuutnierblessure(8 acuutnierblessurenegatief); allemaalacuutnierblessuremonsters waren van patiënten metCovid-19-19. De eerste 2 hoofdcomponenten waren verantwoordelijk voor 42,1 procent van de variantie en scheidden de 2 groepen duidelijk van elkaar (Figuur 1b), wat duidt op een prominente impact dooracuutnierblessureop deurineproteoom van patiënten metCovid-19-19. Er was een statistisch significante toename van 97 eiwitten en een afname van 140 eiwitten in deacuutnierblessuregroep (pas P < 0.05;="" figuur="" 1c="" en="" aanvullend="" figuur="" s2a="" aan).="" hiërarchische="" clustering="" en="" analyse="" van="" routeverrijking="" onthulden="" dat="" de="" bovenste="" omhoog="" gereguleerde="" routes="" complementactivering,="" stollingscascades="" en="" gereguleerde="" exocytose="" waren="" (figuur="" 1d="" en="">

Specifiek waren complementcomponenten C2, C3, C5, C6 en C8G significant verhoogd in deacuutnierblessuregroep die de complementinitiatie beïnvloedt (Figuur 1d). Met name de vervalversnellende factor CD55 nam 25- keer af in deacuutnierblessuregroep. Dit suggereert een verminderd vermogen om complementactivering te reguleren, waardoor de verwonding verergert. Deze bevinding wordt ondersteund door verergering vanacuutnierblessurebij muizen met deletie van CD55 na ischemie-reperfusieschade.4 Activering van het complementsysteem gaat gepaard met ernstigeCovid-19-19. Het nierceleiwit sC5b-9, vaak geassocieerd met respiratoire insufficiëntie, wordt opwaarts gereguleerd in het plasma bij patiënten metCovid-19-19met matig tot ernstig nierletsel. Vergelijking vanCOVID-19 voorbeelden met en zonderacuutnierblessureonthulde ook verrijking van eiwitten geassocieerd met de complementroute (aanvullende materialen en methoden, aanvullende tabel S2-kolommen X-Z). De mogelijkheid dat immunoglobulinecomplexen (die in hogere concentraties worden aangetroffen bij personen met ernstigeCovid-19-19) mogelijk deze aanvulling op het nefron rekruteert, zou het mechanisme kunnen verklaren voor:acuutnierblessureen ernstig falen waarvoor dialyse nodig is. Detectie van verschillende componenten van de complementroutes in deurinevan patiënten metCOVID-acuutnierblessureis nieuw. Het zou kunnen dienen als een benchmark om te vergelijken hoe de pathogeniteit van SARS-CoV-2 evolueert tijdens verschillende golven vanCovid-19-19en maakt de weg vrij voor vergelijkende evaluatie met niet–COVID-acuutnierblessurein de toekomst. Dus,urineis een gemakkelijk toegankelijk biospecimen om de toestand van het complementsysteem bij patiënten metCovid-19-19.

Bovendien waren de stollingsfactoren F9, F10, F13b, fibrinogeen-bètaketen en fibrinogeen-gammaketen significant verhoogd in deacuutnierblessuregroep (Figuur 1d). Verschillende markers van gereguleerde exocytose, waaronder myeloperoxidase, catalase, lysozym, leukotrieen A4-hydrolase, proteïnase 3 en matrix metallopeptidase 9, waren ook verhoogd in deze groep (Figuur 1d). De van boven naar beneden gereguleerde routes omvatten extracellulaire matrixorganisatie en heterofiele cel-celadhesie (Figuur 1e), wat wijst op tubulaire schade.

Daarnaast hebben we ontdekt dat verschillende bekende biomarkers in de urine vanacuutnierblessure, inclusief NGAL; FABP3, FABP4; MEP1A; en RBP4, verhoogd in deurinevan de patiënten metCOVID-acuutnierblessure(Figuur 1d en aanvullende tabel S2). Desalniettemin onthulde proteoomanalyse een significante afname van UMOD en EGF in deze groep. Urine UMOD en EGF bleken omgekeerd gecorreleerd te zijn met:acuutnierblessureen hun afname hangt sterk samen metacuutnierblessureseverity. These results further validate our proteome approach and are indicative of tubular injury affecting secretion (NGAL, UMOD, EGF) or defective absorption by proximal tubules (FABP3, FABP4). A novel observation was a >30-voudige toename van IGFBP6 bij patiënten metCOVID-acuutnierblessure. Er is relatief weinig bekend over IGFBP6 inacuutnierblessure, maar er is eerder gevonden dat het correleert met een verminderde nierfunctie en nierfalen.5 Aanvullende onderzoeken met grotere cohorten vanurinemonsters over verschillende omstandigheden zijn nodig om veranderingen in deze biomarkers te bevestigen en om te vergelijken met andere oorzaken vanacuutnierblessure, covariaten en uitkomsten.

