Antioxidant en antiverouderingspotentieel van een peptideformulering (Gal2-Pep) geconjugeerd met galluszuur
May 04, 2023
De huid is zeer kwetsbaar voor vroegtijdige verouderingvanwege externe stress daarom in deze studie een peptideformulering, (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) werd gesynthetiseerd door TPPTTP-peptide en gallus te combinerenzuur (GA). Alle peptiden zijn gesynthetiseerd op 2-chloortritylchloridehars met behulp van peptide in vaste fasesynthese (SPPS), en geanalyseerd op een electrospray ionisatie (ESI)/quadrupool-tijd-van-FLFLight (Q-TOF) tandem massaspectroscopie (MS) systeem. Aanvankelijk Gal2–Pep vertoonde geen toxiciteit onder de concentratie 100mM met een celoverlevingspercentage van 88 procent voor keratinocyten enfibroblasten. Dereactieve zuurstof soorten(ROS) spoelactiviteit van Gal2–Pep was stabieler in vergelijking met alleen GA; en na vier weken op kamertemperatuur, zijnROS-opruimingsactiviteitbleef boven de 50 procent . Bovendien is de peptideformulering,Gal2–Pep vertoonde ook een elastase-remmend effect in CCD-1064Skfibroblastcellen. Op basis van de resultaten van RT-qPCR werd in deze studie bewezen dat Gal2–Pep verhoogde de expressie van PGC-1a naarvoorkomenoxidatieve stress, en bevestigde zijn potentieel als eenmiddel tegen verouderingdoorhet verhogen van de expressie vantype I collageenen bijafname van de expressie van matrixmetalloproteïnase-1 (MMP1). Debevindingen verkregen versterken de suggestie dat de peptideformulering die in deze studie is gesynthetiseerd, zou kunnen worden gebruikt als eennatuurlijke antioxidantEnmiddel tegen verouderingvoor zijn cosmetische toepassingen.
Klik hier voor meer informatie over de anti-verouderingsproducten van Cistanche
1. Inleiding
Huidverouderingtreedt op als gevolg van de geleidelijke afname en uiteindelijk stopzetting van de celdeling van keratinocyten en broontploffingen in de huid. Rimpels op de huid ontwikkelen zich naarmate het aantal cellen afneemt, met als gevolg denaturatie van de extracellulaire matrix die leidt tot uitdroging en verlies van elasticiteit in de huid.1 Schade aan intracellulair mitochondriaal DNAen er treedt ook een verlaging van de snelheid van eiwitsynthese optijdens het huidverouderingsproces.2 Huidveroudering heeft twee belangrijke wegenmanieren, intrinsiek en extrinsiek, met blootstelling aan ultraviolet (UV).
een belangrijke drijfveer vanextrinsieke veroudering. Het UV-licht reageert met belangrijke huidcomponenten, inclusief lipiden, eiwitten en nucleïnezuren, om reactieve zuurstofspecies (ROS) te produceren die leiden totdood.3–5 Overmatige ROS-niveaus leiden ook tot de splitsing enabnormale binding van collageen- of elastineketens en bevordert de expressie van matrixmetalloproteïnasen (MMP's), zoals MMP-1, die collageen afbreken, wat leidt tot rimpels in de huid enhuidveroudering versnellen.6,7 Daarom antioxidanttherapie verwijderenROS en het activeren van het mitochondriale potentieel heeft de voordelen om de huid te beschermen tegen veroudering.
Naast ROS speelt elastase een belangrijke rol bij het verlies vanhuidelasticiteit, die elastine afbreekt, een belangrijk eiwit van deextracellulaire matrix.8 Elastine, vanwege zijn aanzienlijke elastische terugslagkenmerken, zorgen voor elasticiteit van de huid, terwijl elastase dat wel heefthet vermogen om elastine en andere eiwitten te splitsen.8 Daarom, inhibiHet gebruik van elastase-enzym zou een belangrijke strategie kunnen zijn voor huidverslapping via het verlies van huidelasticiteit voorkomen.
