Beschermende effecten van Cistanche tegen H2O2/UVB-geïnduceerde dermale fibroblast-collageenafbraak via Hsa-microRNA-4535-gemedieerde TGF/Smad-signalering
May 06, 2023
ABSTRACT
Deze studie had tot doel het mechanisme te onderzoeken dat ten grondslag ligt aan debeschermende effecten van cistanchetegen H2O2/UVB-geïnduceerde schade met behulp van in vitro en in vivo modellen van fotoschade. Bovendien hebben we de betrokkenheid van miRNA-regulatie bij dit proces geïdentificeerd. De met H2O2/UVB behandelde HS68 menselijke dermale fibroblasten en UVB-geïnduceerde C57BL/6J naakte muizen werden gebruikt als in vitro en in vivo modellen van fotoschade. Dat lieten de resultaten ziencistanche-behandelingverlichte H2O2 / UVB-geïnduceerde vermindering van de levensvatbaarheid van cellen, TGF / Smad-signaleringsstoornisen huidveroudering. Op basis van de resultaten van microRNA-array-analyses en databasezoekopdrachten werd has-miR-4535 geïdentificeerd als eenpotentiële kandidaat-miRNA dat zich richt op Smad4. In vitro activeerde cistanche-behandeling het Smad2/3/4-complex en remde het de expressie van hsa-miR-4535 in aan H2O2/UVB blootgestelde cellen. In vivo zorgde topische toepassing van lage (12 mg/kg) en hoge doses (24 mg/kg) cistanche op de dorsale huid van C57BL/6J naakte muizen voor significante verlichting van UVB-geïnduceerde huidbeschadiging door het bevorderen van TGF/Smad-collageensynthesesignalering, het verminderen van epidermale hyperplasie, rimpelvorming en huidveroudering, evenals het remmen van hsa-miR-4535-expressie. Al met al duiden onze bevindingen op een verband tussen hsa-miR-4535 en TGF/Smad-collageensynthesesignalering en suggereren dat deze factoren betrokken zijn bij het fotobeschermende mechanisme van cistanche in dermale fibroblasten tegen H2O2/UVB-geïnduceerde veroudering. Dat bleek uit het bewijscistanche met anti-aging eigenschappenkan zijnbeschouwd als een aanvulling ophuidverzorgingsproducten.
Cistanche huidverzorgingsproduct te koop
INVOERING
De klinische tekenen van huidveroudering bij de mens zijn onder meer verhoogde rimpels, verslapping en onregelmatige pigmentatie [1]. Het proces van huidveroudering is gecompliceerd en kan worden onderverdeeld in twee typen: intrinsieke veroudering en extrinsieke veroudering. Intrinsieke veroudering is het gevolg van het verstrijken van de tijd en genetische factoren, terwijl extrinsieke veroudering, ook wel fotoveroudering genoemd, voornamelijk het gevolg is van blootstelling aan ultraviolette straling [2, 3]. Eerdere studies hebben aangetoond dat er overvloedige reactieve zuurstofsoorten (ROS) worden gegenereerd tijdens zowel intrinsieke als extrinsieke veroudering. De accumulatie van ROS kan mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK)-signalering induceren en zijn stroomafwaartse transcriptiefactor activeren, activatorproteïne-1 (AP-1). Geactiveerde AP-1 kan zich verplaatsen naar de kern en binden aan de promotorregio's van matrixmetalloproteïnasen (MMP's) [4]. MMP's zijn een grote zinkafhankelijke endopeptidasegroep, die bijdraagt aan de afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) van de dermis van de huid. Met name MMP-1, een collagenase, is betrokken bij de splitsing van collageen type I en III [5]. Collageentypes I en III, de belangrijkste componenten van ECM, zijn in staat steun en kracht te verlenen aan de dermis van de huid en hun wanorde leidt tot de karakteristieke rimpels en verslapping van een verouderde huid [6]. Transforming growth factor-beta (TGF ) is een alomtegenwoordige en krachtige cytokine met drie verschillende isovormen, TGF 1, TGF 2 en TGF 3, die de collageensynthese in de dermis van de menselijke huid positief kan reguleren [2]. TGF's initiëren hun signaal door interactie met specifieke serine/threoninekinasereceptorcomplexen op het celoppervlak, waaronder TGF-receptortypes I (TRI) en II (TRII). T RI-fosforylering triggert de fosforylering van R-Smads (Smad2 en Smad3). Geactiveerde R-Smads interageren met Smad4 om de nucleustranslocatie te reguleren en transcriptioneel