Anti-verouderingseffecten van Piper Cambodianum Cistanche-extract op normale menselijke dermale fibroblastcellen en een model voor wondgenezing bij muizen Ⅱ

Cistancheextraheer beschermde NHDF-cellen tegen de effecten van UV-straling

Huidcellen reageren snel wanneer ze worden blootgesteld aan UV of cytokines zoals interleukine (IL)-4 en IL-13.19Bij blootstelling aan UV worden verschillende factoren gestimuleerd, waaronder EGFR,20,21 TNFR,22mitogeen-geactiveerde proteïne (MAP) kinasen, ERK en c-Jun amino-terminale kinase (JNK).23Zowel JNK als p38 fosforyleren en activeren de transcriptiefactor c-Jun, die op zijn beurt c-Fos verhoogt en niveaus van transcriptiefactor-activatoreiwit verhoogt-1,24die nodig is voor de transcriptie van MMP's. Deze receptoren worden geactiveerd door de fosforylering van MAP-kinase en andere stroomafwaartse eiwitten.25MAP-kinasen worden geactiveerd door fosforylering van specifieke threonine- en tyrosineresiduen.24,26Blootstelling aan UV leidt tot hoge expressie van c-Jun- en c-Fos-heterodimeren, talrijke cytokines en groeifactoren, die worden gefosforyleerd door JNK en p38.27,28Evenzo waren p53-eiwitniveaus verhoogd, beginnend vanaf 2,5 uur tot 24 uur na blootstelling aan UV.29We hebben aangetoond dat cellen die gedurende 24 uur aan UV-straling zijn blootgesteld, TNFR1- en EGFR-eiwitniveaus tot expressie brachten, die op een dosisafhankelijke manier afnamen wanneer cellen werden behandeld metCistanche. We onderzochten het effect van UV-straling op zowel de fosforylering als de activiteit van p38 (Thr180/Tyr182). Eiwitniveaus van c-Jun en p53 werden drastisch verlaagd inCistanche-behandelde cellen (figuren 4A en B).

Klik hier voor meer informatie over Cistanche voor anti-verouderingsbehandeling

Cistanche-extract beschermde UV-bestraalde NHDF-cellen van ROS

UVB-licht stimuleert de aanmaak van ROS,30,31en UV-blootstelling op de huid produceert ROS zoals O2 ⋅−, H2 O2, En1 O2. 32Onbehandeld enCistanche-behandelde cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan UV-bestraling en de vorming van ROS werd gemeten door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).

figuur 3Regulatie van ECM-eiwitten inCistanche-behandelde cellen.Opmerkingen: (A) NHDF-cellen werden behandeld metCistanchegedurende 24 uur. Cellysaten werden geanalyseerd door middel van immunoblotting met behulp van anti-collageen-, anti-elastine-, anti-MMP-3- en anti-ERK-2-antilichamen. Resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. (B) Actine, collageen, elastine, MMP-3 en ERK-2 in de immunoprecipitaten werden gekwantificeerd met Western-blotting. Staafhoogten zijn het respectievelijke gemiddelde± SD's van drie onafhankelijke experimenten. *P,0.05; **P,0.01. Afkortingen:Conc, concentratie; ECM, extracellulaire matrix; ERK, extracellulaire signaalgereguleerde kinase; MMP, matrixmetalloproteïnase; NHDF, normale menselijke huidfibroblast;Cistanche, Piper CambodjaP. Fourn.; SD's, standaarddeviaties.

Figuur 4Cistanche extract remming van ROS-productie in UV-bestraalde cellen.Opmerkingen: (A) NHDF-cellen werden blootgesteld aan UV-bestraling bij 40 J gedurende 180 seconden en behandeld metCistanchegedurende 24 uur. Cellysaten werden geanalyseerd door immunoblotting met behulp van anti-TNFR6-, anti-c-Jun-, anti-c-Fos-, anti-pp38- of anti-p-JNK-antilichamen. Resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. (B) Totaal en tyrosine-gefosforyleerd p38, JUK, actine en TNFR6 in de immunoprecipitaten werden gekwantificeerd door Western-analyses. Barhoogtes zijn het gemiddelde± SD van drie onafhankelijke experimenten. *P,0.05; **P,0.01. Afkortingen:Conc, concentratie; EGFR, epidermale groeifactorreceptor; JNK, c-Jun aminoterminale kinase; JNK, c-Jun N-terminale kinase; NHDF, normale menselijke huidfibroblast;Cistanche, Piper CambodjaP. Fourn.; ROS, reactieve zuurstofspecies; SD, standaarddeviatie; TNFR, tumornecrosefactorreceptor; UV, ultraviolet.

