Anti-aging effecten van Ribes Meyeri anthocyanen op neurale stamcellen en ouder wordende muizen deel 2

Neem dan contact op metoscar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Nar redt senescente fenotypes van 23M-NSC's

R. Meyer anthocyanen zijn rijk aan vele soorten flavonoïden en bioactieve componenten [1,3-5]. Om te bepalen welke component van R. Meyer-anthocyanen een belangrijke rol speelt bij anti-aging, voerden we een metabolomische analyse van R. Meyer-anthocyanen uit. We onthulden dat Nar een belangrijke flavonoïde metaboliet kan zijn omdat de flavonoïde biosynthetische route sterk verrijkt was met R. Meyer anthocyanen (aanvullende tabel 1). Om de anti-senescente effecten van Nar te bepalen, werden verschillende concentraties (0, 1.7,3.4,6.8,13.6 en 27,2 μg / ml) toegepast op 23M-NSC's en CCK-8-assays werden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te onderzoeken. Zoals aanvullende figuur 3 laat zien, verhoogde de behandeling met 6,8 μg/ml Nar de levensvatbaarheid van de cellen met 150%. Om de anti-senescente effecten van Nar verder te onderzoeken, werden 23M-NSC's behandeld met Nar en werden verouderingsgerelateerde indicatoren vervolgens gedetecteerd.hesperidine gebruiktIn 23M-NSC's behandeld met 6,8 μg/ml Nar was de p16nk4a mRNA-expressie verminderd (figuur 3A). Nar verlengde ook de telomeren van gekweekte mNSC's en verhoogde de DNA-synthese (figuur 3B,3C). Om de effecten van Nar op celproliferatie verder te onderzoeken, voerden we immunofluorescentiekleuring uit van Ki67, een nucleair antigeen van mitotische cellen dat gedurende de hele celcyclus tot expressie komt, behalve in G0 [19,27]. Behandeling met Nar versterkte celproliferatie, zoals gemeten door verhoogde aantallen Ki67-positieve cellen (Figuur 3D, 3E). Vervolgens ontdekten we ook het differentiatiepotentieel van NSC's in neuronen. Inderdaad, 6,8ug / ml Nar-behandeling verhoogde ook het aantal MAP2-positieve cellen (figuur 3F, 3G). Deze resultaten tonen consequent aan dat Nar 23M-NSC-senescentie kan omkeren.

Figuur 2. Ribes Meyer anthocyanen verbeteren het geheugen en het leervermogen van muizen door neurale stamcellen (NSC's) te verhogen. A) Er wordt tijd nodig gehad om het platform te vinden. B) Er wordt tijd nodig genomen om eerst het platform te bereiken. (C) Gemiddelde snelheid om het platform te vinden. D) Afstand gezwommen voordat het platform werd gevonden. (E. F) Behandeling met R.verloren imperium cistancheelke anthocyanine verhoogde het aantal en de grootte van de neurosfeer in vergelijking met controles. (G) Neurosferen van 50-100 um in omvang werden in aantal verhoogd door R. Meyer anthocyanine behandeling bij muizen. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ±SD van drie onafhankelijke experimenten. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Figuur 3. Effect van naringenine (Nar) op senescentie van neurale stamcellen van muizen (MNC's). (A) p16k4a mRNA-expressie werd gemeten door qRT-PCR in 23M-NSC's met en zonder behandeling van 6,8 ug /ml Nar gedurende 48 h. (B) Celcyclusfaseverdelingen van 23M-NSC's behandeld met Nar gedurende 48 uur en controlecellen. (C) De relatieve telomeerlengte van 23M-NSC's nam significant toe met Nar-behandeling, (D)Immunofluorescentie Ki67-kleuring van spieren behandeld met Nar gedurende 48 uur, met DAPI nucleaire etikettering, (E) Kwantificering van (D), (F)Representatieve velden van MAP2 en GFAPimmunofluorescentiekleuring van gekweekte mNSC's na controle en Nar-behandeling. G) Kwantificering van (F). Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde± SD van drie onafhankelijke experimenten. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Klik hier voor meer informatie

Nar verbetert geheugen en cognitie bij ouder wordende muizen

Cognitieve niveaus nemen af met het ouder worden en anti-aging behandelingen kunnen de cognitieve niveaus verbeteren [11, 28]. Om de anti-aging effecten van Nar in Vivo te verifiëren, injecteerden we 20 mg / kg Nar in ouder wordende C57BL / 6 muizen (12 maanden oud) via de staartader. De MWM-test werd gebruikt om het ruimtelijk geheugen en de cognitieve vaardigheden van de muizen te onderzoeken.gemicroniseerde gezuiverde flavonoïde fractie 1000 mg gebruiktGedurende 5 dagen herhaalde training nam de tijd die nar-behandelde ouder wordende muizen nodig hadden om het platform te vinden geleidelijk af in vergelijking met de controlegroep (figuur 4A). Uit de testresultaten bleek dat de tijd die nodig was om het platform voor het eerst te bereiken werd verminderd (figuur 4B), terwijl de tijd die in de platformzone werd doorgebracht, werd verhoogd (figuur 4C). Bovendien werden nar-behandelde verouderingsmuizen waargenomen binnen de platformzone met een hogere frequentie dan de controlegroep (figuur 4D). Samen suggereren deze resultaten dat Nar het ruimtelijk geheugen en de cognitieve vaardigheden bij ouder wordende muizen kan verbeteren.