collageentypes I en III te activeren door binding aan promoters van Smad-bindende elementen (SBE) [7, 8]. Steeds meer bewijs geeft aan dat verhoogde ROS-generatie, geïnduceerd door intrinsieke veroudering of fotoveroudering, bijdraagt aan TGF/Smad-signaleringsroutestoornissen, wat op zijn beurt resulteert in verminderde collageensynthese in dermale fibroblasten van de menselijke huid [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihydroxyflavon), een natuurlijk lid van de flavonoïdenfamilie, is overvloedig aanwezig in Alpinia officinarum en propolis. cistanche is een potentiële kandidaat voor de behandeling van ischemische beroerte, diabetes en verschillende soorten kanker [11-13]. Bovendien bezit cistanche radicale opruimende en ontstekingsremmende activiteiten [14, 15]. We hebben eerder aangetoond dat cistanche H2O2-geïnduceerde ontstekingen verminderde en collageenvorming bevorderde via insulineachtige groeifactor 1-receptor (IGFI-R)/ERK1/2-signaalroutes in HS68-cellen [16, 17]. Bovendien gaf een studie aan dat cistanche werd geïdentificeerd als een verbinding van Alpinia officinarum en collagenase-remmende effecten heeft in dermale fibroblastcellen [18]. Een meer gedetailleerd moleculair mechanisme met betrekking tot hoe cistanche huidveroudering reguleert, is echter onbekend. MicroRNA's (miRNA's) zijn een groep kleine, enkelstrengs, niet-coderende RNA-moleculen met een gemiddelde lengte van 22 nucleotiden. Rijpe miRNA's worden getranscribeerd uit DNA-sequenties. In de meeste gevallen binden rijpe miRNA's aan de 3'-niet-vertaalde regio's (UTR's) van doel-mRNA's om mRNA-vertaling tot zwijgen te brengen [19]. In de menselijke huid spelen miRNA's een cruciale rol bij de regulatie van het celmetabolisme, kanker, veroudering en collageenvorming [20-23]. MiR-377 kan bijvoorbeeld senescentie van dermale fibroblasten induceren door de expressie van DNA-methyltransferase 1 (DNMT1) te remmen, wat vervolgens leidt tot minder methylering in p53-promoter en senescentie van dermale fibroblasten [22]. Het miRNA-profiel in UVB-geïnduceerde schade in menselijke dermale papillacellen (nHDP's) was eerder onderzocht [24]. Het is echter grotendeels onbekend hoe UVB-geïnduceerde senescentie van dermale fibroblasten door miRNA-regulatie, vooral door de betrokkenheid van natuurlijke verbindingen. Deze studie was gericht op het onderzoeken van de beschermende effecten van cistanche tegen H2O2/UVB-geïnduceerde huidbeschadiging, evenals de rol van microRNA-gemedieerde collageenafbraak in dit proces. We wilden verder de microRNA's identificeren die betrokken zijn bij het reguleren van de collageensynthese.
RESULTATEN
cistanche remt UVB/H2O2-geïnduceerde cytotoxiciteit in HS68 humane dermale fibroblasten
Om de cytotoxiciteit van cistanche (figuur 1A) in vitro te onderzoeken, werden HS68-cellen behandeld met verschillende doses cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) voor 24 uur. MTT-testresultaten toonden aan dat cistanche niet cytotoxisch was voor HS68-cellen (Figuur 1B). Vervolgens hebben we HS68-cellen gedurende 24 uur blootgesteld aan verschillende doses H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) en UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²). H2O2- en UVB-behandeling verminderden de levensvatbaarheid van de cellen op een dosisafhankelijke manier (Figuur 1C, 1D). Om de cytoprotectieve eigenschappen van cistanche te evaluerenH2O2 en UVB-blootstelling, waarmee we de HS68-cel hebben behandeldverschillende concentratie van cistanche (10, 20, 30 μM)volgende H2O2- (200 μM) en UVB-geïnduceerd (40mJ/cm²) schade. H2O2 of alleen een UVB-behandelingverminderde de levensvatbaarheid van HS68 aanzienlijk (40 procent).cellen. Cistanche-behandeling voorkwam echter celdoodop een concentratie-afhankelijke manier (Figuur 1E, 1F).Hogere concentratie van cistanche (30 μM) prominent aanwezigallevat H2O2- en UVB-geïnduceerde cytotoxiciteit.Daarom werd de dosis van 30 μM cistanche gebruiktvolgendin vitrostudies om de bescherming ervan te evaluereneffecten in HS68-cellen.