In deze studie hebben we een nieuw materiaal ontworpen dat deperoxisoom proliferator-geactiveerde receptor gamma-coactivator1-alfa (PGC-1a)-afgeleid peptide TPPTTP en galluszuur (GA)voor gebruik in anti-verouderingscosmetica. GA is een fytochemische stof die voorkomt in verschillende soorten fruit en groenten, waaronder druiven, tomaten en groene thee, waarvan bekend is dat ze een hoge antioxidant en antibacteriële werking hebben. effecten.9 Hoewel GA vanwege deze heilzame effecten, is de formulering vaak instabiel.10 Zo ontwikkelden we (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) om de stabiliteit van GA te vergroten door het aan de PGC te binden-1a-afgeleid peptide TTPTTP.
In deze studie synthetiseerden we een (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) peptideformulering in conjugatie met galluszuur en bevestigdzijn potentieel als antioxidant en antiverouderingsmiddel.
2. materialen en methoden
2.1. Materialen
Dulbecco is gewijzigdEagle's Medium (DMEM), penicilline/streptomycine, foetaal runderserum (FBS), fosfaat-bufferedzoutoplossing (PBS) en trypsine werden gekocht bij Gibco (Carls
slecht, CA). Hydroxybenzotriazool (HOBt), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropylethylamine (DIEA), galluszuur enN-succinyl-tri-alanyl-pnitroanilide werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Vorm aminozuren (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH, en Fmoc-Pro–OH) werden gekocht bij Bead-Tech (Seoul,Korea).
2.2. Synthese van peptiden en galluszuur-gekoppelde peptiden
Alle peptiden zijn gesynthetiseerd op 2-chloortritylchloridehars (200mmol schaal, substitutiewaarde¼ 1,46 mmolg 1) met behulp van HOBt–DIC-gemedieerde solid-phase peptidesynthese (SPPS).
Peptidesynthese met behulp van de SPPS-methode werd uitgevoerd met lichte modificatiesverwijzingen naar eerdere studies.11–13 De 2-chloortritylchloride (CTC) hars werd gezwollen in dichloor
methaan (DCM, 8 ml) gedurende 30 min. De hars werd gewassen metdimethylformamide (DMF). Alle reacties werden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Fmoc-beschermde aminozuurderivaten (2 equivalent(Equiv.), voor deFieerste aangehechte aminozuur of 5 equiv., voor de andere aminozuren) werden gekoppeld aan DIEA (5 equiv., voor een aangehechte aminozuur) of HOBt/DIC (6 equiv./5 equiv.) in DMF aFtehuitvoeren van ontscherming van Fmoc met behulp van 2 procent (v/v) DBU in DMF (2 keer, 2 min per keer, 8 ml). En alle stappen werden 5 keer gewassen met DMF. Laatste galluszuur werd gekoppeld aan lysine-gehechte peptiden.Na de koppeling van het galluszuur was de harsagefilterd, gewassen,en gedroogd onder een hoog vacuüm. De splitsingsoplossing (TFA:gedeïoniseerd [DI] water: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v procent ) werd gedurende 2 uur behandeldom de ruwe peptiden te verkrijgen. De ruwe peptiden werden neergeslagen en driemaal gewassen met koude diethylether.
Analytische high-performance vloeistofchromatografie met omgekeerde fase(RP-HPLC) werd uitgevoerd op een Waters 2695 SeparationsModule met een Capcell Pak C18 kolom (4,6 mm 250mm, 5mm, Shiseido). De mobiele fase bestond uit 0,05 procent TFA in H2O (mobiele fase A) en 0,05 procent TFA in acetonitril (mobiele fase B).