RNA-sequencinganalyse van met Nar behandeld bloed van ouder wordende muizen

Om de Nar-specifieke anti-verouderingsmechanismen te onderzoeken, analyseerden we het genexpressieprofiel van Nar-behandeld bloed van ouder wordende muizen met behulp van RNA-sequencing (RNA-seq). De resultaten onthulden 1.961 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's). Over het algemeen downreguleerde Nar de genexpressie en slechts een klein aantal genen werd up-gereguleerd in vergelijking met de onbehandelde controlegroep (figuur 5A, 5B). Bovendien werden belangrijke signaalroutegenen gerelateerd aan veroudering gedownreguleerd, vooral die in de TNF-signaleringsroute (figuur 5C).oteflavonoïdeDeze resultaten impliceren dat Nar de TNF-signaleringsroute beïnvloedt, waardoor de functie van TNF-a, die betrokken is bij verouderingsgerelateerde cognitieve stoornissen, diepgaand wordt beïnvloed [29,30]. We onderzochten daarom TNF-α niveaus in het plasma van muizen. Resultaten van d immunosorbent assays (ELISA) enzym-gebonden

Figuur 4. Naringenine (Nar) verbetert het geheugen en het leervermogen bij ouder wordende muizen. A) De ontsnappingslatentie van met Nar behandelde ouder wordende muizen was korter in vergelijking met de controlegroep. (B) De tijd die nodig was om het platform voor het eerst te bereiken was korter bij met Nar behandelde ouder wordende muizen dan in de controlegroep. (C) Duur van de tijd doorgebracht in de platformzone. (D) Frequentie van waargenomen worden in de platformzone voor nar-behandelde verouderingsmuizen in vergelijking met de controlegroep. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ±SD van drie onafhankelijke experimenten.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.“n”="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche kan anti-aging

DISCUSSIE

Veroudering wordt geassocieerd met een verhoogd risico op cognitieve achteruitgang en een verlies van leer- en geheugenvermogen [22,23]. Neuronaal verlies en verminderde neurogenese zijn nauw verwant aan leeftijdsgebonden hersendisfunctie [11-13]. Het verhogen van het aantal neuronen en het verbeteren van neurogenese zijn dus cruciaal voor anti-aging behandeling. R. Meyer, een plant rijk aan flavonoïden en andere bioactieve stoffen [1, 3-6], heeft veel functies die nog niet zijn beschreven. In de huidige studie bevorderden R. Meyer-anthocyanen NSC-proliferatie en verhoogden ze de vorming van neurosferen met uniforme morfologie. R. Meyer anthocyanine behandeling verbeterde ook de cellulaire veroudering fenotype, met verminderde niveaus van ROS en veroudering-gerelateerde P16nk4 genexpressie, verhoogde DNA synthese fase, en verlengde telomeren.puriteinen vitamine cBovendien onthulden immunofluorescentiekleuringsresultaten dat R Meyer-anthocyanen de vorming van neuronen stimuleerden. Deze resultaten suggereren dat R. Meyer anthocyanen anti-aging effecten hebben op mNSC's, en kunnen ook direct de vorming van neuronen in vitro bevorderen. Bovendien is cognitieve achteruitgang nauw verbonden met veroudering [22, 23]. Onze MWM-resultaten toonden aan dat intragastrische toediening van R. Meyer-anthocyanen het ruimtelijk geheugen en leervermogen bij ouder wordende muizen verbeterde en ook verhoogde