Afbeelding 1. cistanche remt door UVB/H2O2-geïnduceerde cytotoxiciteit in HS68 humane dermale fibroblasten. (A) De chemische structuur van cistanche. (B) Cellevensvatbaarheid van HS68-cellen behandeld met verschillende concentraties cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) gedurende 24 uur. (C en D) Cellevensvatbaarheid van HS68-cellen blootgesteld aan verschillende doses H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) of bestraald met UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) gedurende 24 uur. (E en F) Cellevensvatbaarheid van HS68-cellen blootgesteld aan H202 (200 µM) of bestraald met UVB (40 J/cm2) gedurende 1 uur en vervolgens behandeld met cistanche (10, 20, 30 µM) gedurende 23 uur. De cytoprotectieve effecten van cistanche werden bepaald door de MTT-assay. Controlecellen kregen 100 procent levensvatbaarheid toegewezen. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SE. Kwantificering van de resultaten wordt weergegeven (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. onbehandelde controlecellen; ##P < 0,01, ###P < 0,001 versus met H2O2 of UVB behandelde cellen.
Cistanche verzwakt H2O2-geïnduceerde HS68-celsenescentie in plaats van apoptose
Cistanche verzwakt UVB/H2O2-geïnduceerde intracellulaire/mitochondriale ROS-productie en MMP-onevenwichtigheid in HS68-cellen
cistanche verzwakt H2O2-geïnduceerde TGF /Smadstoornissen in de collageensyntheseroute in HS68-cellen
Cistanche-behandeling vermindert de H2O2-geïnduceerde opgereguleerde expressie van hsa-miR-4535, waarvan wordt voorspeld dat deze zich richt op Smad4
Figuur 4. cistanche verzwakt door H2O2-geïnduceerde TGF/Smad-collageensynthesewegstoornis in HS68-cellen. (A) HS68-cellen werden gedurende 1 uur blootgesteld aan H2O2 (200 µM) en vervolgens gedurende 23 uur behandeld met cistanche (30 µM). Eiwitexpressie van aan collageensynthese gerelateerde routecomponenten (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) en aan collageenafbraak gerelateerd eiwit (MMP-1) werden gedetecteerd met Western-blot. (B) De eiwitexpressie van p-smad2/3 en Smad4 in de nucleaire en cytosolische fracties werd gedetecteerd door Western-blotting. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SE. Kwantificering van de resultaten wordt weergegeven (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. onbehandelde controlecellen; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. met H2O2-behandelde cellen. (C) Anti-p-Smad2/3, Smad4-antilichaam en FITC/PE-geconjugeerd secundair antilichaam werden gebruikt om expressie van p-Smad2/3 (groen) en Smad4 (rood) te detecteren. DAPI gaf de kernlocatie aan (blauw). De beelden werden vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop (200×).
Modulatie van Smad4 door has-miR-4535 is betrokken bij collageensynthese in H2O2-blootgestelde huidfibroblasten van de menselijke huid
en COL3A1-niveaus (Figuur 7F). De overexpressie van hsa-miR-4535 (Afbeelding 8A–8C) of remming van Smad4 door siRNA (Afbeelding 8D, 8E) resulteerde in verminderde collageensynthese onder cistanche-behandeling na blootstelling aan H2O2. Verrassend genoeg ontdekten we dat zowel directe Smad4-uitschakeling als behandelingen met hsa-miR-4535 omgekeerde cistanche-geïnduceerde collageensynthese nabootsen in met H2O2- behandelde HS68-cellen. Alles bij elkaar genomen, concludeerden we dat cistanche de collageensynthese reguleerde, mogelijk via een verlaging van het hsa-miR-4535-niveau om de Smad4-signalering te verbeteren in HS68-cellen die zijn blootgesteld aan H2O2.
cistanche verbetert de TGF /Smad-collageensyntheseroute en verzwakt huidsenescentie evenals remming van has-miR-4535-expressie in aan UVB blootgestelde HS68-cellen
Topische toepassing van cistanche vermindert UVB-geïnduceerde huidhyperplasie en collageenafbraak en verbetert TGF / Smad-signalering in de dorsale huid van C57BL6 / J naakte muizen
Afbeelding 6. cistanche reguleert de Smad4-expressie door het hsa-miR-4535-niveau te verlagen. (A, B) HS68-cellen werden behandeld met verschillende concentraties H2O2 (0, 100, 20{{30}} µM ) gedurende 24 uur. (C, D) HS68-cellen werden gedurende 1 uur blootgesteld aan H2O2 (200 µM) en vervolgens gedurende 23 uur behandeld met cistanche (30 µM). De expressie van hsa-miR-4535 en Smad4 werd gedetecteerd door qRT-PCR. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SE. Kwantificering van de resultaten wordt getoond (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 versus onbehandelde controlecellen; ##P < 0,01, ###P < 0,001 versus met H2O2-behandelde cellen.