Cistanche-kidney disease symptoms

DeUrineProteoom geassocieerd metCovid-19-19in de afwezigheid vanacuutnierblessure

Omdatacuutnierblessureleidt tot significante veranderingen in de abundanties van veel urine-eiwitten, is het moeilijk om de veranderingen te identificeren die alleen verband houden metCovid-19-19. Daarom vergeleken we deurineproteomen vanCovid-19-19positief (n ¼ 3) en negatief (COVID) (n ¼ 5) patiënten zonderacuutnierblessure(Aanvullende figuur S2B). De abundanties van 57 eiwitten namen significant toe en 19 eiwitten waren significant verlaagd in deurinevanCovid-19-19 patients (adjust P < 0.05, Figure 2a and Supplementary Table S2). Furthermore, a large percentage of the proteins with significantly increased levels were immunoglobulins (49.1%). The remaining proteins with increased expression were involved in the antigen presentation pathway. Proteins with significantly decreased expression were enriched in the regulated exocytosis pathway (Figure 2b). Specifically, the average abundances of major MHC-I proteins HLA-A and HLA-C increased >3.6-vouw de inurineals gevolg vanCovid-19-19. Het MHC-complex presenteert antigenen op het celoppervlak aan immuuncellen wanneer cellen worden geïnfecteerd door virussen. MHC-peptidecomplexen zijn gedetecteerd in verschillende menselijke lichaamsvloeistoffen, waaronder het serum enurine.6 De neerwaartse regulatie van exocytose werd gekenmerkt door de significant verminderde abundanties van DEFA1, GRN, HSPA6, SDCBP, IQGAP1 en CYRIB (Figuur 2c).

Verder waren er 4 eiwitten met significant verhoogde abundanties in deCOVIDgroep vergeleken met deCOVIDgroep, inclusief MB, CA1, MANSC1 en ABRACL (Figuur 2c en aanvullende tabel S2-kolommen AA-AC). Bovendien waren 5 eiwitten significant verlaagd inCOVID, inclusief GRN, CREB3L3, MUC1, CD320 en DLST (Figuur 2c en aanvullende tabel S2-kolommen AA-AC). Deze nieuw geïdentificeerde eiwitten kunnen mogelijk worden gebruikt als gevoeligere biomarkers om deCovid-19-19infectie. Bovendien laten de gegevens zien dat verschillende markers extrarenaal inCOVIDpatiënten (Figuur 2), waaronder de 568-voudige toename van myoglobine (hartspecifiek) en 392-voudige toename van zymogeen pepsinogeen C (long-, slokdarm- en maagletsel), die veelbelovende doelen voor niet-invasieveurineproteoomprofilering om nieronafhankelijke orgaanschade op te sporen en te volgen.

Het SARS-CoV-2-virion wordt doorgaans niet in deurine, maar het heeft tropisme tot nierceltypes.7-9 We evalueerden of:urineproteomics kunnen SARS-CoV-2-eiwitten detecteren. Interessant is dat peptiden van SARS-CoV-2 nucleoproteïne werden gedetecteerd in deurinemonsters verzameld van 2 ernstig zieke patiënten metCOVID-acuutnierblessuredie stierven (aanvullende materialen en methoden, figuur 1a en aanvullende tabel S1). De peptide-identificatie werd bevestigd door te zoeken met zowel MaxQuant- als MS-GFþ-software. Bijna volledige sequentiedekking van het RNA-bindende domein werd bereikt door vloeistofchromatografie met één dimensie gekoppeld aan tandem-massaspectrometrie-analyse. Sequenties nabij het N-uiteinde van het SARS CoV -2 nucleoproteïne werden ook waargenomen (Figuur 2d). Vanwege de relatief lage aantallen peptide-spectrumovereenkomsten van SARS-CoV-2-peptiden die zijn waargenomen, wordt voorspeld dat de concentratie van SARS-CoV-2-nucleoproteïne laag is in dezeurinemonsters (aanvullende tabel S3).