UV-straling verhoogde de ROS-productie, terwijlCistanche extract verlaagde ROS-productie in NHDF-cellen. De ROS-niveaus van H2 O2 werden gemeten met behulp van de celpermeanten 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïne diacetaat (CM-H2 DCFDA) (Figuur 5A). UV-straling verhoogde de ROS-niveaus van H2 O2 , terwijl de ROS-niveaus werden verlaagd metCistanche extract op een dosisafhankelijke manier (Figuur 5B). Deze resultaten gaven dat aanCistancheextract beschermt dermale fibroblasten tegen UV-straling door de ROS-generatie te verminderen.

Macroscopische observatie van wondgenezing bij muizen

Wonden werden gemaakt op de ruggen van muizen en vervolgens behandeldCistancheextract (0, 1, 10 en 50µg/ml); de wondgebieden werden gedurende 4 dagen elke dag gemeten. Op dag 4 worden de gebieden rond de wonden inCistanche-behandelde muizen vertoonden verminderde roodheid op een dosisafhankelijke manier in vergelijking met onbehandelde wondgebieden (Figuur 5). De met extract behandelde wondgebieden waren kleiner dan het onbehandelde wondgebied, wat een dosisafhankelijk patroon vertoonde. Op dag 4 worden de wondgebieden behandeld met 50µg/ml vanCistanchevolledig bedekt met nieuw epitheel. Er waren geen wondgebieden geïnfecteerd (Figuur 6A en B). De verhoudingen van wondgebieden op dag 0 en 4 werden berekend (Afbeelding 6C).

Discussie

Het gebruik van plantaardige materialen en verschillende plantendelen is toegenomen met de daarmee gepaard gaande vooruitgang in fytotherapie. Kruidenmaterialen zijn in verschillende vormen gebruikt, zoals mono- of polykruidengeneesmiddelen, voedingssupplementen en voedingsingrediënten, en vele zijn bekende en veilige commerciële handelswaar geworden.33Diverse planten oaCistanche, zijn onderzocht op hun mogelijke farmacologische eigenschappen, maar er is nog geen vergelijkende studie mee uitgevoerdCistanche extract. Dit onderzoek is uitgevoerd om te bepalende effecten vanCistanche extract op wondgenezingsactiviteiten met behulp van incisiewondmodellen bij muizen. Wondgenezing omvat het herstel van de weefselintegriteit door middel van processen die verband houden met ontstekings-, proliferatie- en remodelleringsstadia.34 De huidremodelleringsfase wordt gekenmerkt door de herformulering en hervorming van collageenvezelcomponenten die de treksterkte verbeteren.35Het genezingsproces wordt voornamelijk gereguleerd door de biosynthese en afzetting van nieuw collageen en de daaropvolgende rijping.36In ons wondonderzoekCistanche extract vertoonde verhoogde wondgenezingseffecten in vergelijking met de controle (figuren 1C en 6). Een dergelijke genezing kan te wijten zijn aan de verhoogde collageenconcentratie en stabilisatie van de vezels. In het weefselherstelproces versterken ontstekingscellen de migratie en proliferatie van endotheelcellen, wat leidt tot de neovascularisatie van bindweefselcellen die extracellulaire matrices synthetiseren, waaronder collageen en keratinocyten, wat resulteert in de re-epithelialisatie van gewond weefsel.37De snellere wondcontractiesnelheid kan de intracellulaire communicatie tussen fibroblasten en de snellere rijping van granulatieweefsel vergroten.38In het incisiewondmodel werden muizen behandeld metCistancheextract vertoonde snellere wondgenezing in vergelijking met controles (Figuur 6). Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat neerwaartse regulatie van de p38-kinaseroute verschillende wildtype cellijnen die p53- tot expressie brengen, beschermt tegen genotoxische stress.39,40Onze gegevens toonden aan dat p38-expressie in met UV bestraalde cellen werd verlaagd doorCistanche behandeling. Daarom,Cistanche extract verkregen uit bladeren en stengels toonde een effectieve behandeling bij wondgenezing.Cistancheextract verlaagde ROS-productie door UV-bestraling door ROS in NHDF-cellen op te vangen (figuren 5A en B). Bovendien,Cistancheextract versnelde wondgenezing na huidbestraling ((Figuur 6A-C). Deze resultaten suggereerden datCistanche extract beschermt de huid tegen schade door UV-straling en kan nuttig zijn als nieuwe grondstof in cosmetische toepassingen.