Afbeelding 7. Overexpressie of remming van hsa-miR-4535 reguleert de collageensynthese in HS68-cellen. (A–C) HS68-cellen werden getransfecteerd met hsa-miR-4535-remmer (40 nM) of remmer NC (40 nM) gedurende 1 uur en vervolgens gelijktijdig behandeld met H2O2 (2 00 μM) gedurende 23 uur. (D – F) HS68-cellen werden gedurende 1 uur getransfecteerd met hsa-miR-4535-nabootsing (10 nM) of nabootsing van NC (10 nM) en vervolgens samen behandeld met cistanche (30 μM) gedurende 23 uur. hsa-miR-4535-niveaus werden gedetecteerd door qPCR om succesvolle transfectie te garanderen. Eiwitniveaus van Smad4, COL1A1 en COL3A1 werden geanalyseerd met Western-blotting. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SE. Kwantificering van de resultaten wordt getoond (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. onbehandelde controlecellen; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2 of met cistanche behandelde cellen.
Figuur 8. Remming van Smad4 door siRNA of hsa-miR-4535-nabootsing keert de cistanche-gemedieerde versterking van de collageensynthese in dermale fibroblasten om. (A–C) HS68-cellen werden gedurende 1 uur getransfecteerd met hsa-miR-4535-nabootsing (10 nM) of nabootsing van NC (10 nM), gevolgd door co-behandeling met cistanche (3 {{40}} μM) en H2O2 (200 μM) gedurende 23 uur. Hsa-miR-4535 (A)- en Smad4-niveaus (B) werden gedetecteerd door qPCR om succesvolle transfectie te garanderen. (D – E) HS68-cellen werden getransfecteerd met siRNA Smad4 (20 nM) of siRNA NC (20 nM) gedurende 1 uur gevolgd door co-behandeling met cistanche (30 μM) en H2O2 (200 μM) gedurende 23 uur. Smad4-niveaus werden gedetecteerd door qPCR om succesvolle transfectie te garanderen (D). Eiwitniveaus van Smad4, COL1A1 en COL3A1 werden geanalyseerd met Western-blotting (C, E). GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. Getoonde waarden zijn gemiddelden ± SE. Kwantificering van de resultaten wordt weergegeven (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. onbehandelde controlecellen; #P < 0,05, ##P < 0,01, versus met H2O2-behandelde cellen; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 vs. H2O2 plus met cistanche behandelde cellen
Bovendien redde cistanche-applicatie TGF-, p smad2/3- en Smad4-eiwitexpressie in door UVB aangetast huidweefsel (Figuur 12C). Onze bevindingen gaven aan dat cistanche de huid mogelijk zou kunnen beschermen tegen UVB-geïnduceerde schade door hsa miR-4535 te remmen om Smad4-expressie te verbeteren voor activering van P-smad2/3 om uiteindelijk de collageensynthese te bevorderen (Afbeelding 13)
Figuur 9. cistanche verbetert de TGF/Smad-collageensyntheseroute en verzwakt huidsenescentie evenals remming van hsa-miR-4535-expressie in aan UVB blootgestelde HS68-cellen. HS68-cellen werden blootgesteld aan UVB (40 mJ/cm2) en vervolgens gedurende 23 uur behandeld met cistanche (30 µM). (A) Eiwitexpressie van aan collageensynthese gerelateerde routecomponenten (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), aan collageenafbraak gerelateerd eiwit (MMP{{20}}), en senescentie- geassocieerde markers (p16 en p21) werden gedetecteerd met Western-blot. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. (B en C) RNA-expressie van hsa-miR-4535 en Smad4 werd gedetecteerd door qRT-PCR. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SE. Kwantificering van de resultaten wordt getoond (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, versus onbehandelde controlecellen; #P < 0,05, ##P < 0,01 versus aan UVB blootgestelde cellen.
Vraag voor meer:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