figure 2-1

Hoewel onze studie een proof-of-concept-onderzoek is met een relatief klein aantal patiëntenmonsters, konden we methoden vaststellen voor hoogwaardigeurineproteomics van patiënten metCovid-19-19in een klinische setting. We rapporteren potentiële biomarkers vanCovid-19-19infectie enCOVID-acuutnierblessuredie nuttig kunnen zijn voor het detecteren en monitoren van de ontwikkeling vanCOVID-19infectie ofacuutnierblessure. In het bijzonder waren de complement- en stollingscascaderoutes en exocytoseroutes sterk opwaarts gereguleerd bij de patiënten metCOVID-acuutnierblessure. Bovendien waren eiwitten geassocieerd met antigeenpresentatie significant gecorreleerd metCOVID-19infectie. We stellen een lijst voor van potentiële nieuwe biomarker-eiwitten (dwz MB, CA1, MANSC1, ABRACL, GRN, CREB3L3, DEFA1, MUC1, DLST en IGFBP6) en van eerder gerapporteerdeacuutnierblessurebiomarker-eiwitten (dwz NGAL, FABP3, FABP4, MEP1A en RBP4) voor verdere validatie van hun specificiteit, gevoeligheid en ernst. Een subgroep van onze patiënten metCOVID-acuutnierblessureontwikkeldacuutnierblessureop een reeds bestaande chronische nierziekte, die ook deurineeiwitten die in deze groep verrijkt zijn gevonden. Het effect van de status van chronische nierziekte analyserenCovid-19-19zou grotere cohorten vereisen; we zien echter dat de verrijking van complement- en stollingsroute-eiwitten werd gevonden bij de patiënten metCOVID-acuutnierletsel met en zonder chronische nierziekte (Figuur 1d en aanvullende tabel S1). Al met al onthullen deze opwindende voorlopige resultaten duidelijk de noodzaak van verder onderzoek in een uitgebreid klinisch cohort dat patiënten omvat met niet-Covid-19-19-geassocieerdacuutnierblessure.

OPENBARING

CRP meldt lid te zijn van de adviesraad van en eigenaar te zijn van aandelen in Renalytix AI en te dienen als consultant voor Genfifit. AV-rapporten die dienen als adviseur voor NxStage Medical Inc. en Astute Medical Inc. Deze entiteiten hebben het onderzoek in dit onderzoek niet ondersteund. Alle andere auteurs verklaarden geen concurrerende belangen.

DANKBETUIGING

Deze studie maakte gebruik van monsters verkregen uit deCovid-19-19biorepository van de Washington University School of Medicine, die wordt ondersteund door: de Barnes Jewish Hospital Foundation; de Siteman Cancer Center-subsidie P30 CA091842 van het National Cancer Institute van de National Institutes of Health; en het Washington University Institute of Clinical and Translational Sciences verlenen UL1TR002345 van het National Center for Advancing Translational Sciences van de National Institutes of Health. We danken het George M. O'Brien Center van de Johns Hopkins University voor het uitvoeren van denierblessurebiomarker-assays (subsidie P30DK079310). Delen van dit onderzoek werden uitgevoerd met behulp van EMSL, een nationale wetenschappelijke gebruikersfaciliteit gesponsord door het Department of Energy's Office of Biological and Environmental Research en gevestigd bij PNNL. Het proteomics-werk wordt ondersteund door het NIH Common Fund, via het Office of Strategic Coordination / Office of the NIH Director onder award UG3HL145593, en de NIH verleent U01DK124020. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de mening van de National Institutes of Health. Wij danken het Kidney Translational Research Center (KTRC) van de afdeling Nefrologie van de Washington University in St. Louis voor de ondersteuning van de verwerking, bewaring en opslag vanurinemonsters. We zijn Charles Goss, Adriana Rauseo Acevedo en Rachel Presti dankbaar voor hun inspanningen op het gebied van gegevensbeheer en werving van patiënten. We bedanken ook Jana Chiang voor haar bijdragen bij het bewerken, opmaken en beoordelen van de inhoud.

cistanche-COVID-19–Associated Acute Kidney Injury

AANVULLEND MATERIAAL

Aanvullend bestand (PDF) Aanvullende materialen en methoden. Bevat informatie over de methoden die worden gebruikt voor het verkrijgen van monsters en het opnemen van patiënten,urineverwerking en opslag, proteomics-monstervoorbereiding, LC-MS/MS-gebaseerde proteomische analyse, proteomics-gegevensverwerking, correlatieanalyse van patiënten met COV-acuutnierblessurevergeleken met die zonderacuutnierblessure, en waar de gegevens beschikbaar zijn om te downloaden. Figuur S1. Pearson-correlatie van urine-proteomics in de bestudeerde monsters. Figuur S2. Verdeling van P-waarden vóór aanpassing. (A) Statistische resultaten van de limma-test die de intensiteiten van vergeleekurineeiwitten op basis van de status vanacuutnierblessure. (B) Statistische resultaten van de limma-test die de intensiteiten van vergeleekurineeiwitten op basis van deCovid-19-19infectie in deacuutnierblessure-negatieve groep. Tabel S1. Masterblad van onderzoeksdeelnemers. Tabel S2. Statistische analyseresultaten van urineproteomics. Tabel S3. SARS-CoV-2-peptiden werden gedetecteerd in 2 urinemonsters met LC-MS/MS. De proteomics-gegevens werden doorzocht met MSGFþ-software. STROBE-verklaring (PDF).