Figuur 5Cistanche-gemedieerde remming van ROS-productie in UV-bestraalde cellen.Opmerkingen: (A) Cellen werden gedurende de aangegeven tijd behandeld met UVB-straling (40 J) en vervolgens geïncubeerd met 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat gedurende 30 minuten. De generatie van ROS werd gemeten door FACS. (B) Cellen werden gedurende 180 seconden blootgesteld aan UVB (40 J) en behandeld met de aangegeven concentratie vanCistanchegedurende 24 uur. ROS-productie werd geschat met de kleuring van 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat en geanalyseerd met FACS.Afkortingen:FACS, door fluorescentie geactiveerde celsortering; FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat; NHDF, normale menselijke huidfibroblast;Cistanche, Piper CambodjaP. Fourn.; ROS, reactieve zuurstofspecies; UV, ultraviolet; UVB, ultraviolet B.

Figuur 6Wondgenezende effecten op een aangetaste muizenhuid.Opmerkingen: (A) Er werden wonden met een diameter van 5-mm gemaakt op de dorsale huid van 7-mannelijke C57Bl/6-muizen van een week oud (n=3). Het herstel van wonden werd geëvalueerd metCistanchebehandeling in de verschillende concentraties (negatieve controle en postwondbehandeling metCistancheop 1, 10 en 50µg/ml). (B) Het wondgebied werd bepaald door de diameter van de open wonden te meten. (C) Het wondgebied werd berekend aan de hand van de afmeting van de open wonden; *P,0.05; **P,0.01. Afkortingen:Cistanche, Piper CambodjaP. Fourn; Conc, concentratie.

Conclusie

Deze studie onderzocht depotentiële anti-verouderings- en wondgenezende effecten van Cistanche stengel- en bladextractin NHDF-cellenen een muismodel van wondgenezing. Debehandeling van NHDF-cellen met Cistanche uittrekselsbevordert het herstel van het bekraste gebiedop een dosisafhankelijke manier, evenals de verbetering van ECM-genexpressie. Bovendien Cistancheuittrekselswaren in staat om tebescherm de cel tegen UV-blootstelling door de ROS-productie te verminderen. Ten slotte worden deze waarnemingen verder geëvalueerd en bevestigd in de modelmuizen voor in-vivo wondgenezing. Daarom,Cistanche-extract vertegenwoordigt een veelbelovend nieuw therapeutisch middel voor anti-aging en wondgenezing.

dankbetuigingen:Deze studie werd ondersteund door het Basic Science Research Program via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs (NRF-2014R1A1A3050752). De auteurs willen het Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB) bedanken voor hun bijdrageCistancheuittreksels.

Openbaring De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.

Referenties

1. Slominski AT, Zmijewski MA, Semak I, et al. Cytochroom p450 en huidkanker: rol van lokale endocriene routes.Middelen tegen kanker Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Gilchrest BA. Huidveroudering en fotoveroudering.Dermatol verpleegsters. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ha TY. Ontwikkeling van functionele voedingsmaterialen voor een gezond leven.Koreaans J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zouboulis CC. Moleculaire mechanismen van huidveroudering: state of the art.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MIJN, Chung SY, Choi WK, et al. Anti-verouderingseffect van rijstwijn in gekweekte menselijke fibroblasten en keratinocyten.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Kligman AM. Vroeg destructief effect van zonlicht op de menselijke huid.JAMA. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Veranderingen in bindweefsel in de huid die wordt blootgesteld aan natuurlijke en therapeutische UV-straling.Fotodermatol. 1985;2(1):15–26. 

8. Bech-Thomsen N, Wulf HC. Kankerverwekkende en melanogene effecten van een gefilterde metaalhalogenide UVA-bron en een buisvormige fluorescerende UVA-bruiningsbron met of zonder aanvullende zonne-gesimuleerde UV-straling bij haarloze muizen.Photochem Photobiol. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Studies op bladeren van Piper betle.Stier Calcutta Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ferreres F, Oliveira AP, Gil-Izquierdo A, Valentão P, Andrade PB. Piper betle-bladeren: profilering van fenolverbindingen door HPLC / DAD-ESI / MS (n) en anti-cholinesterase-activiteit.Phytochem Anal. 2014;25(5): 453–460.