Elutie werd bereikt door gebruik te maken van een lineaire gradiënt voor mobielfase B van 5 procent tot 65 procent gedurende 30 minuten bij astromingssnelheid van 1.0 ml min 1. De peptidepieken werden gedetecteerd bij een golflengte van 230 nm. Semi-preparatieve RP-HPLC werd uitgevoerd op een Waters HPLC-systeem (Pump 600E, Detector UV-484) met een Gemini RP-C18kolom (21,2 mm 250mm, 5mm, Phenomenex). De mobiele fase bestond uit 0,05 procent TFA in H2O (mobiele fase A)en 0,05 procent TFA in acetonitril (mobiele fase B). Elutie werd bereikt door gebruik te maken van een lineaire gradiënt voor mobiele fase B van7 procent tot 22 procent gedurende 15 minuten bij alstromingssnelheid van 10 ml min 1. Depeptidepieken werden spectrofotometrisch gedetecteerd bij een golflengte van 230 nm.
De gesynthetiseerde peptiden werden opgelost in 5 procent mierenzuur in water en geanalyseerd op een electrospray ionisatie (ESI)/quadrupool-tijd-van-light (Q-TOF) tandem massaspectroscopie(MS) systeem (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). De monsters werden geïnjecteerd in het Q-TOF-systeem uitgerust meteen nano-spray bron bij alstroomtarief van 1mL min 1. Het ESI-ionbronparameters waren als volgt: een ionensproeispanning van 1,5 kV, gordijngas van 10 psi en omhulselgas van 5 psi. De spectra erinfull-scan-modus en MS/MS werden verzameld in het bereik vanm/z
100–1200 Da bij een accumulatietijd van 25 ms per spectrum.De botsingsenergie werd verhoogd van 10 naar 80. Het resultaatgegevens zijn verkregen met behulp van Analyst TF dusware en automatischtoegewezen door zwaartepunt 80 procent met een minimale piek, ruisonderdrukking van 10 procent, medium deisotoping met een drempel van 3 procent, geen ruisonderdrukking en geen afvlakking. De gesynthetiseerde peptiden werden geïdentificeerdmet een massatolerantie van 0.05 Da en handmatig gesequenced met een MS/MS-tolerantie van 0.01 Da.
2.3. Celculturen en levensvatbaarheidstesten
Menselijke, volwassen, lage calcium, hoge temperatuur (HaCaT) cellenen CCD-1064Sk (normale menselijke huidfibroblast) cellen warengekweekt in DMEM met 10 procent FBS en 1 procent penicilline/streptomycine. De cellen werden geïncubeerd bij 37 C in een bevochtigde luchtkamer met 5 procent CO2.Voor de levensvatbaarheidstesten werd de cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, China) gebruikt. HaCaT en CCD-1064Sk-cellenwerden gezaaid in 96-well-microtiterplaten (5 103 cellen per putje) en geïncubeerd bij 37 C in 5 procent CO2 voor 24 uur. De kweken werden vervolgens blootgesteld aan verschillende concentraties van de gesynthetiseerde peptiden of GA en geïncubeerd bij 37°C. C in 5 procent CO2 voor 24 uur. Levensvatbaarheid van de celwerd vervolgens gemeten met een CCK-8 volgens de richtlijnen van de fabrikant.
2.4. Bepaling van antioxidantactiviteit
2.4.1. DPPH-test.De antioxiderende activiteit van de gesynthetiseerdepeptiden en GA werden afzonderlijk geëvalueerd met behulp van de DPPH-assay. DPPH-assays werden uitgevoerd volgens een eerder gerapporteerde
methodologie met kleine modikation.12,14–16 Eerst een 0.12 mg ml 1 DPPH-oplossing werd bereid in methanol, daarna 100mL DPPH-oplossing en 100mL van de gesynthetiseerde peptiden of GA werden gemengd in verschillende concentraties ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM en 1mM) in 96-well-microtiterplaten. In een orbitale schudincubator, demengsels werden gedurende 30 min bij 37°C omgezet C en 100 toeren zonderlicht. De absorptie werd vervolgens gemeten bij 517 nm en de antioxidantcapaciteit werd berekend.