Figuur 5. Tumor necrose factor (TNF)-a speelt een essentiële rol in naringenine (Nar)-gemedieerde anti-aging effecten. (A) Samenvatting van genexpressies in muizenbloed, zoals bepaald door RNA-seq. B) Heatmap met differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) in het bloed tussen controle- en Nar-behandelde muizen. DEG's werden geïdentificeerd door een vouwverandering van >2,0 of<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Het gebruik van metabolomische analyse om de specifieke samenstelling van R. Meyer-anthocyanen te onderzoeken, onthulde dat Nar een belangrijke flavonoïde metaboliet kan zijn. Van Nar is eerder gemeld dat het de senescentie van myocardiale cellen verbetert [31], de metabole capaciteit van het darmkanaal verbetert [32] en ontstekingsremmende [33] en antikanker [34] effecten uitoefent. De effecten van Nar op NSC's tijdens het ouder worden blijven echter onbekend. Om de anti-aging effecten van R. Meyer anthocyanen te onderzoeken, hebben we verdere studies uitgevoerd met Behulp van Nar. Behandeling met 6,8 ug /ml Nar verhoogde de levensvatbaarheid van de cel, verminderde P16ink4a-genexpressie, verlengde telomeren en bevorderde NSC-differentiatie in neuronen in vitro. Om de effecten van Nar op celproliferatie verder te beoordelen, voerden we immunofluorescentiestudies uit. De resultaten gaven aan dat nar-behandeling zowel het aantal Ki67-positieve cellen als het aandeel MAP2-positieve cellen verhoogde, wat suggereert dat Nar neurogenese kan bevorderen. Bovendien werden de effecten van Nar op leren en geheugen ook geëvalueerd bij ouder wordende muizen. De MWM-testresultaten toonden consequent aan dat Nar-behandeling ruimtelijke leaming bij ouder wordende muizen verbetert. Interessant is dat RNA-seq-analyse onthulde dat Nar de senescentie kan beïnvloeden via de TNF-signaleringsroute, vooral door TNF-a-expressie in het bloed van ouder wordende muizen te downreguleren. ELISA-testen gaven ook aan dat Nar-behandeling de plasma-TNF-a-niveaus verlaagde in vergelijking met controleverouderende muizen. TNF-a is een belangrijke factor in de TNF-signaleringsroute en is nauw verwant aan cognitieve veroudering. De functies omvatten de bevordering van pathologische veranderingen in hippocampus synapsen [29] en de remming van proliferatie van voorlopercellen [35]. Veranderde TNF-niveaus zijn geassocieerd met cognitieve stoornissen bij depressie, schizofrenie, bipolaire stoornis en de ziekte van Alzheimer [30,36,37]. Meer specifiek is TNF-a upregulated bij patiënten met de ziekte van Alzheimer [38].

Samenvattend toont onze studie aan dat R. Meyer-anthocyanen de effecten van veroudering in NSC's verbeteren via Nar, dat TNF-a-niveaus in vivo downreguleert en de cognitie bij ouder wordende muizen verbetert. Gezamenlijk bieden onze bevindingen een nieuwe strategie voor de ontwikkeling van klinische behandelingen, gericht op de grotere realisatie van de medicinale waarde van R.Meyer-anthocyanen.

MATERIALEN EN METHODEN

Proefdieren

Deze studie werd goedgekeurd door de Tongji University Animal Care Committee en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen. R. Meyer-anthocyanen werden intragastrisch toegediend gedurende 2 maanden tot 12 maanden oude muizen die op de C57BL / 6-achtergrond werden gehouden. Nar werd geïnjecteerd in de caudale ader gedurende 1 maand tot 12 maanden oude muizen op de C57BL / 6 achtergrond. Controlemuizen kregen hetzelfde volume fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).

Bereiding van R. Meyer anthocyanen en Nar

R. Meyer fruit(500 g)werd gehomogeniseerd met behulp van een weefselhomogenisator en gesuspendeerd in 1 L methanol met 0,1% hvdrochloorzuur. Ultrasone extractie werd drie keer uitgevoerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De extracten werden gecombineerd en de methanol werd onder verminderde druk geconcentreerd om extracten van R Meyer te verkrijgen. Het extract werd verder gezuiverd met AB-8 macroporeuze hars om het anthocyaninegehalte te verhogen.

Naringenin (C15H1205; MW:272,25; zuiverheid: ≥98%; HPLC-kwaliteit) werd gekocht van Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Sichuan, China) en opgeslagen bij 2 ° C-8 ° C in een droge omgeving zonder licht. De concentratie van de stamoplossing was 100 mM in dimethylsulfoxide (DMSO). De uiteindelijke DMSO-concentratie was niet hoger dan 0,1% in het kweekmedium.

Neurosfeer- en differentiatietests

NSC's werden afgeleid van de muis SVZ. Muizen werden geofferd na anesthesie en de SVZ werd zorgvuldig ontleed en gedissocieerd in enkele cellen met 0,4 U / ml papaïne (Imogen, Alexandria, VA, VS; Cat nr.: LS003126). NSC's werden verguld in 10 cm schotels met 10 ml NSC Basal Medium met 10 ng / ml EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, VS; Cat No: AF-100-15) en 10 ng / ml FGF (PeproTech, Cranbury, NJ, VS; Cat Nr:AF-100-18B). Neurosferen werden om de 5 dagen gepasseerd. NSC's uit vers gedissocieerde passage-2 neurosferen werden gezaaid op laminine (Gibco, Gaithersburg, MD, USA; Cat nr.:23017015)en poly-L-ornithinehydrobromide (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Verenigde Staten; Cat nr.: P3655)-gecoate glasplaten in NSCBasalMedium zonder differentiatiesupplementen. Gedifferentieerde cellen werden immunos gekleurd voor Tu1 (beta-tubuline II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten; Cat Nr:480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA5-12826), en glial fibrillary acidic protein (GFAP; Thermo Fisher Scientific, Cat Nr. PA5-16291), en vervolgens tegengekleurd met 4'6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; Thermo Fisher Scientific, Katten nr.: D1306). Dia's werden onderzocht met behulp van een Olympus BX53 microscoop (Olympus, Madison, WI, USA). Kwantificering van TuJ1- en MAP2-positieve cellen werd uitgevoerd door gelabelde cellen uit drie onafhankelijke experimenten te tellen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde t-test.

Dit artikel is afkomstig uit www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, No. 17