2.4.2. ROS-opruimingsactiviteit.
Intracellulaire ROS-wegvangende activiteit werd geëvalueerd met behulp van een 20,70-dichloorfluoresceïnediacetaatkit(DCF-DA, Abcam, VS). HaCaT-cellen werden geënt in 96-well-microtiterplaten (5 103 cellen per putje) en geïncubeerd bij 37 C gedurende 24 uur.AFtTijdens de incubatie werden de culturen blootgesteld aan de gesynthetiseerde peptiden of GA (100mM) en geïncubeerd op 37 C gedurende 24 uur. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan een 10mM DCF-DA-oplossing en gedurende 30 minuten geïncubeerd. AftNa incubatie werd de oplossing gewassen met PBS. Decellen werden geanalyseerd met behulp van een microplaatlezer bij excitatie en
emissiegolflengten van respectievelijk 485 nm en 530 nm.
figuur 1Synthetische stap- en sequentiebevestiging van peptiden met behulp van quadrupooltijd vanvlucht(Q-TOF) massaspectrometrie: (a) gedetailleerde synthetische procedure (b) TPPTTP, (c) galloyl–TPPTTP, en (d) (galloyl)2–KTPPTTP.
2.5. Mitochondriale membraanpotentiaaltest
JC{0}}-kleurstof (Thermo Fisher, VS) werd gebruikt voor de mitochondriënmembraanpotentiaal (MmP) test. CCD-1064Sk- en HaCaT-cellen werden geënt in 96-well-microtiterplaten (5 10 3cellen per putje)
en geïncubeerd op 37 C en in 5 procent CO2 voor 24 uur. achtereh incubatie,de kweken werden blootgesteld aan verschillende concentraties van de gesynthetiseerde peptiden en geïncubeerd bij 37°C C in 5 procent CO2 voor 24 uur.JC{0}}-kleurstof is toegevoegd aan de CCD-1064Sk- en HaCaT-cellenproduceren een eindconcentratie van 10mM. AFtna 10 minuten incubatie werden de cellen tweemaal gewassen met 37 C PBS. Groen en roodfluorescentiewerden gemeten met een Varioskan LUXMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, VS) bij een excitatie (lEx)/uitstoot (lem) van 475/530 nm en eenlEx/lemvan 475/respectievelijk 590nm.
2.6. Elastase-remmende activiteitstest
CCD-1064Sk-cellen werden geënt in 6-well-platen en geïncubeerd bij 37 C in 5 procent CO2 voor 24 uur. De kweken werden vervolgens blootgesteld aan een concentratie van 100mM van de gesynthetiseerde peptiden of GA en geïncubeerd bij 37 C in 5 procent CO2 voor 24 uur. Cellen werden tweemaal gewassen met dPBS en we verzamelden elke cel met behulp van een celschraper. Aer is 0.2 M Tris toegevoegd–HCl (pH 8.0) met 0.1 procent Triton-X aan het opgevangencellen, cellen werden gehomogeniseerd door ultrasonicator. De gehomogeniseerde oplossing werd gedurende 20 minuten bij 3000 rpm gecentrifugeerden 4 C. Dan, eenFter het supernatant nemen, eiwitkwanti-kation werd uitgevoerd met behulp van BCA-eiwitassay. Eiwit voor elkmonster werd afgegeven bij deFieindconcentratie van 100mgml 1, EnN-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilide werd toegevoegd aan deeindconcentratie van 1,6 mM en reageerde bij 36 C gedurende 1 uur.Vervolgens werd de absorptie gemeten bij 405 nm met behulp van een microplaatlezer.
2.7. RT-qPCR
De mRNA-niveaus van antiverouderingsmarkers in CCK-1064Sk-cellenwerden beoordeeld met behulp van RT-qPCR. Totaal RNA werd verzameld met behulp van TRIzol-reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA) en omgekeerd
getranscribeerd met behulp van de PrimeScript RT-reagenskit (Takara BioInc., Kusatsu, Japan). Een CFX96-systeem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories,
tories) werden gebruikt voor RT-qPCR.b-Actine werd gebruikt om de mRNA-niveaus van type I collageen, MMP-1 en PGC te normaliseren-1a.
2.8. statistische analyse
De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde standaarddeviatie vandrie onafhankelijke metingen en geanalyseerd met Student'st-proeven, met eenp < 0.05 considered to be a signigeen verschil.
Vraag voor meer:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
